皮膚應(yīng)激蓄積量的評(píng)價(jià)方法
【專利摘要】本發(fā)明的課題在于提供一種使用生物化學(xué)指標(biāo)的新穎的評(píng)價(jià)方法，其不會(huì)對(duì)使用者造成負(fù)擔(dān)，可評(píng)價(jià)肌膚的應(yīng)激蓄積量，并且可簡(jiǎn)便且確切地評(píng)價(jià)是否為敏感性肌膚。本發(fā)明通過(guò)膠帶剝離法等采集皮膚角質(zhì)層，并通過(guò)測(cè)定其中所含有的DJ-1表達(dá)量來(lái)評(píng)價(jià)應(yīng)激蓄積量。
【專利說(shuō)明】皮膚應(yīng)激蓄積量的評(píng)價(jià)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及人類皮膚的應(yīng)激蓄積量的評(píng)價(jià)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]人類皮膚時(shí)常與外界接觸并受到各種刺激。其刺激的代表性例子為紫外線。紫外線即使在未在外觀上給肌膚造成太大變化的情況下，仍會(huì)誘發(fā)皮膚細(xì)胞的DNA斷裂或膠原蛋白的變性等，而成為皮膚老化的原因，經(jīng)常持續(xù)性地對(duì)肌膚造成應(yīng)激。此外，對(duì)女性而言，洗臉、化妝等日常行為也會(huì)對(duì)皮膚造成刺激，這些刺激會(huì)作為潛在的應(yīng)激而蓄積于肌膚。而且，對(duì)于這些刺激(應(yīng)激)的抵抗力若因某種原因而減少時(shí)，即認(rèn)為是敏感性肌膚。此種紫外線或氧化等導(dǎo)致的皮膚外界刺激的蓄積量在本發(fā)明中稱為皮膚的應(yīng)激蓄積量。另一方面，敏感性肌膚是指雖無(wú)明顯的皮膚病變但容易導(dǎo)致不利、有害反應(yīng)的肌膚。而且，作為此種敏感性肌膚的原因，據(jù)說(shuō)是由于當(dāng)應(yīng)激的蓄積達(dá)到一定程度，肌膚的敏感性就會(huì)提高。此外，敏感性肌膚對(duì)外界刺激的抵抗力較健康肌膚低，可謂容易產(chǎn)生皮膚問(wèn)題的肌膚。近年來(lái)，意識(shí)到敏感性肌膚的女性有增加的趨勢(shì)，在化妝品等方面也越來(lái)越期望有刺激更小的產(chǎn)品。
[0003]在化妝品的銷售現(xiàn)場(chǎng)，由美容專家進(jìn)行問(wèn)診并評(píng)價(jià)肌膚應(yīng)激的蓄積狀況和是否為敏感性肌膚，從而選擇對(duì)肌膚造成應(yīng)激(刺激)較小的化妝品。然而，近年來(lái)由于郵購(gòu)銷售等化妝品專家不在場(chǎng)的銷售方法逐漸普及，因此，期望可判定肌膚的應(yīng)激狀態(tài)，并且即使不是專家也能簡(jiǎn)便地評(píng)價(jià)敏感性肌膚的程度。若此可行，即使不依靠專家的問(wèn)診，也可通過(guò)評(píng)價(jià)使用者肌膚的應(yīng)激狀態(tài)和是否為敏感性肌膚來(lái)自行選擇適合的化妝品。此外，可簡(jiǎn)單地選擇更適合使用者肌膚的化妝品、化學(xué)煥膚(chemical peeling)劑，據(jù)此，可避免皮膚的炎癥等的肌膚問(wèn)題、副作用，而且可更加提高化妝品帶來(lái)的護(hù)膚作用、化學(xué)煥膚的施行等的有益性。如上所述，人們正在尋求一種方法，即使不依靠美容專家的問(wèn)診也能評(píng)價(jià)皮膚的外界刺激暴露過(guò)程(肌膚應(yīng)激的蓄積量)，并且客觀地判別是否為敏感性肌膚。
[0004]在專利文獻(xiàn)I中公開(kāi)了以下方法，在皮膚上涂布化妝品，然后將剝離出的皮膚角質(zhì)層回收并進(jìn)行觀察以評(píng)價(jià)皮膚的敏感性。然而，該方法需對(duì)每種化妝品全都進(jìn)行檢查，此夕卜，無(wú)法評(píng)價(jià)使用者肌膚的應(yīng)激蓄積量。
[0005]在專利文獻(xiàn)2中公開(kāi)了以下方法，在皮膚上涂布如辣椒素酯類物質(zhì)(Capsinoids)的刺激性物質(zhì)來(lái)評(píng)價(jià)是否為敏感性肌膚。然而，使用如辣椒素酯類物質(zhì)的刺激性強(qiáng)的物質(zhì)的試驗(yàn)方法對(duì)受試者來(lái)說(shuō)也并不優(yōu)選。
[0006]在專利文獻(xiàn)3中公開(kāi)了以下方法,測(cè)定臉部角質(zhì)層的I丐衛(wèi)蛋白(calprotectin)存在量來(lái)評(píng)價(jià)是否為敏感性肌膚。
[0007]本 申請(qǐng)人:發(fā)現(xiàn)具有抗氧化作用的DJ-1蛋白質(zhì)(別名PARK-7蛋白質(zhì))作為特應(yīng)性皮炎標(biāo)記物有用故而提出了專利申請(qǐng)(專利文獻(xiàn)4)。另一方面，近年來(lái)逐漸表明該DJ-1蛋白質(zhì)可作為各種疾病的標(biāo)記物來(lái)利用。專利文獻(xiàn)4公開(kāi)了特異性識(shí)別氧化型DJ-1蛋白質(zhì)的抗體。其次，提出了通過(guò)使用該抗體測(cè)定氧化型DJ-1來(lái)診斷阿爾茨海默病、帕金森病的方法。此外，專利文獻(xiàn)5公開(kāi)了通過(guò)測(cè)定腦脊液、血液等的DJ-1蛋白質(zhì)來(lái)診斷腦損傷性疾病的方法。此外，專利文獻(xiàn)6提出了通過(guò)測(cè)定DJ-1蛋白質(zhì)來(lái)診斷糖尿病性視網(wǎng)膜病的方法和試劑。
