能結(jié)合流感血細(xì)胞凝集素蛋白的合成肽的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供能與流感血細(xì)胞凝集素（HA)蛋白結(jié)合及阻斷pH-誘導(dǎo)的形狀變化或流感血細(xì)胞凝集素（HA)蛋白的聚集的肽。本發(fā)明也提供流感血細(xì)胞凝集素蛋白中的可成藥位點(diǎn)，所述可成藥位點(diǎn)包含含有保守殘基的肽序列。
【專利說(shuō)明】能結(jié)合流感血細(xì)胞凝集素蛋白的合成肽 【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0001] 本發(fā)明涉及合成肽能結(jié)合流感血細(xì)胞凝集素（HA)蛋白及阻斷pH-誘導(dǎo)的形狀變 化/血細(xì)胞凝集素（HA)蛋白的聚集。本發(fā)明也涉及具有用于鑒定新可成藥位點(diǎn)的全糖基 化的流感血細(xì)胞凝集素三聚體的溶液結(jié)構(gòu)模型。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 流感，古老的世界性病毒，其導(dǎo)致無(wú)法預(yù)測(cè)的周期性大流行病和季節(jié)性的暴發(fā)，及 給公共健康造成嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。隨時(shí)間增加，流感病毒的地理傳播增加。最重要的是，此病毒 的物種間感染能力導(dǎo)致由隨機(jī)基因排布出現(xiàn)更新株（1)。此特有的特征將其分類為最致死 的病毒之一。在針對(duì)流感株的一般的廣譜治療缺失下，形成了不同方法，包括使用病毒組分 作為疫苗（能逃脫此病毒的必要的通路的分子，除基于唾液酸部分的小分子篩選之外）而 發(fā)揮受體模擬物的作用。有趣的是，盡管流感已知經(jīng)基因再排布而進(jìn)化，以避開(kāi)免疫系統(tǒng)和 對(duì)其表面組分的藥物反應(yīng)性，但此古老的世界性病毒的宿主細(xì)胞進(jìn)入流程保持未變（2)。流 感感染，內(nèi)體進(jìn)入，與宿主膜融合，為復(fù)制而宿主遺傳物質(zhì)整合與及為進(jìn)一步感染的原病毒 粒子的包裝中不同事件的中樞點(diǎn)是低pH誘導(dǎo)的HA三聚體的打開(kāi)。HA，病毒表面上的包膜 蛋白，聚合為三聚體，其在感覺(jué)低pH后打開(kāi)，病毒進(jìn)入的必要的事件（3)。HA的功能關(guān)聯(lián)使 其成為相比其他表面表達(dá)的病毒分子更佳的治療靶。但由于性質(zhì)上可變，針對(duì)HA開(kāi)發(fā)的分 子和/或抗體呈現(xiàn)株依賴性（4)。
[0003] 重要的是，HA可利用的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)仍缺乏與此分子結(jié)合的碳水化合物/糖部分的信 息（2)。用完整病毒的電子顯微細(xì)節(jié)提示HA占總病毒表面的25?35%。HA糖蛋白作為近 似長(zhǎng)度137A的穗存在（5)。功能性地，HA屬于I類融合蛋白和I型TM類。I類融合蛋白 定義為蛋白中由構(gòu)象變化介導(dǎo)的融合，和I型TM類表示蛋白的受體結(jié)合以及融合能力（6)。 起初，HA表達(dá)為無(wú)活性前體分子，HA0,其然后由宿主酶轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘?，融合傾向于pH敏 感的分子（7)。有趣地，自然界在HA中編碼了雙活性，基于pH感知的活化及結(jié)合受體，及以 在將其遺傳物質(zhì)釋放進(jìn)宿主細(xì)胞之前克服2個(gè)障礙（8)。