一種dab2ip蛋白的elisa檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種針對DAB2IP蛋白的ELISA檢測方法，該方法采用雙抗體夾心ABC法，同時(shí)具有高特異性和高靈敏度。所述檢測方法具有以下特征：包被DAB2IP單克隆抗體（由保藏號為CCTCC?No.C2013148的細(xì)胞株分泌，保藏名稱為DAB2IPMab1）于ELISA檢測板上作為固相抗體，以生物素標(biāo)記的DAB2IP多克隆抗體作為酶標(biāo)抗體，使HRP通過與其偶聯(lián)的Avidin與多克隆抗體上的生物素結(jié)合，經(jīng)TMB顯色，在450nm單波長處測定吸收值，可以實(shí)現(xiàn)DAB2IP蛋白的定量檢測。本發(fā)明還提供DAB2IP蛋白檢測方法的應(yīng)用。該方法為DAB2IP蛋白的檢測及檢測產(chǎn)品的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】—種DAB21P蛋白的ELISA檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于免疫學(xué)檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種DAB2IP蛋白的檢測方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康的常見病和多發(fā)病，其死亡率僅次于心腦血管疾病。全球每年罹患惡性腫瘤人數(shù)約有1000萬人，其中因腫瘤死亡的病例達(dá)700多萬，而腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是腫瘤死亡的主要因素。近年來，我國每年新增腫瘤病患160-170萬人，呈明顯上升趨勢。腫瘤治療康復(fù)的關(guān)鍵在于腫瘤的及時(shí)準(zhǔn)確診斷和治療。因此，腫瘤診斷對于降低腫瘤病死亡率意義重大。腫瘤的診斷主要依靠檢測腫瘤標(biāo)志物來實(shí)現(xiàn)。同時(shí),腫瘤標(biāo)志物也是腫瘤的病理診斷、治療和預(yù)后判斷的重要指標(biāo)。這些標(biāo)志物存在于病人的細(xì)胞、組織、血液或體液中，檢測這些腫瘤標(biāo)志物的表達(dá)水平，對相關(guān)惡性腫瘤的早期診斷、治療效果和預(yù)后轉(zhuǎn)歸判斷等有重要參考價(jià)值。
[0003]DAB2IP是一種新發(fā)現(xiàn)的抑癌蛋白，它與抑癌蛋白DAB2蛋白的N末端相結(jié)合，是DAB2下游的效應(yīng)蛋白。DAB2IP最初發(fā)現(xiàn)與前列腺癌有關(guān)，其表達(dá)減少常在前列腺癌細(xì)胞中檢測到，而在正常的前列腺細(xì)胞中則表達(dá)正常。另外，研究表明DAB2IP蛋白的表達(dá)與前列腺癌轉(zhuǎn)移的分級和預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，故監(jiān)測低表達(dá)的DAB2IP對于前列腺癌的預(yù)測和診治具有重要意義。Dote等發(fā)現(xiàn)DAB2IP的基因沉默對胃腸癌和乳腺癌的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移起重要作用。Yano等認(rèn)為DAB2IP可作為肺癌發(fā)生的一個(gè)生物標(biāo)志物。而越來越多的研究表明DAB2IP作為重要的抑癌基因，在乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、直腸癌、肺癌等多種腫瘤發(fā)生發(fā)展和預(yù)后等方面都發(fā)揮了舉足輕重的作用。
[0004]作為一種新發(fā)現(xiàn)的抑癌蛋白，關(guān)于DAB2IP的失活機(jī)制、抑癌機(jī)理及其與多種腫瘤的關(guān)系正在不斷被深入研究。對DAB2IP的進(jìn)一步研究，將為腫瘤診斷提供新途徑，并有望成為治療腫瘤的突破口之一。DAB2IP的去甲基化治療，DAB2IP再表達(dá)和依據(jù)DAB2IP信號通路蛋白設(shè)計(jì)腫瘤抑制劑類藥物，將為腫瘤治療提供新的思路。
[0005]因此，針對DAB2IP蛋白的檢測方法一方面為臨床腫瘤的輔助診斷、鑒別診斷、觀察療效、監(jiān)測復(fù)發(fā)以及預(yù)后評價(jià)提供一個(gè)新的參考指標(biāo)和檢測工具；另一方面為全面揭示DAB2IP蛋白的作用機(jī)制以及與臨床腫瘤的關(guān)系的研究提供了一個(gè)新手段。蛋白檢測方法相對于核酸檢測法，避免了蛋白表達(dá)的時(shí)空調(diào)控導(dǎo)致的誤差，具有更直接準(zhǔn)確的優(yōu)勢。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種人DAB2IP蛋白的檢測方法。
[0007]在一方面，本發(fā)明提供了一種DAB2IP蛋白的檢測方法，所述方法包括以包被于ELISA檢測板上的DAB2IP單克隆抗體作為固相抗體和標(biāo)記的DAB2IP多克隆抗體作為酶標(biāo)抗體進(jìn)行雙抗體夾心法，以定量檢測DAB2IP蛋白。優(yōu)選地，所述DAB2IP單克隆抗體來自抗人腫瘤抑制因子DAB2IP單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，其保藏號為CCTCC N0.C2013148。[0008]在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述檢測方法包括:以包被于ELISA檢測板上的DAB2IP單克隆抗體作為固相抗體，以生物素標(biāo)記的DAB2IP多克隆抗體作為酶標(biāo)抗體，通過顯色劑-Avidin與多克隆抗體上的生物素結(jié)合使顯色劑通過與其偶聯(lián)的Avidin與多克隆抗體上的生物素結(jié)合，經(jīng)顯色，以定量檢測實(shí)現(xiàn)DAB2IP蛋白。
[0009]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述顯色劑是辣根過氧化物酶(HRP)，在這種情況下經(jīng)四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色，在400-700nm，優(yōu)選450nm單波長測定吸收值，以定量檢測實(shí)現(xiàn)DAB2IP蛋白。