[0008]專利文獻(xiàn)
[0009]專利文獻(xiàn)1:日本特開(kāi)平10-295648號(hào)公報(bào)
[0010]專利文獻(xiàn)2:日本特開(kāi)2005-296007號(hào)公報(bào)
[0011]專利文獻(xiàn)3:日本專利第4469762號(hào)公報(bào)
[0012]專利文獻(xiàn)4:W02007 / 046463號(hào)公報(bào)
[0013]專利文獻(xiàn)5:日本特表2007-506086號(hào)公報(bào)
[0014]專利文獻(xiàn)6:日本特開(kāi)2009-168819號(hào)公報(bào)
【發(fā)明內(nèi)容】
[0015]如上所述，期望有評(píng)價(jià)紫外線或氧化等導(dǎo)致的肌膚應(yīng)激的蓄積量并客觀地評(píng)價(jià)是否為敏感性肌膚的方法。優(yōu)選該評(píng)價(jià)方法并非以外科方式取出皮膚或?qū)ζつw造成刺激等的給使用者造成負(fù)擔(dān)的方法。本發(fā)明的課題在于提供不會(huì)對(duì)使用者造成負(fù)擔(dān)，且可評(píng)價(jià)肌膚的應(yīng)激蓄積量的使用生物化學(xué)指標(biāo)的新穎的評(píng)價(jià)方法。
[0016]本發(fā)明由以下內(nèi)容構(gòu)成。
[0017](I) 一種人類皮膚的應(yīng)激蓄積量的評(píng)價(jià)方法，其特征在于，將皮膚角質(zhì)層的DJ-1表達(dá)量與預(yù)先或同時(shí)測(cè)定的正常人類皮膚的DJ-1表達(dá)量進(jìn)行對(duì)比。
[0018](2)根據(jù)(I)所述的評(píng)價(jià)方法，其特征在于，具備下述工序:采集工序，采集受試者的評(píng)價(jià)對(duì)象部位的角質(zhì)層；測(cè)定工序，測(cè)定所述采集工序所采集的角質(zhì)層中的DJ-1表達(dá)量；和對(duì)比工序，將所述測(cè)定工序所測(cè)定的DJ-1表達(dá)量與具有健康肌膚者的所述評(píng)價(jià)對(duì)象部位角質(zhì)層中的DJ-1表達(dá)量進(jìn)行對(duì)比。
[0019](3)根據(jù)(I)或(2)中所述的評(píng)價(jià)方法，其特征在于，具備下述工序:采集工序，采集受試者的評(píng)價(jià)對(duì)象部位的角質(zhì)層；測(cè)定工序，測(cè)定所述采集工序所采集的角質(zhì)層中的DJ-1表達(dá)量；和對(duì)比工序，將所述測(cè)定工序所測(cè)定的DJ-1表達(dá)量與樣本組的所述評(píng)價(jià)對(duì)象部位角質(zhì)層中的DJ-1表達(dá)量分布進(jìn)行對(duì)比。
[0020](4)根據(jù)(I)?(3)中任一項(xiàng)所述的評(píng)價(jià)方法，其特征在于，采集皮膚角質(zhì)層的工序通過(guò)膠帶剝離法進(jìn)行。
[0021](5)根據(jù)(I)?(4)中任一項(xiàng)所述的評(píng)價(jià)方法，其特征在于，人類皮膚的應(yīng)激蓄積量為紫外線損傷或氧化所導(dǎo)致的應(yīng)激蓄積量。
[0022]根據(jù)本發(fā)明的評(píng)價(jià)方法，可通過(guò)測(cè)定角質(zhì)層中的DJ-1表達(dá)量來(lái)評(píng)價(jià)肌膚的應(yīng)激蓄積量。進(jìn)而，由于本發(fā)明的評(píng)價(jià)方法以膠帶剝離法等簡(jiǎn)便的操作方法來(lái)采集評(píng)價(jià)試樣，所以受試者的負(fù)擔(dān)較少且任何人均可簡(jiǎn)便地進(jìn)行評(píng)價(jià)。此外，因?yàn)槠錇樯锘瘜W(xué)的試驗(yàn)方法，由任何人進(jìn)行測(cè)定皆可得到相同的結(jié)果，因此不需要如以往一樣通過(guò)與專家面談的方式進(jìn)行咨詢。
【專利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0023]圖1為表示HaCaT細(xì)胞負(fù)荷過(guò)氧化氫所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激且測(cè)定細(xì)胞內(nèi)蛋白量的結(jié)果的圖。[0024]圖2為表示HaCaT細(xì)胞負(fù)荷過(guò)氧化氫所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激且測(cè)定細(xì)胞內(nèi)DJ-1量的結(jié)果的圖。
[0025]圖3為表示測(cè)定HaCaT細(xì)胞負(fù)荷過(guò)氧化氫所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激時(shí)的釋放到培養(yǎng)液中的DJ-1量的結(jié)果的圖。
[0026]圖4為研究對(duì)BSO所導(dǎo)致的蛋白生成產(chǎn)生影響的圖。
[0027]圖5為研究BSO所導(dǎo)致的培養(yǎng)人表皮角化細(xì)胞的谷胱甘肽生成濃度的圖。
