一種酶解法制備蜂王胚胎肽的方法
【專利摘要】本發(fā)明是一種酶解法制備蜂王胚胎肽的方法，包括：樣品預(yù)處理、蜂王幼蟲粉末脫脂、蜂王幼蟲粉樣品液配制、超聲波處理蜂王幼蟲粉樣品液、蜂王幼蟲粉樣品液酶解反應(yīng)、將酶解液置于沸水浴中加熱20分鐘滅酶，冷卻至常溫，將酶解液pH值調(diào)至7.0，離心后取上清液、干燥上述上清液獲得水解的蜂王胚胎肽粉。本發(fā)明制得的蜂王胚胎多肽能夠用于制作改善人體機(jī)能的保健品，且更重要的是從水解的蜂王胚胎多肽中篩選得到對人體真正有效的生物活性多肽。
【專利說明】一種酶解法制備蜂王胚胎肽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用酶解法制備蜂王胚胎肽的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蜂王幼蟲又稱蜂王胎或蜂皇胎，是蜜蜂受精卵經(jīng)工蜂別喂飼新鮮王漿而生長發(fā)育成幼蟲體，是從王臺里的王漿表面取出的幼蟲。蜂王幼蟲以蜂王漿為食，幼蟲本身有極豐富的營養(yǎng)，同時其體表也黏附著王漿。它是人工生產(chǎn)蜂王漿的副產(chǎn)品。蜂王幼蟲是一個活的動物體，不但含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，還含有豐富的酶類和生物活性物質(zhì)。蜂王幼蟲不僅蛋白質(zhì)含量高(占干物質(zhì)的50%以上)，而且18種氨基酸齊全，富含8種人體必需氨基酸。天門冬氨酸及谷氨酸的含量較高，這兩氨基酸對人體具有很好的健腦作用。此外，還含有牛黃酸。蜂王幼蟲中含有大量人體必需的常量和微量元素(毫克/ 100克干物):銅2.402，鉀1489.3，鈉 81.5，鋅 11.5，鎂 152.5，鋁 78.3，硒 18.1 (微克 / 100 克)，鈣 84.6，鐵 4.2，鑰0.26(納克/克)。蜂王幼蟲含有豐富的維生素，尤其是維生素A、大大超過牛肉或雞蛋，僅次于魚肝油；維生素D的含量也很豐富，Ig鮮幼蟲含6100~7340國際單位，而被人們認(rèn)為含維生素D極高的魚肝油每Ig僅含100~600國際單位。另外，蜂王幼蟲中還含有高活性和高生物效能的混合激素，其中保幼激素和蛻皮激素比較豐富。在營養(yǎng)豐富的同時，蜂王幼蟲中的膽固醇含量又比較低,研究表明蜂王幼蟲膽固醇含量小于IOmg / 100g，與牛肉，牛乳及雞蛋等食品相比其膽固醇含量極低，所以蜂王幼蟲是一種低膽固醇類食品資源，極具開發(fā)價值。特別值得注意是含有較多的稀有微量元素硒、鈷、鉻等。蜂王幼蟲中含有多種生物激素、酶類(超氧化物歧化酶5670微克/ 100克)等具有高度生物性的物質(zhì)。蜂王幼蟲是非常珍貴的天然產(chǎn)品，含有豐富的人體所需的蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、維生素、礦物元素等眾多營養(yǎng)成分，在補(bǔ)充營養(yǎng)，調(diào)節(jié)免疫上都有重要的作用。