在遇到低pH后，HA分子的內(nèi)部部 分經(jīng)歷環(huán)至螺旋轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致融合肽為有效病毒融合而向靶膜脫位100A(3)。不考慮HA是 糖基化的實(shí)體和對(duì)于病毒進(jìn)入關(guān)鍵，無(wú)結(jié)構(gòu)研究提供生理學(xué)關(guān)聯(lián)糖基化的形式的信息。與 糖基化的HA相關(guān)的結(jié)構(gòu)信息的缺乏限制可經(jīng)HA分子靶向流感病毒的抗-流感藥物/分子 的開(kāi)發(fā)。
[0004] 在當(dāng)前情景中，針對(duì)FDA批準(zhǔn)的藥物的藥物抗性株的進(jìn)化是令人擔(dān)憂的（9, 10)。 為了克服株依賴性的屏障和病毒進(jìn)化的快步幅，有開(kāi)發(fā)更新靶位點(diǎn)和藥物分子的需求。關(guān) 于HA的抗-流感藥物開(kāi)發(fā)的狀態(tài)具有缺陷，如使用分子單體作為模板，使用非-糖基化的 晶體結(jié)構(gòu)作為藥物設(shè)計(jì)/篩選的起點(diǎn)，和株依賴性（4)。為了克服這些障礙，需在糖基化的HA分子中鑒定新靶位點(diǎn)?？?流感治療領(lǐng)域中的細(xì)節(jié)明顯提示對(duì)糖基化的HA分子中靶位 點(diǎn)的鑒定及能阻斷負(fù)責(zé)病毒-宿主膜融合的形狀變化的小分子的需求。公開(kāi)的本發(fā)明提供 實(shí)現(xiàn)這些需求的方式。
[0005]【發(fā)明目的】
[0006] 本發(fā)明的主要目的是提供能與流感血細(xì)胞凝集素（HA)蛋白結(jié)合及阻斷pH-誘導(dǎo) 的形狀變化或流感血細(xì)胞凝集素（HA)蛋白的聚集的肽。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是提供具有用于鑒定新可成藥位點(diǎn)的全糖基化的流感血細(xì)胞 凝集素三聚體的溶液結(jié)構(gòu)模型及設(shè)計(jì)對(duì)此藥物位點(diǎn)反應(yīng)性的肽。
[0008]【發(fā)明概述】
[0009] 本發(fā)明提供能與流感血細(xì)胞凝集素（HA)蛋白結(jié)合及阻斷pH-誘導(dǎo)的形狀變化或 流感血細(xì)胞凝集素（HA)蛋白的聚集的肽。本發(fā)明的肽以獨(dú)立于株的方式發(fā)揮作用。本發(fā) 明也提供流感血細(xì)胞凝集素蛋白中的可成藥位點(diǎn)，所述可成藥位點(diǎn)包含由SEQIDN0:21? 25表不的膚序列。
[0010] 【圖表說(shuō)明】
[0011] 圖1表示隨緩沖劑pH降低而HA三聚體粒徑增加的基于SAXS的跟蹤。在宿主膜 缺失下，在低pH，HA蛋白的成融設(shè)備被暴露，導(dǎo)致高分子量的寡聚體的形成（其通過(guò)使用SAXS跟蹤）。隨緩沖劑pH降低而H1N1HA三聚體尺度增加。通過(guò)分析溶液X-射線散射數(shù) 據(jù)來(lái)進(jìn)行解析。重要的是，此圖提供HA蛋白是三聚體及遵從導(dǎo)致此蛋白在低pH條件聚集 的pH誘導(dǎo)的形狀變化的明確的證據(jù)。對(duì)來(lái)自其他流感株的HA蛋白以實(shí)驗(yàn)方式觀察類似特 征：H5N1，H9N2，H3N2 和H14N5。在這些中，H1N1，H5N1 和H9N2 代表組 1，然而H3N2 和H14N5 分進(jìn)流感株的組2。