[0028]圖6為表示負(fù)荷谷胱甘肽生成抑制劑即BSO與過(guò)氧化氫所導(dǎo)致的應(yīng)激的人表皮角化細(xì)胞分泌到細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH量的圖。
[0029]圖7為表示負(fù)荷谷胱甘肽生成抑制劑即BSO與過(guò)氧化氫所導(dǎo)致的應(yīng)激的人表皮角化細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)蛋白量的圖。
[0030]圖8為表示負(fù)荷谷胱甘肽生成抑制劑即BSO與過(guò)氧化氫所導(dǎo)致的應(yīng)激的人表皮角化細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)DJ-1量的圖。
[0031]圖9為表示負(fù)荷谷胱甘肽生成抑制劑即BSO與過(guò)氧化氫所導(dǎo)致的應(yīng)激的人表皮角化細(xì)胞分泌到細(xì)胞培養(yǎng)液中的DJ-1量的圖。
[0032]圖10為表示培養(yǎng)人表皮角化細(xì)胞照射UVB24小時(shí)后的細(xì)胞內(nèi)蛋白量且表示根據(jù)UVB照射量的蛋白量減少的圖。
[0033]圖11為表示培養(yǎng)人表皮角化細(xì)胞照射UVB24小時(shí)后的細(xì)胞內(nèi)DJ-1量且表示根據(jù)UVB照射量的DJ-1量增加的圖。
[0034]圖12為表示培養(yǎng)人表皮角化細(xì)胞照射UVB24小時(shí)后的培養(yǎng)上清中的DJ-1量且表示根據(jù)UVB照射量的DJ-1量增加的圖。
[0035]圖13為表示人背部照射UVB (應(yīng)激負(fù)荷)后的DJ-1的測(cè)定結(jié)果且意味著照射所導(dǎo)致的應(yīng)激持續(xù)殘留于皮膚角質(zhì)層的圖。
[0036]圖14為表示肌質(zhì)的問(wèn)卷調(diào)查結(jié)果與相對(duì)應(yīng)的DJ-1量的圖。
[0037]圖15為表示習(xí)慣性地照射紫外線經(jīng)歷的問(wèn)卷調(diào)查結(jié)果與相對(duì)應(yīng)的DJ-1量的圖。
[0038]圖16為表示隨機(jī)抽選的205名女性的皮膚DJ-1分布的圖。柱狀圖表示DJ-1的單位角質(zhì)層蛋白的濃度及人數(shù)。折線圖表示其人數(shù)的累計(jì)。
【具體實(shí)施方式】
[0039]以下，關(guān)于本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0040]本發(fā)明評(píng)價(jià)方法的特征在于以皮膚角質(zhì)層中的DJ-1的存在量為指標(biāo)。
[0041]DJ-1是分子質(zhì)量為21kDa的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)。如上所述，其被鑒定為與帕金森病有關(guān)的蛋白質(zhì)，之后表明其與皮膚創(chuàng)傷愈合過(guò)程中的再上皮化(re-epithelialization)有關(guān)。此外，從其立體結(jié)構(gòu)提示也可作為蛋白酶發(fā)揮作用。
[0042]本發(fā)明使用敏感性肌膚、健康肌膚這樣的用語(yǔ)。敏感性肌膚是指雖無(wú)明顯的皮膚病變但容易導(dǎo)致不利、有害反應(yīng)的肌膚。此外，其對(duì)外界刺激的抵抗力較健康肌膚低，也可謂容易產(chǎn)生斑疹、肌膚粗糙等皮膚問(wèn)題的肌膚。另一方面，健康肌膚是指不會(huì)表現(xiàn)出如上所述的敏感性肌膚性質(zhì)的健康且正常的肌膚。
[0043]此外，角質(zhì)層是指位于皮膚最上層的組織。角質(zhì)層具有保護(hù)皮膚不受來(lái)自體外的異物、刺激的作用。[0044]本發(fā)明中的評(píng)價(jià)對(duì)象部位只要是可得到角質(zhì)層的部分，則可包含任意部位，作為主要的部位，可列舉面部、頸部、上臂部，根據(jù)以往的方法可得到來(lái)自這些部位的皮膚的角質(zhì)層。但是，如前所述，由于外科摘取皮膚等的方法會(huì)給使用者造成負(fù)擔(dān)，故優(yōu)選膠帶剝離、摩擦等可簡(jiǎn)便地得到角質(zhì)層的方法。
[0045]如此準(zhǔn)備的各試樣中的DJ-1表達(dá)量可通過(guò)以往已知的方法進(jìn)行測(cè)定。例如，基于與DJ-1的抗體的反應(yīng)，可使用酶免疫分析法、放射免疫分析法、蛋白質(zhì)印跡法等的方法。
[0046]將DJ-1從各試樣用其自身已知的生物化學(xué)方法，例如通過(guò)凍融法、超聲波破碎法、勻漿法等來(lái)制備可溶性組分，并在提取后快速測(cè)定。
[0047]由于蓄積了應(yīng)激的肌膚或敏感性肌膚的角質(zhì)層中的DJ-1表達(dá)量顯著較健康肌膚高，因此以角質(zhì)層中的DJ-1表達(dá)量的多少為指標(biāo)，可簡(jiǎn)便地評(píng)價(jià)應(yīng)激蓄積量或肌膚是否為敏感性肌膚。本發(fā)明所使用的角質(zhì)層可通過(guò)膠帶剝離法等使用角質(zhì)膠帶僅采集角質(zhì)層表層部分的簡(jiǎn)單的方法進(jìn)行采集。此外，本發(fā)明可不對(duì)皮膚造成紫外線或化學(xué)物質(zhì)等的刺激來(lái)測(cè)定DJ-1的表達(dá)量。因此，可不對(duì)使用者造成負(fù)擔(dān)來(lái)評(píng)價(jià)使用者肌膚的應(yīng)激蓄積量。特別是可簡(jiǎn)單地選擇更適合使用者肌膚的化妝品或化學(xué)煥膚劑，據(jù)此，可避免皮膚的炎癥等肌膚問(wèn)題或副作用，并進(jìn)一步發(fā)揮化妝品帶來(lái)的護(hù)膚作用。