[0003]蜂王幼蟲有抗疲勞作用。說明蜂王幼蟲能明顯提高小鼠的抗應(yīng)激能力，表現(xiàn)出明顯的抗疲勞作用。蜂王幼蟲是一種營養(yǎng)十分豐富的天然物質(zhì)，因而有促進(jìn)生長的作用。蜂王幼蟲能調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能，具有增強(qiáng)體力、安神鎮(zhèn)靜、振奮精神、改善睡眠、增強(qiáng)記憶能力的作用。適用于神疲健忘、失眠多夢、精神恍惚、心煩意亂等。蜂王幼蟲改善心血管的功能，具有增強(qiáng)心臟收縮力、平衡血壓、改善微循環(huán)、促進(jìn)組織代謝、增加白細(xì)胞的作用。適用于氣短心悸、氣血不通、面色萎黃、臉色蒼白、四肢無力。特別是具有護(hù)肝作用，能改善功能，恢復(fù)受損害的肝細(xì)胞。蜂王幼蟲對消化系統(tǒng)有很好的調(diào)節(jié)作用，能增加食欲，幫助消化，通利大便，對于噯酸腹脹，胃納差，便秘有很好的改善作用，對慢性淺表性胃炎有輔助療效。蜂王幼蟲對內(nèi)分泌系統(tǒng)有調(diào)節(jié)作用，能調(diào)整好月經(jīng)、改善更年期不適，增強(qiáng)男女性欲。對男性精子數(shù)少、活動力差、液化時間延長的病人有明顯改善作用。對于經(jīng)期不準(zhǔn)、量多、量少、更年期綜合癥、陽痿、早泄、女性排卵障礙、不孕不育等有輔助療效。實踐證明，蜂王幼蟲能美容養(yǎng)顏、壯精血、健脾胃、益心智，是理氣養(yǎng)血、補(bǔ)充營養(yǎng)最為理想的保健珍品，尤其適用于老人體弱、病后滋補(bǔ)、孕期調(diào)養(yǎng)和青少年發(fā)育遲緩。歸納起來，蜂王幼蟲的作用主要包括:1，健腦益智作用；2，增強(qiáng)機(jī)體免疫力；3，抗腫瘤作用；4抗氧化作用與美容養(yǎng)顏；5，改善消化系統(tǒng)。
[0004]現(xiàn)在蜂王漿的單群漿蜂年產(chǎn)量已突破10kg，我國蜂王漿的年產(chǎn)量超過3000噸，按照每生產(chǎn)Ikg蜂王衆(zhòng)，同時可生產(chǎn)蜂王幼蟲0.2kg-0.3kg計算,全國年產(chǎn)蜂王幼蟲可達(dá)600-900噸。然而，全國每年用于加工的蜂王幼蟲只有50噸左右，剩下的被養(yǎng)蜂人直接處理掉了，這樣的浪費太驚人了。
[0005]蜂王幼蟲作為一種營養(yǎng)價值極為豐富的食源性資源，在營養(yǎng)、保健、美容方面具有很好的研發(fā)意義，但由于長期以來科研條件、技術(shù)條件、經(jīng)濟(jì)發(fā)展限制，目前的開發(fā)利用還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，在科研投入方面力度也不夠大，蜂王幼蟲研究和產(chǎn)業(yè)開發(fā)尚未進(jìn)入實際性的階段。蜂王幼蟲的開發(fā)利用勢在必行。
[0006]生物活性肽是一類具有清除自由基、提高機(jī)體免疫能力、延緩衰老、降低血壓等特殊功能的功能因子。這些肽在原蛋白質(zhì)序列中并沒有活性，當(dāng)用體內(nèi)腸道酶或體外酶作用蛋白質(zhì)時，這些肽將從原來的序列中釋放出來，并表現(xiàn)出特殊的活性，如免疫肽、酪蛋白磷酸肽、抗菌肽以及降血壓肽等。
[0007]蜂王幼蟲的產(chǎn)品主要有以下幾種:凍干粉、蛋白提取物、新鮮幼蟲炮制溶液。凍干粉是一種最常見的蜂王幼蟲產(chǎn)品。有文獻(xiàn)報道，以蜂王幼蟲凍干粉為原料提取蜂王幼蟲各種類型的蛋白質(zhì)。目前，國內(nèi)外對于利用蜂王幼蟲這一來源廣泛、價格低廉的蛋白質(zhì)資源制備水解多肽的技術(shù)尚未見專利報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種使用蜂王幼蟲制備蜂王胚胎肽的方法。
[0009]本發(fā)明是一種酶解法制備蜂王胚胎肽的方法，包括:
[0010]步驟1:樣品預(yù)處理:將蜂王幼蟲在存活期內(nèi)-80°C迅速冷凍，并干燥，將干燥的蜂王幼蟲樣品研磨成粉；
[0011]步驟2:蜂王幼蟲粉末脫脂:將預(yù)處理過的蜂王幼蟲粉末樣品放入超臨界萃取裝置脫脂，脫脂條件:萃取壓力35MPa，萃取溫度35°C，萃取時間200分鐘，常壓分離，收集脫脂后的蜂王幼蟲蛋白用于進(jìn)行酶解；
[0012]步驟3:蜂王幼蟲粉樣品液配制:以上述脫脂后的蜂王幼蟲粉為原料，該原料中蛋白質(zhì)的含量為在70%以上，將該蜂王幼蟲粉原料按照料液比1: 10(w / v)加入去離子水50°C攪拌混勻4小時，獲得蜂王幼蟲粉樣品液；
[0013]步驟4:超聲波處理蜂王幼蟲粉樣品液:使用功率250W~1250W的脈沖超聲波進(jìn)行對蜂王幼蟲粉樣品液預(yù)處理，超聲波處理時間30分鐘,對應(yīng)一個脈沖的超聲波發(fā)出時間2~4秒、間隙時間2秒；
[0014]步驟5:蜂王幼蟲粉樣品液酶解反應(yīng):將超聲波處理后的脫脂蜂王幼蟲粉樣品液pH調(diào)至7.5~8.5，在恒溫水浴中加熱至40°C~60°C，按照酶與脫脂蜂王幼蟲粉樣品液質(zhì)量比例0.02~0.04: I加入復(fù)合蛋白酶，所述復(fù)合蛋白酶由中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶按照質(zhì)量比例1:1組成，水解度達(dá)到20%時停止反應(yīng)；
[0015]步驟6:將酶解液置于沸水浴中加熱20分鐘滅酶，冷卻至常溫，將酶解液pH值調(diào)至7.0，離心后取上清液；
[0016]步驟7:干燥上述上清液獲得水解的蜂王胚胎肽粉。[0017]所述蜂王幼蟲為2~3日齡的蜂王幼蟲。
[0018]本發(fā)明是一種用于測定酶解法制備的蜂王胚胎肽中多肽含量測定方法，利用10%三氯乙酸(TCA)沉淀水解液中大分子蛋白，經(jīng)過離心過濾后，在上清液中加入雙縮脲試劑，于540nm測定其OD值，繼而配制Gly-Gly-Tyr-Arg四肽標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定標(biāo)準(zhǔn)肽數(shù)據(jù)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，在曲線上查找樣品中的多肽含量。
[0019]一種檢測水解蜂王胚胎肽的抗氧化活性的方法包括自由基清除能力測定、超氧陰離子自由基清除能力測定和脂質(zhì)體過氧化抑制能力測定。
[0020]所述自由基清除能力測定為測定水解蜂王胚胎肽酶解物樣品溶液對DPPH自由基的清除除力。
[0021]所述超氧陰離子自由基清除能力測定采用核黃素-光-氮藍(lán)四唑體系測定。 [0022]所述脂質(zhì)體過氧化抑制能力測定方法是，在IOm試管中加入0.2ml脂質(zhì)體溶液，不同體積的樣品和50mmol / L FeSO4溶液50ul，再加入磷酸鹽緩沖溶液至3mL不加樣品的反應(yīng)物管作為模型，不加FeSO4溶液的試管作為空白，將反應(yīng)物置于37°C水浴40分鐘，最后加入10%三氯乙酸Iml，0.8%硫代巴比妥酸(TBA) Iml，混合均勻，置于沸水中15分鐘，冰水冷卻,在8000r / min下離心10分鐘,取上清液在532nm處測定吸光度(A),按照以下計算公式計算脂質(zhì)過氧化的抑制率:脂質(zhì)過氧化的抑制率(％) = (A模型一 A樣品)/ (A模型一 A空白)X100%o