[0012] 圖2表示包括對(duì)保守的可成藥位點(diǎn)反應(yīng)性的肽的任何分子會(huì)干擾HA蛋白的天然 如行為和會(huì)阻斷pH誘導(dǎo)的病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的工作假說(shuō)。此示意性模式圖表示隨低pH而HA三聚體中發(fā)生的結(jié)構(gòu)變化（上方案）?；谝阎赖奈墨I(xiàn)，可總結(jié)，流感的包膜蛋白HA三聚體以可反轉(zhuǎn)的方式經(jīng)歷動(dòng)態(tài)打開(kāi)及關(guān)閉，直到當(dāng)平衡移向打開(kāi)結(jié)構(gòu)（其允許HA蛋白的 疏水段表露）時(shí)其遇到低pH。在緩沖劑中缺失任何去污劑情況下，疏水部分如在小圖A中 所見(jiàn)聚集。下圖表示我們的工作假說(shuō)，當(dāng)小分子（表示為黑色三角形）對(duì)HA蛋白的動(dòng)態(tài)打 開(kāi)及關(guān)閉關(guān)鍵的表位是反應(yīng)性時(shí)，會(huì)干擾HA三聚體的pH誘導(dǎo)的打開(kāi)（再下方案）。
[0013] 圖3表示使用基于SAXS數(shù)據(jù)的模型鑒定蛋白中糖基化占據(jù)的體積。左圖表示未 糖基化的模型的基于慣性軸的結(jié)構(gòu)疊加，然而右圖用基于SAXS的虛殘基模型顯示HA的糖 基化的模型。在這里SAXS包膜以黑色菱形顯示，HA的基于同源性的模型以淺灰色表面表 示顯示，和糖基部分以深灰色cpk表示顯示。用基于SAXS的虛殘基模型的HA三聚體的未 糖基化的（左）及糖基化的（右）模型的基于慣性軸的結(jié)構(gòu)疊加。左側(cè)顯示的圓形區(qū)域顯 示未占據(jù)的目標(biāo)體積，然而右側(cè)顯示SAXS形狀之內(nèi)糖基部分的存在。
[0014] 圖4顯示在本發(fā)明中系統(tǒng)性鑒定的藥物位點(diǎn)的視圖。左圖顯示可成藥袋的前視圖 (白框顯示HA三聚體中鑒定的袋），然而右圖顯示HA三聚體的俯視圖，箭標(biāo)指示袋打開(kāi)。左 圖顯示HA三聚體的糖基化的形式的建模，其最佳-擬合基于SAXS-數(shù)據(jù)的以實(shí)驗(yàn)方式測(cè)量 的形狀和體積特征。中圖顯示自生物信息學(xué)，分子建模及正常模式分析流程鑒定的位點(diǎn)的 俯視圖。此位點(diǎn)由保守殘基組成，及在HA三聚體的動(dòng)態(tài)打開(kāi)及關(guān)閉中起到整體作用。放大 視圖（右圖）顯示可成藥位點(diǎn)，其中為清晰，已去除第3鏈。得視圖顯示可成藥位點(diǎn)如何存 在于HA三聚體的3側(cè)。表1具有組成可成藥位點(diǎn)的鏈間段的序列。
[0015]圖5表示隨緩沖劑pH而散射粒子的L值（與肽溫育的HA分子結(jié)合的指標(biāo)）的變 異。圖顯示HA單獨(dú)及在抑制性肽存在下pH依賴性結(jié)合。左上部小圖顯示H1N1-HA的在不 同pH值的長(zhǎng)度變化。此圖中的其他圖使用SAXS顯示不同肽在溶液條件下，阻斷HA三聚體 的pH依賴性打開(kāi)的比較性能力。
[0016] 表1總結(jié)組成流感血細(xì)胞凝集素蛋白中的藥物位點(diǎn)的鏈間段的序列。上標(biāo)提及自 一級(jí)結(jié)構(gòu)的殘基數(shù)。
[0017] 表2總結(jié)由發(fā)明人合成及用于體外篩選能阻斷來(lái)自不同流感株的HA三聚體的pH-誘導(dǎo)的打開(kāi)的肽的不同肽序列。阻斷pH-誘導(dǎo)的變化的能力通過(guò)估計(jì)溶液中粒徑尺度 (相對(duì)于缺少任何肽的樣品）定性地標(biāo)位。發(fā)明人鑒定了PF11，PF12,PF13,PF31，PF32，PF41，PF42和LPF54表示的8種優(yōu)選的肽，其顯示阻斷來(lái)自5種不同病毒株H1N1，H5N1，H9N2,H3N2和H14N5的HA蛋白的pH引發(fā)的形狀變化的能力。符號(hào)+，++，+++及-分別表 示低活性（即，在基于SAXS的長(zhǎng)度中0?33%增量），中等活性（在基于SAXS的長(zhǎng)度中 33?66 %增量），良好活性（在基于SAXS的長(zhǎng)度中66?100 %增量）和無(wú)活性肽。