[0048]本發(fā)明的評(píng)價(jià)方法由下述工序構(gòu)成:采集工序,采集角質(zhì)層；測(cè)定工序，測(cè)定所述采集工序所采集的角質(zhì)層中的DJ-1表達(dá)量；和對(duì)比工序，將所述測(cè)定工序所測(cè)定的DJ-1表達(dá)量與健康肌膚角質(zhì)層中的DJ-1表達(dá)量進(jìn)行對(duì)比。此外，本發(fā)明的評(píng)價(jià)方法由下述工序構(gòu)成:采集工序，采集角質(zhì)層；測(cè)定工序，測(cè)定所述采集工序所采集的角質(zhì)層中的DJ-1表達(dá)量；和對(duì)比工序，將所述測(cè)定工序所測(cè)定的DJ-1表達(dá)量與樣本組角質(zhì)層中的DJ-1表達(dá)量分布進(jìn)行對(duì)比。以下，對(duì)該評(píng)價(jià)方法進(jìn)行說(shuō)明。
[0049]首先，將上述所測(cè)定的DJ-1表達(dá)量與健康肌膚角質(zhì)層中的DJ-1表達(dá)量進(jìn)行對(duì)比。此外，也可測(cè)定受試者的某一評(píng)價(jià)對(duì)象部位角質(zhì)層中的DJ-1表達(dá)量，再將所測(cè)定的DJ-1表達(dá)量與具有健康肌膚者的同一評(píng)價(jià)對(duì)象部位角質(zhì)層中的DJ-1表達(dá)量進(jìn)行對(duì)比。通過(guò)使用來(lái)自多名具有健康肌膚者的數(shù)據(jù)平均值，可更為客觀地評(píng)價(jià)具有健康肌膚者的角質(zhì)層的DJ-1表達(dá)量。
[0050]或者，也可測(cè)定受試者的某一評(píng)價(jià)對(duì)象部位角質(zhì)層中的DJ-1表達(dá)量，再將所測(cè)定的DJ-1表達(dá)量與樣本組的同一評(píng)價(jià)對(duì)象部位角質(zhì)層中的DJ-1表達(dá)量分布進(jìn)行對(duì)比。通過(guò)使用樣本組的DJ-1表達(dá)量分布可更為客觀地進(jìn)行評(píng)價(jià)。
[0051]如此對(duì)比后的結(jié)果為，當(dāng)所測(cè)定的DJ-1表達(dá)量顯著較健康肌膚的DJ-1表達(dá)量大時(shí)，或是相較于樣本組的DJ-1表達(dá)量分布而判斷為DJ-1表達(dá)量大時(shí)，即可評(píng)價(jià)為應(yīng)激的蓄積大。該健康肌膚的試樣可從測(cè)定DJ-1者采集，也可從與測(cè)定DJ-1者的不同者采集。此夕卜，該樣本組優(yōu)選以統(tǒng)計(jì)上有效的規(guī)模來(lái)進(jìn)行隨機(jī)抽取，但也優(yōu)選根據(jù)不同目的例如按照性別、年齡來(lái)抽取樣本組。
[0052]此外，當(dāng)受試者的某一評(píng)價(jià)對(duì)象部位角質(zhì)層中的DJ-1表達(dá)量顯著較具有健康肌膚者的同一評(píng)價(jià)對(duì)象部位角質(zhì)層中的DJ-1表達(dá)量大時(shí)，或是相較于樣本組的同一評(píng)價(jià)對(duì)象部位角質(zhì)層中的DJ-1表達(dá)量分布而判斷為DJ-1表達(dá)量大時(shí)，也評(píng)價(jià)為應(yīng)激的蓄積大。此夕卜，當(dāng)該數(shù)值顯著高時(shí)則評(píng)價(jià)為具有敏感性肌膚。
[0053]即，可根據(jù)所測(cè)定的DJ-1表達(dá)量的程度來(lái)評(píng)價(jià)應(yīng)激蓄積的程度。當(dāng)所測(cè)定的DJ-1表達(dá)量相較于健康肌膚或者樣本組的表達(dá)量分布而被判斷為顯著多時(shí)，該肌膚表現(xiàn)出較強(qiáng)的敏感性肌膚的性質(zhì)，并且其對(duì)外界刺激的抵抗力相較于健康肌膚或樣本組的平均值而顯著低，極易發(fā)生皮膚問(wèn)題的可能性高。
[0054]通過(guò)試驗(yàn)例、實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明。且本發(fā)明不限定于下述實(shí)施例。
[0055]實(shí)施例
[0056]試驗(yàn)例I
[0057]測(cè)定氧化應(yīng)激所導(dǎo)致的來(lái)自皮膚細(xì)胞中的DJ-1量的變化。制作用于確認(rèn)DJ-1功能的敲低了 DJ-1基因的細(xì)胞，并進(jìn)行氧化應(yīng)激負(fù)荷試驗(yàn)。
[0058]使用來(lái)自人細(xì)胞株即HaCaT 細(xì)胞(J.Cell Biol.106:761-771 (1988).)(購(gòu)自DKFZ(Deutsches Krebsforschungszentrum))，確認(rèn)氧化應(yīng)激與DJ-1蛋白的關(guān)系。此外，通過(guò)siRNA抑制DJ-1基因的表達(dá)(敲低)，確認(rèn)DJ-1蛋白表達(dá)量的變化。