[0023]本發(fā)明的有益技術(shù)效果在于:
[0024]1.本發(fā)明利用復(fù)合蛋白酶(Protamex)(中性蛋白酶:風(fēng)味蛋白酶=1:1)來水解蜂王胚胎幼蟲。中性蛋白酶作為一種內(nèi)切蛋白酶，具有純天然、安全無毒、水解能力強(qiáng)、作用范圍廣等；風(fēng)味蛋白酶天然安全，可應(yīng)用于各種動植物蛋白的水解，后期風(fēng)味優(yōu)化，去除苦味，改善口感，可以制取風(fēng)味良好的動植物水解產(chǎn)品，提高產(chǎn)品質(zhì)量，降低成本。在食品加工過程中添加合適的風(fēng)味蛋白酶，使風(fēng)味前體物水解，從而釋放出風(fēng)味物質(zhì)，增強(qiáng)和改善食品的風(fēng)味。該復(fù)合蛋白酶酶解既保證了蜂王胚胎幼蟲可充分的水解，又能使得水解產(chǎn)物有適于食用的風(fēng)味，而且保證天然、安全、無毒。
[0025]2.本發(fā)明利用生物酶解技術(shù)是利用不同蛋白酶的生物催化分解作用把大分子的蛋白質(zhì)分子在一定程度上分解成膚類小分子物質(zhì)，這樣可以使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)更利于人體消化吸收，也可能提高其生物活性。用酶解液可進(jìn)行生物活性研究或多肚分離純化等研究，為進(jìn)一步提高產(chǎn)品利用價值奠定基礎(chǔ)。
[0026]3.本發(fā)明制備得到的蜂王胚胎肽粉游離氨基酸明顯升高，特別是必需氨基酸的提高比例更大，必需氨基酸是人類自身不能合成的氨基酸，必需依靠從食物中獲取，這樣看來，本發(fā)明獲得容易被吸收、抗氧化效果好的小分子蜂王胚胎多肽，大大提高了蜂王胚胎的
營養(yǎng)價值。
[0027]4.本發(fā)明將超聲波技術(shù)應(yīng)用于蛋白酶解制備蜂王胚胎多肽，能夠明顯縮短脫脂蜂王胚胎幼蟲蛋白酶解時間，使得有效小分子多肽得到充分的分解出來。
[0028]5.本發(fā)明是一種生物酶法，易通過對酶解過程的監(jiān)控，使蜂王胚胎中小分子多肽有效的地釋放出來，提高原料的利用率，提高了其保健醫(yī)療價值；
[0029]6.本發(fā)明所采用的原料來源廣泛，價格低廉，經(jīng)過本發(fā)明的技術(shù)轉(zhuǎn)化可大大提高蜂王胚胎幼蟲的附加值?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0030]圖1:蜂王幼蟲粉末脫脂用的超臨界萃取裝置。
[0031]1，鋼瓶2，過濾器3，壓縮機(jī)4，緩沖罐5，壓力調(diào)節(jié)閥6，預(yù)熱器
[0032]7，單向閥8，萃取釜9，減壓閥10，采樣瓶11，累加流量計
[0033]圖2:Gly-Gly-Tyr-Arg 四肽標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0034]圖3:蜂王胚胎肽對DPPH自由基清除能力和對照組BHT的對比。
[0035]圖4:蜂王胚胎肽對超氧陰離子自由基(O2.)清除能力和對照組BHT的對比。
[0036]圖5:脂質(zhì)體過氧化抑制能力測定。
[0037]圖6:不同蛋白酶水解蜂王胚胎蛋白對多肽得率的影響。
【具體實施方式】