[0010]本發(fā)明的方法為DAB2IP蛋白的檢測及相關(guān)檢測產(chǎn)品的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。
[0011]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的生物素標(biāo)記的DAB2IP多克隆抗體是按以下步驟得到的:
[0012]將DAB2IP多克隆抗體溶解在PBS緩沖液中(優(yōu)選濃度2mg/ml )，加入生物素(優(yōu)選生物素為抗體分子數(shù)的1-40倍，更 優(yōu)選5-30倍，還更優(yōu)選10-20倍)，在冰上靜置，經(jīng)純化得到純的生物素化抗體。
[0013]本發(fā)明中的DAB2IP單克隆抗體可以參見本 申請人:于2014年I月9日提交的，申請?zhí)枮?01410009739.9、發(fā)明名稱為“一種抗人DAB2IP的單克隆抗體及其細(xì)胞株”的發(fā)明專利申請，其全文引入本文作為參考。
[0014]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的單克隆抗體是按以下步驟制備的:將DAB2IP基因(SEQ ID N0.1)重組到改造過的pET32a載體上，該載體同時(shí)含有6His tag和TRX tag，并在6His tag和多克隆位點(diǎn)之間含有TEV酶切位點(diǎn)；將重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21菌株中進(jìn)行表達(dá)，所表達(dá)的蛋白為TRX-6His-DAB2IP(SEQ ID N0.2)融合蛋白，經(jīng)TEV(S219V)酶切及二次鎳柱和分子篩純化，得到純化的DAB2IP蛋白；利用該純化的DAB2IP蛋白免疫小鼠，經(jīng)細(xì)胞融合及亞克隆化得到單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，由該細(xì)胞株分泌產(chǎn)生單克隆抗體。
其中，SEQ ID N0.1如下:
【權(quán)利要求】
1.一種DAB2IP蛋白的檢測方法，所述方法包括以包被于ELISA檢測板上的DAB2IP單克隆抗體作為固相抗體和標(biāo)記的DAB2IP多克隆抗體作為酶標(biāo)抗體進(jìn)行雙抗體夾心法，以定量檢測DAB2IP蛋白。
2.權(quán)利要求1的方法，所述DAB2IP單克隆抗體來自抗人腫瘤抑制因子DAB2IP單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，其保藏號為CCTCC N0.C2013148。
3.權(quán)利要求1或2的方法，包括所述檢測方法:以包被于ELISA檢測板上的DAB2IP單克隆抗體作為固相抗體，以生物素標(biāo)記的DAB2IP多克隆抗體作為酶標(biāo)抗體，通過顯色劑-Avidin與多克隆抗體上的生物素結(jié)合使顯色劑通過與其偶聯(lián)的Avidin與多克隆抗體上的生物素結(jié)合，經(jīng)顯色，以定量檢測DAB2IP蛋白。
4.權(quán)利要求3的方法，所述顯色劑是辣根過氧化物酶(HRP)，在這種情況下經(jīng)四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色，在450nm單波長測定吸收值，以定量檢測實(shí)現(xiàn)DAB2IP蛋白。
5.權(quán)利要求1或2的方法，所述生物素標(biāo)記的DAB2IP多克隆抗體是按以下步驟制備的: 將DAB2IP多克隆抗體溶解在PBS緩沖液中(優(yōu)選濃度2mg/ml )，加入生物素(優(yōu)選生物素為抗體分子數(shù)的1-40倍，更優(yōu)選5-30，還更優(yōu)選10-20倍)，在冰上靜置，經(jīng)純化得到純的生物素化抗體。
6.權(quán)利要求1或2的方法，所述單克隆抗體是按以下步驟制備的:將DAB2IP基因重組到改造過的pET32a載體上，該載體同時(shí)含有6His tag和TRX tag，并在6His tag和多克隆位點(diǎn)之間含有TEV酶切位點(diǎn)；將重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21菌株中進(jìn)行表達(dá)，所表達(dá)的蛋白為TRX-6His-DAB2IP融合蛋白，經(jīng)TEV酶切及二次鎳柱和分子篩純化，得到純化的DAB2IP蛋白；利用該純化的DAB2IP蛋白免疫小鼠，經(jīng)細(xì)胞融合及亞克隆化得到單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，由該細(xì)胞株分泌產(chǎn)生單克隆抗體。
7.權(quán)利要求1或2的方法，所述多克隆抗體是按以下步驟制備的:利用權(quán)利要求6純化的DAB2IP蛋白免疫新西蘭大白兔獲得多克隆抗體。
8.權(quán)利要求1或2的方法，所述DAB2IP的定量檢測是按以下方法完成的:將DAB2IP標(biāo)準(zhǔn)蛋白進(jìn)行梯度稀釋，然后分別用此方法測定400-700nm，優(yōu)選450nm單波長時(shí)的讀數(shù)，制作一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，再將要測定的樣品用此法在相同波長所測得的讀數(shù)帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到其實(shí)際濃度。
【文檔編號】G01N33/68GK103983784SQ201410052911
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年2月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月17日
【發(fā)明者】吳允昆, 蘇銀桃, 李生平, 謝佐福, 施方媛, 曾占壯, 趙艷和 申請人:中國科學(xué)院福建物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究所