[0059](I) HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)及過(guò)氧化氫(H2O2)處理所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激的負(fù)荷及siRNA處理導(dǎo)致的DJ-1基因的敲低操作
[0060]將HaCaT細(xì)胞用PBS (-)洗滌后，通過(guò)胰蛋白酶處理剝離細(xì)胞，以1200rpm離心3min得到細(xì)胞。使用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，以5000cells/cm2的密度接種到培養(yǎng)瓶中，每隔2?3天在亞融合(subconfluent)的狀態(tài)下進(jìn)行傳代。
[0061]將HaCaT細(xì)胞用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基以2.1 X 105cells/well接種到12孔板中并培養(yǎng) 24 小時(shí)后，將 siRNA(終濃度 3nM、Hs_PARK7_6FlexiTube siRNA, S102662107, Qiagen公司制)、轉(zhuǎn)染試劑(2 μ 1/well、HiPerFect Transfection Reagent, 301707, Qiagen 公司制)與所述培養(yǎng)基混合，在室溫下放置10分鐘。接著添加100 μ I/well的該混合液。未處理的細(xì)胞作為對(duì)照。
[0062]另外，作為敲低操作的陰性對(duì)照，使用AllStars陰性對(duì)照siRNA (Qiagen公司制)進(jìn)行同樣的操作。
[0063]培養(yǎng)48小時(shí)后，添加H2O2 (Wako制)0、250、500、750、1000 μ M, 24小時(shí)后回收培養(yǎng)上清，將細(xì)胞用PBS (-)洗滌后，添加100 μ I/well的細(xì)胞裂解液(50mM Tris-HCl, ImMNa3VO4, 0.4%NP-40, 120mM NaCl )，從而得到細(xì)胞溶解液。
[0064](2)細(xì)胞蛋白量的測(cè)定
[0065]使用BCA protein kit (Thermo Scientific公司制)測(cè)定細(xì)胞溶解液的蛋白量。根據(jù)試劑盒實(shí)驗(yàn)指南進(jìn)行測(cè)定。
[0066](3) DJ-1表達(dá)量的測(cè)定
[0067]使用DouSet Park7/DJ-1ELISA kit (R&D公司制)測(cè)定上清中及細(xì)胞溶解液中的DJ-1量。根據(jù)試劑盒實(shí)驗(yàn)指南進(jìn)行測(cè)定。
[0068](4)結(jié)果
[0069]過(guò)氧化氫(H2O2)所導(dǎo)致的應(yīng)激負(fù)荷的各細(xì)胞的細(xì)胞蛋白量如圖1所示。另外，培養(yǎng)上清中的DJ-1量、細(xì)胞溶解液(細(xì)胞內(nèi))的DJ-1量分別如圖2、圖3所示。且測(cè)定結(jié)果用每3個(gè)孔的平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差(S.D.)表示。
[0070]H2O2濃度依賴性地使細(xì)胞內(nèi)蛋白量減少。
[0071]另外，可確認(rèn)H2O2作為強(qiáng)的應(yīng)激而對(duì)細(xì)胞造成影響。
[0072]進(jìn)而，培養(yǎng)液的H2O2濃度在750 μ M的條件下，用DJ-1siRNA處理后的敲低細(xì)胞與陰性對(duì)照相比，細(xì)胞內(nèi)蛋白量顯著減少。(圖1)。
[0073]無(wú)論在哪種細(xì)胞中，當(dāng)培養(yǎng)液中的H2O2濃度為1000 μ M時(shí)，細(xì)胞中的DJ-1量均增加。
[0074]另一方面，培養(yǎng)液中的H2O2濃度低時(shí)培養(yǎng)上清中的DJ-1量也增加。
[0075]可確認(rèn)過(guò)氧化氫所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激在細(xì)胞內(nèi)外均使DJ-1增加(圖2、3)。
[0076]進(jìn)而，無(wú)論培養(yǎng)液中是否有H2O2,陰性對(duì)照的細(xì)胞(非敲低細(xì)胞)與對(duì)照相比細(xì)胞內(nèi)DJ-1量均增加。認(rèn)為這是轉(zhuǎn)染處理所產(chǎn)生的影響。
[0077]通過(guò)DJ-1siRNA處理，細(xì)胞中的DJ-1量與陰性對(duì)照相比降低約40%。
[0078]從以上的試驗(yàn)可知，在來(lái)自人類皮膚的HaCaT細(xì)胞中，為了應(yīng)對(duì)應(yīng)激而生成DJ-1，其生成量因siRNA干擾而被抑制。
[0079]試驗(yàn)例2
[0080]根據(jù)試驗(yàn)例I可確認(rèn)DJ-1基因?yàn)榱藨?yīng)對(duì)應(yīng)激而表達(dá)DJ-1。接著，使用人表皮角化細(xì)胞(角質(zhì)形成細(xì)胞)初代培養(yǎng)細(xì)胞，測(cè)定氧化應(yīng)激所導(dǎo)致的DJ-1量的變化。另外，測(cè)定如下角化細(xì)胞的DJ-1量的變化，即改善氧化所導(dǎo)致的細(xì)胞損傷的谷胱甘肽生成能力降低且應(yīng)激抵抗力降低的角化細(xì)胞。