[0038]下面結(jié)合附圖和實施例，對本發(fā)明的【具體實施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0039]步驟1:樣品預(yù)處理:采集2~3日齡的蜂王幼蟲(蜂王胚胎，2~3日齡的蜂王幼蟲未生長和呼吸率很相近，以后隨著喂養(yǎng)條件變化他們開始向蜂王工蜂分化，這是選擇2~3日蜂王幼蟲的根據(jù))適量，在蜂王幼蟲存活期內(nèi)-80°C迅速冷凍，用冷凍干燥機(jī)冷凍干燥，將干燥的蜂王幼蟲樣品研磨成粉。`
[0040]步驟2:蜂王幼蟲粉末脫脂:將預(yù)處理過的蜂王幼蟲粉末樣品放入如圖1所示的超臨界萃取裝置脫脂，將蜂王幼蟲粉裝入萃取釜中，打開鋼瓶，鋼瓶I中的CO2經(jīng)過濾器2過濾后進(jìn)入到壓縮機(jī)3 (隔膜式)，在壓力達(dá)到所需壓力后送至緩沖罐4，經(jīng)過壓力調(diào)節(jié)閥5由緩沖罐進(jìn)入預(yù)熱器6，將CO2加熱至所需溫度，然后進(jìn)入到萃取釜8中進(jìn)行油脂的萃取。脫脂條件:萃取壓力35MPa，萃取溫度35°C，萃取時間200分鐘，常壓分離。收集脫脂后的蜂王幼蟲蛋白用用于進(jìn)行酶解。
[0041]步驟3:蜂王幼蟲粉樣品液配制:以上述脫脂后的蜂王幼蟲粉為原料，該原料中蛋白質(zhì)的含量為在70%以上，將該蜂王幼蟲粉原料按照料液比1: 10(w / V)加入去離子水50°C攪拌混勻4小時，獲得蜂王幼蟲粉樣品液；
[0042]步驟4:超聲波處理蜂王幼蟲粉樣品液:使用功率250W~1250W的脈沖超聲波進(jìn)行對蜂王幼蟲粉樣品液預(yù)處理，超聲波處理時間30分鐘,對應(yīng)一個脈沖的超聲波發(fā)出時間2~4s、間隙時間2s ；
[0043]步驟5:蜂王幼蟲粉樣品液酶解反應(yīng):將超聲波處理后的脫脂蜂王幼蟲粉樣品液pH調(diào)至7.5~8.5，在恒溫水浴中加熱至40°C~60°C，按照酶與脫脂蜂王幼蟲粉樣品液質(zhì)量比例0.02~0.04: I加入復(fù)合蛋白酶，所述復(fù)合蛋白酶由中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶按照質(zhì)量比例1:1組成，水解度達(dá)到20%時停止反應(yīng)；
[0044]步驟5中，酶解過程水解度的測定采用pH-stat法:
[0045]水解度的計算公式如下:
[0046]冊(％)=上X:_

hot[0047]公式中，
[0048]h:為單位質(zhì)量蛋白中被裂解的肽鍵數(shù)(mmol / g)；
[0049]htot:為單位質(zhì)量原料蛋白中肽鍵的總數(shù)(mmol / g)；
【權(quán)利要求】
1.一種酶解法制備蜂王胚胎肽的方法，其特征在于，包括: 步驟1:樣品預(yù)處理:將蜂王幼蟲在存活期內(nèi)-80°C迅速冷凍，并干燥，將干燥的蜂王幼蟲樣品研磨成粉； 步驟2:蜂王幼蟲粉末脫脂:將預(yù)處理過的蜂王幼蟲粉末樣品放入超臨界萃取裝置脫月旨，脫脂條件:萃取壓力35MPa，萃取溫度35°C，萃取時間200分鐘，常壓分離，收集脫脂后的蜂王幼蟲蛋白用于進(jìn)行酶解； 步驟3:蜂王幼蟲粉樣品液配制:以上述脫脂后的蜂王幼蟲粉為原料，該原料中蛋白質(zhì)的含量為在70%以上，將該蜂王幼蟲粉原料按照料液比1: 10(w / V)加入去離子水50°C攪拌混勻4小時，獲得蜂王幼蟲粉樣品液； 步驟4:超聲波處理蜂王幼蟲粉樣品液:使用功率250W~1250W的脈沖超聲波進(jìn)行對蜂王幼蟲粉樣品液預(yù)處理，超聲波處理時間30分鐘,對應(yīng)一個脈沖的超聲波發(fā)出時間2~4s、間隙時間2s ； 步驟5:蜂王幼蟲粉樣品液酶解反應(yīng):將超聲波處理后的脫脂蜂王幼蟲粉樣品液pH調(diào)至7.5~8.5，在恒溫水浴中加熱至40°C~60°C，按照酶與脫脂蜂王幼蟲粉樣品液質(zhì)量比例0.02~0.04: I加入復(fù)合蛋白酶，所述復(fù)合蛋白酶由中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶按照質(zhì)量比例1:1組成，水解度達(dá)到20%時停止反應(yīng)； 步驟6:將酶解液置于沸水浴中加熱20分鐘滅酶，冷卻至常溫，將酶解液pH值調(diào)至7.0，離心后取上清液； 步驟7:干燥上述上清液獲得水解的蜂王胚胎肽粉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶解法制備蜂王胚胎肽的方法，其特征在于，所述蜂王幼蟲為2~3日齡的蜂王幼蟲。
3.一種用于測定權(quán)利要求1酶解法制備的蜂王胚胎肽中多肽含量測定方法，其特征在于，利用10%三氯乙酸(TCA)沉淀水解液中大分子蛋白，經(jīng)過離心過濾后，在上清液中加入雙縮脲試劑,于540nm測定其OD值,繼而配制Gly-Gly-Tyr-Arg四肽標(biāo)準(zhǔn)溶液,測定標(biāo)準(zhǔn)肽數(shù)據(jù)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，在曲線上查找樣品中的多肽含量。
4.一種檢測水解蜂王胚胎肽的抗氧化活性的方法，其特征在于，包括自由基清除能力測定、超氧陰離子自由基清除能力測定和脂質(zhì)體過氧化抑制能力測定。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種檢測水解蜂王胚胎肽的抗氧化活性的方法，其特征在于，所述自由基清除能力測定為測定水解蜂王胚胎肽酶解物樣品溶液對DPPH自由基的清除除力。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種檢測水解蜂王胚胎肽的抗氧化活性的方法，其特征在于，所述超氧陰離子自由基清除能力測定采用核黃素-光-氮藍(lán)四唑體系測定。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種檢測水解蜂王胚胎肽的抗氧化活性的方法，其特征在于，所述脂質(zhì)體過氧化抑制能力測定方法是，在IOm試管中加入0.2ml脂質(zhì)體溶液，不同體積的樣品和50mmol / L FeS04溶液50ul，再加入磷酸鹽緩沖溶液至3mL不加樣品的反應(yīng)物管作為模型，不加FeS04溶液的試管作為空白，將反應(yīng)物置于37°C水浴40分鐘，最后加入10 %三氯乙酸Iml，0.8 %硫代巴比妥酸(TBA) Iml，混合均勻，置于沸水中15分鐘，冰水冷卻,在8000r / min下離心10分鐘,取上清液在532nm處測定吸光度(A),按照以下計算公式計算脂質(zhì)過氧化的抑制率:脂質(zhì)過氧化的抑制率(％) = (A模型一 A樣品)/ (A模型一 A空白）X100%
【文檔編號】G01N21/31GK103725742SQ201310743207
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月31日
【發(fā)明者】趙樹民, 石松傳, 鮑勇剛 申請人:趙樹民, 于利