[0018]【發(fā)明詳述】
[0019] 如本文所用，"SAXS"指稱用來(lái)研究分子的初級(jí)溶液結(jié)構(gòu)的小角X-射線散射方法。
[0020] 如本文所用，"散射形狀"指稱導(dǎo)致特定散射特征的分子的形狀。
[0021] 如本文所用，"可成藥位點(diǎn)"指稱在與藥物分子反應(yīng)之后會(huì)停止病毒進(jìn)入和增殖的 表面。
[0022] 如本文所用，"生理學(xué)關(guān)聯(lián)"指稱最佳或緊密表示生理?xiàng)l件的狀態(tài)。
[0023] 如本文所用，"聚集物或結(jié)合物"指稱在低pH條件下，在HA蛋白中發(fā)生的多聚體結(jié) 合。
[0024] 如本文所用，"有效量"指稱實(shí)施或足以達(dá)到期望的生物學(xué)活性的肽量。本領(lǐng)域技 術(shù)人員會(huì)能通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定有效量。
[0025] 如本文所用，"載體"指稱發(fā)揮能攜帶外源基因進(jìn)入宿主細(xì)胞的媒質(zhì)的作用的DNA分子。優(yōu)選地，載體應(yīng)能復(fù)制，具有將本身導(dǎo)入宿主細(xì)胞的系統(tǒng)和應(yīng)具有可選擇的標(biāo)志物。 而且，優(yōu)選，載體應(yīng)能表達(dá)DNA分子及編碼肽序列。
[0026] 如本文所用，"藥學(xué)可接受的"指稱物質(zhì)諸如載體或添加劑，其不消除組合物或疫 苗的任何組分的生物學(xué)活性或性質(zhì)。
[0027] 如本文所用，"載體"指稱輔助化合物進(jìn)入細(xì)胞或組織的相對(duì)非-毒性化合物或劑。
[0028] 流感由于暴發(fā)規(guī)模，時(shí)機(jī)及引發(fā)由于當(dāng)病毒存在于不同物種中時(shí)發(fā)生的基因排布 而仍無(wú)法預(yù)測(cè)的病原性病毒的亞-株而仍是生物醫(yī)學(xué)挑戰(zhàn)。本發(fā)明旨在開(kāi)發(fā)以株獨(dú)立方式 具有抗-流感效力的小肽/模擬物。
[0029] 因此，本發(fā)明提供能結(jié)合流感血細(xì)胞凝集素三聚體蛋白及阻斷其低pH誘導(dǎo)的形 狀變化或聚集的肽。如設(shè)計(jì)的及篩選的，這些肽通過(guò)結(jié)合病原性流感的HA三聚體中保守的 表位和阻斷它們的低pH感覺(jué)的打開(kāi)和進(jìn)入宿主細(xì)胞（為復(fù)制）來(lái)發(fā)揮作用。這些肽和它 們的類似物或變體以株獨(dú)立方式阻斷HA三聚體的低pH誘導(dǎo)的打開(kāi)（其對(duì)于HA蛋白在宿 主細(xì)胞內(nèi)體中與其受體融合必要）。
[0030] 在此方向上，發(fā)明人制備了HA三聚體的生理學(xué)關(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)。盡管此蛋白是糖蛋白， 其結(jié)構(gòu)僅已在去糖基化的形式中解析，和晶體結(jié)構(gòu)不輔助認(rèn)識(shí)HA蛋白的動(dòng)態(tài)性質(zhì)。如此， 發(fā)明人對(duì)來(lái)自不同流感株的HA三聚體蛋白獲取了溶液SAXS數(shù)據(jù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)同意， 使用各種流感株實(shí)施此研究是可能的。