[0081](I)谷胱甘肽合成抑制劑所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激抵抗力降低的細(xì)胞的制作
[0082]將人表皮角化細(xì)胞(Lonza公司)用PBS(-)洗滌后，通過(guò)胰蛋白酶處理剝離細(xì)胞，以1200rpm離心3min得到細(xì)胞。使用EpiLife培養(yǎng)基(Life Technologies)進(jìn)行培養(yǎng)，以5000?7000cells/cm2的密度接種到培養(yǎng)瓶中，每隔4?7天在亞融合的狀態(tài)下進(jìn)行傳代。
[0083]將人表皮角化細(xì)胞以lX105cells/35_ dish接種到EpiLife培養(yǎng)基(Gibco公司)中，培養(yǎng)至成為約5成的細(xì)胞密度。
[0084]使用谷胱甘妝合成抑制劑L-Buthionine-sulfoximine (BSO:Sigma-Aldrich 公司)，確定首先導(dǎo)致谷胱甘肽合成抑制的最適BSO濃度。
[0085]將BSO添加到細(xì)胞培養(yǎng)液中，24小時(shí)后用胰蛋白酶處理細(xì)胞并回收，進(jìn)行谷胱甘肽測(cè)定。將檢測(cè)不到谷胱甘肽的BSO濃度作為接下來(lái)的氧化應(yīng)激試驗(yàn)條件。
[0086](2)過(guò)氧化氫(H2O2)所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激負(fù)荷試驗(yàn)的實(shí)施
[0087]將人表皮角化細(xì)胞(Gibco公司)以lX105cells/35_ dish接種到EpiLife培養(yǎng)基(Gibco公司)中，培養(yǎng)至成為約5成的細(xì)胞密度。接著，添加BSO使成為上述(I)所確定的BSO濃度(50 μ M或100 μ Μ)，進(jìn)一步經(jīng)過(guò)24小時(shí)后，添加過(guò)氧化氫使成為0、0.5、ImM。添加過(guò)氧化氫后進(jìn)一步培養(yǎng)24小時(shí)，回收培養(yǎng)上清。另外，將細(xì)胞用PBS (-)洗滌后用100 μ I細(xì)胞裂解液進(jìn)行回收。
[0088]使用所得到的培養(yǎng)上清及細(xì)胞測(cè)定LDH (乳酸脫氫酶)量、蛋白量、DJ-1量。
[0089](3)蛋白定量
[0090]使用BCA protein kit (Thermo Scientific公司制)測(cè)定細(xì)胞溶解液的蛋白量。
[0091](4) LDH 的測(cè)定
[0092]使用Cytotoxicity Detection Kit PLUS (LDH) (Roche Applied Science 公司)測(cè)定培養(yǎng)上清中的LDH。根據(jù)試劑盒實(shí)驗(yàn)指南進(jìn)行測(cè)定，用490nm處的吸光度表示。
[0093](5) DJ-1表達(dá)量的測(cè)定
[0094]使用DuoSet Park7/DJ-1ELISA kit (R&D公司制)測(cè)定上清中及細(xì)胞溶解液中的DJ-1量。根據(jù)試劑盒實(shí)驗(yàn)指南進(jìn)行測(cè)定。
[0095](6)谷胱甘肽測(cè)定
[0096]將通過(guò)胰蛋白酶處理回收的細(xì)胞用PBS (_)洗滌，用100 μ I的MES buffer再混懸。通過(guò)超聲波處理I分鐘作為細(xì)胞溶解液，使用Gluthathione Assay Kit (Cayman Chemical公司)測(cè)定谷胱甘肽量。根據(jù)試劑盒實(shí)驗(yàn)指南進(jìn)行測(cè)定。
[0097](7)結(jié)果
[0098]添加了 BSO的細(xì)胞中的蛋白量如圖4所示,谷胱甘肽量如圖5所示。
[0099]另外，添加過(guò)氧化氫所導(dǎo)致的應(yīng)激負(fù)荷的細(xì)胞培養(yǎng)上清中的LDH量如圖6所示，DJ-1量如圖7所示。
[0100]另外同樣地,細(xì)胞中的蛋白量如圖8所示，DJ-1量如圖9所示。
[0101]表明對(duì)蛋白質(zhì)生成沒(méi)有影響且抑制谷胱甘肽生成的BSO濃度為50 μ M或100 μ Μ。其次，表明在該濃度下谷胱甘肽生成被抑制的細(xì)胞因過(guò)氧化氫導(dǎo)致的氧化應(yīng)激而使LDH的釋放被促進(jìn)(圖6)、蛋白質(zhì)量減少(圖7)。
[0102]另外,可確認(rèn)DJ-1也依賴于過(guò)氧化氫的濃度而上升(圖8、圖9)。
[0103]從以上的試驗(yàn)例1、試驗(yàn)例2的結(jié)果表明，DJ-1反映了伴隨人表皮氧化的應(yīng)激，其生成量受谷胱甘肽生成能力、基因干擾導(dǎo)致的復(fù)制低下的影響。另外，可知越是沒(méi)有氧化應(yīng)激抵抗力的細(xì)胞越是生成DJ-1。即，判斷為細(xì)胞的抵抗力降低時(shí)DJ-1增加。
[0104]試驗(yàn)例3
[0105]與試驗(yàn)例2同樣，使用人表皮角化細(xì)胞(角質(zhì)形成細(xì)胞)初代培養(yǎng)細(xì)胞，測(cè)定紫外線照射所導(dǎo)致的DJ-1量的變化。
[0106](I)人表皮角化細(xì)胞的培養(yǎng)及紫外線的照射方法
[0107]將人表皮角化細(xì)胞(Gibco公司)以lX105cells/35mm dish接種到EpiLife培養(yǎng)基(Gibco公司)中，在培養(yǎng)第3天將細(xì)胞用PBS (-)洗滌后加入Iml PBS (-)，使用三共電氣制的燈，將UVB以0.2mff/cm2的強(qiáng)度照射10、20、30mJ/cm2。照射后更換成培養(yǎng)基，培養(yǎng)24小時(shí)后回收培養(yǎng)上清，將細(xì)胞用200 μ I細(xì)胞裂解液回收，與試驗(yàn)例1、試驗(yàn)例2同樣地進(jìn)行蛋白定量、DJ-1量的測(cè)定。
[0108](2)結(jié)果
[0109]培養(yǎng)上清中的蛋白量如圖10所示。另外,培養(yǎng)細(xì)胞中的DJ-1量如圖11所示,上清中的DJ-1量如圖12所示。
[0110]人表皮角化細(xì)胞照射UVB，24小時(shí)后的DJ-1量依賴于UVB的照射光線量而受到損傷且蛋白量減少。另一方面，細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞外的DJ-1量均增加，尤其是培養(yǎng)上清中的增加量較大。
[0111]根據(jù)以上的試驗(yàn)例I?3，表明人表皮角化細(xì)胞的DJ-1值反映了應(yīng)激的水平。
[0112]試驗(yàn)例4
[0113]由于試驗(yàn)例I?3表明在人表皮角化細(xì)胞中DJ-1反映了應(yīng)激，所以對(duì)是否反映人實(shí)際的皮膚應(yīng)激進(jìn)行試驗(yàn)。即作為應(yīng)激對(duì)人類皮膚直接照射紫外線，從而觀察、測(cè)定DJ-1表達(dá)量的變化。
[0114](I)試驗(yàn)方法
[0115]<紫外線照射>[0116]具有健康肌膚的10名男性的背部使用紫外線照射裝置(DERMARAY、TerumoClinical Supply C0., Ltd.制)，照射 20、40、60、80、100mJ/cm2 紫外線。根據(jù)照射次日的紅斑確定最小紅斑量(Minimum Erythema Dose:MED)。使用該值在背部照射相當(dāng)于0、0.5、
1.0MED的紫外線，且在照射7、14天后使用角質(zhì)層測(cè)試片(ASAHIB10MED公司)通過(guò)膠帶剝離法采集角質(zhì)層。
[0117]<角質(zhì)層中DJ-1測(cè)定>
[0118]在放入了玻璃珠與500 μ I T-PER緩沖液(Thermo scientific公司)的試管中,放入采集了角質(zhì)層的角質(zhì)層測(cè)試片，用漩渦混勻器振蕩25分鐘來(lái)提取角質(zhì)層蛋白。各樣品的蛋白量用BCA protein Assay Kit (Thermo Scientific公司)進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定為在10 μ I角質(zhì)層樣品中加入200 μ I按照試劑Α:試劑B=50:1混和的液體，在60°C孵育30分鐘后，測(cè)定562nm處的吸光度。同時(shí)，用牛血清白蛋白(BSA)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。從該標(biāo)準(zhǔn)曲線與吸光度的值計(jì)算蛋白量。
[0119]角質(zhì)層提取液中所包含的DJ-1量使用Human Park7/DJ_lDuoSet (R&D systems公司)進(jìn)行定量。
[0120](2)結(jié)果
[0121]單位蛋白的DJ-1測(cè)定結(jié)果如圖13所示。紫外線照射7、14天后與非照射部位相t匕，照射0.5、1.0MED紫外線的部位角質(zhì)層中DJ-1量顯著增加。
[0122]表明通過(guò)測(cè)定DJ-1可確認(rèn)人類皮膚應(yīng)激的狀態(tài)。
[0123]試驗(yàn)例5
[0124]由于試驗(yàn)例I?3表明了在人表皮角化細(xì)胞中DJ-1反映了應(yīng)激，所以對(duì)是否反映人實(shí)際的皮膚應(yīng)激進(jìn)行試驗(yàn)。即通過(guò)調(diào)查問(wèn)卷對(duì)肌質(zhì)(敏感性)進(jìn)行提問(wèn)，并對(duì)比其回答與臉頰中DJ-1量。
[0125](I)試驗(yàn)方法
[0126]<調(diào)查問(wèn)卷>
[0127]對(duì)具有健康肌膚的575名女性關(guān)于肌質(zhì)(敏感性)進(jìn)行提問(wèn)，使其回答“不敏感”、“稍敏感”、“敏感”中的任一種。
[0128]<角質(zhì)層采集>
[0129]從做了調(diào)查問(wèn)卷的具有健康肌膚的575名女性的臉頰部使用角質(zhì)層測(cè)試片(ASAHIB10MED公司)通過(guò)膠帶剝離法采集角質(zhì)層。
[0130]<角質(zhì)層中DJ-1測(cè)定>
[0131]在放入了玻璃珠與500 μ I T-PER緩沖液(Thermo scientific公司)的試管中，放入采集了角質(zhì)層的角質(zhì)層測(cè)試片，用漩渦混勻器振蕩25分鐘來(lái)提取角質(zhì)層蛋白。各樣品的蛋白量用BCA protein Assay Kit (Thermo Scientific公司)進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定為在10 μ I角質(zhì)層樣品中加入200 μ I按照試劑Α:試劑B=50:1混和的液體，在60°C孵育30分鐘后，測(cè)定562nm處的吸光度。同時(shí)，用牛血清白蛋白(BSA)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。從該標(biāo)準(zhǔn)曲線與吸光度的值計(jì)算蛋白量。