為當(dāng)前研究，發(fā)明人鑒定及使用了 5種不同流感株， 即H1N1，H5N1，H9N2,H3N2和H14N5及構(gòu)建了它們的散射形狀。在這些形狀約束之內(nèi)，發(fā)明 人使用基于相似性的方法對(duì)殘基-水平結(jié)構(gòu)建模，及設(shè)糖基化部分，散射數(shù)據(jù)及知道的質(zhì) 量值為參照。而且，pH變化顯示三聚體蛋白的聚集，其指示，這些蛋白在自病毒表面切除后 是正確地折疊的。通過(guò)分析此結(jié)構(gòu)的形狀特征之內(nèi)的病原性流感數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)明人鑒定了由 鏈間接觸形成的及由缺少向糖基化的傾向的保守殘基組成的區(qū)域。由發(fā)明人鑒定的區(qū)域包 含在不同流感株之中保守的小肽序列。由此，區(qū)域能用作可成藥位點(diǎn)。
[0031] 因此，本發(fā)明提供包含由SEQIDN0:21?25表示的肽序列的可成藥位點(diǎn)。表1 提供可成藥位點(diǎn)的鏈間段的序列。
[0032] 表 1 rnnqql
【權(quán)利要求】
1. 能與由SEQIDN0:21?25表示的流感血細(xì)胞凝集素（HA)蛋白的肽序列結(jié)合的肽， 其中所述肽能阻斷pH-誘導(dǎo)的形狀變化或流感血細(xì)胞凝集素（HA)蛋白的聚集。
2. 權(quán)利要求1的肽，其中所述肽阻斷流感血細(xì)胞凝集素（HA)三聚體蛋白的低pH-誘導(dǎo) 的打開(kāi)。
3. 權(quán)利要求1的肽，其中所述肽以獨(dú)立于株的方式發(fā)揮作用。
4. 權(quán)利要求1的肽，其中所述肽是合成肽及選自SEQIDNO: 1?8,且其中所述肽也包 括其類似物和變體。
5. 組合物，其包含權(quán)利要求1的肽，及藥學(xué)可接受的添加劑和載體。
6. 流感疫苗，其包含權(quán)利要求1的肽作為活性成分。
7. 抗體，其識(shí)別由SEQIDNO:21?25表示的肽序列之任一個(gè)。
8. 試劑盒，其包含用于治療由流感病毒導(dǎo)致的疾病的權(quán)利要求1的肽，及使用說(shuō)明手 冊(cè)，及任選地添加劑和載體。
9. 治療由流感病毒導(dǎo)致的疾病的方法，所述方法包括給有需求的受試者施用有效量的 權(quán)利要求1的肽或包含所述肽的組合物或綴合物。
10. 權(quán)利要求9的方法，其中所述肽通過(guò)使用可生物降解的納米粒子遞送。
11. 權(quán)利要求9的方法，其中所述肽由下列途徑施用：靜脈內(nèi)，肌內(nèi)，脊柱，硬膜上，經(jīng) 皮，皮下，腸胃外，鼻內(nèi)粘膜，口腔或直腸途徑。
12. 權(quán)利要求9的方法，其中所述肽在治療選自下列的生物中有效：人，圈養(yǎng)動(dòng)物，鳥(niǎo)和 家禽。
13. 權(quán)利要求8的方法，其中所述肽單獨(dú)或組合使用。
14. 能與由SEQIDN0:21?25表示的流感血細(xì)胞凝集素（HA)蛋白的肽序列結(jié)合的肽 用于治療由流感病毒導(dǎo)致的疾病的用途。
15. 核苷酸序列，其編碼權(quán)利要求1的肽的氨基酸序列。
16. 載體，其包含編碼權(quán)利要求1的肽的核苷酸序列。
17. 流感血細(xì)胞凝集素蛋白中的可成藥位點(diǎn)，所述可成藥位點(diǎn)包含由SEQIDN0:21? 25表不的膚序列。
18. 權(quán)利要求17的可成藥位點(diǎn)，其中可成藥位點(diǎn)對(duì)于篩選抗流感/流感藥物有用。
19. 流感血細(xì)胞凝集素（HA)蛋白作為藥物靶位點(diǎn)的用途，其中所述流感血細(xì)胞凝集素 蛋白包含由SEQIDNO:21?25表示的肽序列。
20. 流感血細(xì)胞凝集素（HA)蛋白用于篩選潛在抗-流感藥物的用途，其中所述流感血 細(xì)胞凝集素蛋白包含由SEQIDNO:21?25表示的肽序列。
21. 制備權(quán)利要求1的肽的方法，其包括下列步驟： (a) 使血細(xì)胞凝集素蛋白經(jīng)歷SAXS分析， (b) 使用步驟（a)中獲得的散射數(shù)據(jù)產(chǎn)生基于溶液散射的虛殘基模型， (c) 比較步驟（b)中獲得的基于溶液的模型與為用于散射分析的蛋白產(chǎn)生的基于同源 性的模型，以鑒定百分率糖基化， (d) 向血細(xì)胞凝集素的結(jié)構(gòu)覆蓋溶液模型和自步驟（c)獲得的百分率糖基化，以鑒定 糖基化位點(diǎn)， (e) 自步驟（d)獲得糖基化位置，其中對(duì)基于同源性的模型實(shí)施計(jì)算的糖基化，以擬合 步驟（b)中獲得的溶液結(jié)構(gòu)，及獲得代表性的模型， (f) 在自步驟（e)獲得代表性的模型之后實(shí)施全部病原性序列的多序列分析，以鑒定 保守殘基， (g) 將步驟（f)中鑒定的殘基定位在自步驟（e)獲得的結(jié)構(gòu)上， (h) 使用步驟（f)中產(chǎn)生的模型，自相鄰鏈鑒定涉及維持鏈間接觸的殘基， (i) 從自步驟（f)，（g)及（h)獲得的信息鑒定保持保守的，未糖基化的，表面暴露的及 涉及維持鏈間接觸的袋， (j) 使用步驟（a)?（i)鑒定糖基化的血細(xì)胞凝集素三聚體的頭區(qū)中的可成藥位點(diǎn)， (k) 基于步驟（j)中鑒定的袋導(dǎo)出形成袋的肽序列， (l) 使用在2-C1三苯甲基珠上使用F-moc化學(xué)的固相肽合成來(lái)合成互補(bǔ)于步驟（k)中 獲得的序列的膚， (m) 通過(guò)使用4當(dāng)量的保護(hù)的Fmoc-氨基酸，用HBTU(2-(1H-苯并三 唑-1-基）-1，1，3, 3-四甲基脲鎗六氟磷酸鹽）作為偶聯(lián)劑來(lái)執(zhí)行步驟（1)中獲得的肽的 鏈延伸； (n) 由HOBT(n-羥基苯并三唑）或C0MU(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亞乙基氨基氧基） 二甲基氨基-嗎啉代-碳鎗六氟磷酸鹽抑制步驟（m)中獲得的肽的外消旋化； (〇)由Kaiser測(cè)試確認(rèn)步驟（n)中各偶聯(lián)反應(yīng)的完成， (P)使用TFA切割切割步驟（〇)中獲得的肽， (q) 在切割步驟（P)中獲得的肽之后合成肽， (r) 使用反相HPLC將步驟（q)中獲得的肽純化至同質(zhì)， (s) 由質(zhì)量光譜法表征步驟（r)中獲得的肽， (t) 使用基于SAXS的pH實(shí)驗(yàn)針對(duì)血細(xì)胞凝集素體外篩選步驟（s)中獲得的肽。
22. 權(quán)利要求21的方法，其中步驟（a)?（j)包括鑒定血細(xì)胞凝集素蛋白中的"可成 藥位點(diǎn)"的過(guò)程。
23. 權(quán)利要求21的方法，其中步驟（j)中鑒定的血細(xì)胞凝集素蛋白的"可成藥位點(diǎn)"對(duì) 于篩選抗流感/流感藥物有用。
24. 權(quán)利要求21的方法，其中糖基化的HA蛋白從選自下列的流感病毒株分離：H1N1，H5N1，H9N2,H3N2 和H14N5。
【文檔編號(hào)】G01N23/201GK104220091SQ201380019490
【公開(kāi)日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2013年2月14日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月14日
【發(fā)明者】A·福納, K·潘迪, Y·S·拉托爾 申請(qǐng)人:科學(xué)與工業(yè)研究會(huì)