[0132]角質(zhì)層提取液中所包含的DJ-1量使用Human Park7/DJ_lDuoSet (R&D systems公司)進(jìn)行定量。
[0133](2)結(jié)果[0134]調(diào)查問(wèn)卷的結(jié)果如下，非敏感:281名、稍敏感:193名、敏感:101名。每位調(diào)查問(wèn)卷回答者的單位蛋白的DJ-1測(cè)定結(jié)果如圖14所示。可知越敏感DJ-1量越高。
[0135]試驗(yàn)例6
[0136]由于試驗(yàn)例I?3表明了在人皮膚角化細(xì)胞中DJ-1反映了應(yīng)激，所以對(duì)是否反映人實(shí)際的皮膚應(yīng)激進(jìn)行試驗(yàn)。即通過(guò)調(diào)查問(wèn)卷進(jìn)行如下提問(wèn)，以往是否有海上運(yùn)動(dòng)等習(xí)慣性地照射紫外線的經(jīng)歷，并對(duì)比其回答與臉頰中DJ-1量。
[0137](I)試驗(yàn)方法
[0138]<調(diào)查問(wèn)卷>
[0139]對(duì)具有健康肌膚的386名女性進(jìn)行如下提問(wèn)，以往是否有海上運(yùn)動(dòng)等習(xí)慣性地照射紫外線的經(jīng)歷，使其回答“無(wú)”、“有”中的任一種。
[0140]<角質(zhì)層采集>
[0141]從做了調(diào)查問(wèn)卷的具有健康肌膚的386名女性的臉頰部使用角質(zhì)層測(cè)試片(ASAHIB10MED公司)通過(guò)膠帶剝離法采集角質(zhì)層。
[0142]<角質(zhì)層中DJ-1測(cè)定>
[0143]在放入了玻璃珠與500 μ I T-PER緩沖液(Thermo scientific公司)的試管中，放入采集了角質(zhì)層的角質(zhì)層測(cè)試片，用漩渦混勻器振蕩25分鐘來(lái)提取角質(zhì)層蛋白。各樣品的蛋白量用BCA protein Assay Kit (Thermo Scientific公司)進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定為在10 μ I角質(zhì)層樣品中加入200 μ I按照試劑Α:試劑B=50:1混和的液體，在60°C孵育30分鐘后，測(cè)定562nm處的吸光度。同時(shí)，用牛血清白蛋白(BSA)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。從該標(biāo)準(zhǔn)曲線與吸光度的值計(jì)算蛋白量。
[0144]角質(zhì)層提取液中所包含的DJ-1量使用Human Park7/DJ_lDuoSet (R&D systems公司)進(jìn)行定量。
[0145](2)結(jié)果
[0146]調(diào)查問(wèn)卷的結(jié)果如下，無(wú):223名、有:163名。每位調(diào)查問(wèn)卷回答者的單位蛋白的DJ-1測(cè)定結(jié)果如圖15所示?？芍绞蔷哂辛?xí)慣性地照射紫外線經(jīng)歷的回答者DJ-1量越聞。
[0147]試驗(yàn)例7
[0148]為了掌握人類皮膚的應(yīng)激蓄積狀態(tài)，以大量受試者為對(duì)象來(lái)測(cè)定角質(zhì)層的DJ-1。
[0149](I)試驗(yàn)方法
[0150]I)試驗(yàn)試樣的采集
[0151]將隨機(jī)抽選的205名女性作為對(duì)象，從臉頰通過(guò)膠帶剝離法采集角質(zhì)層樣品。樣品為I個(gè)部位采集I枚
[0152]2)皮膚角質(zhì)層中DJ-1測(cè)定方法
[0153]通過(guò)與試驗(yàn)例4同樣的方法進(jìn)行。
[0154]在放入了玻璃珠與500 μ I T-PER緩沖液(Thermo scientific公司)的試管中，放入采集了角質(zhì)層的角質(zhì)層測(cè)試片，用漩渦混勻器振蕩25分鐘來(lái)提取角質(zhì)層蛋白。各樣品的蛋白量用 Pierce BCA protein Assay Kit (Thermo Scientific 公司)進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定為在10 μ I角質(zhì)層樣品中加入200 μ I按照試劑Α:試劑Β=50:1混和的液體，在60°C孵育30分鐘后，測(cè)定562nm處的吸光度。同時(shí)，用牛血清白蛋白(BSA)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。從該標(biāo)準(zhǔn)曲線與吸光度的值計(jì)算蛋白量。
[0155]角質(zhì)層提取液中所包含的DJ-1量使用Human Park7/DJ-1DuoSet (R&Dsystems, DY3995E)進(jìn)行定量。
[0156](2)結(jié)果
[0157]測(cè)定結(jié)果如圖16所示。
[0158]如圖16所示，DJ-1的表達(dá)量分布于從0.3pg/ μ g總蛋白質(zhì)到超過(guò)5.0pg/ μ g總蛋白質(zhì)的值為止的大范圍。平均值為2.6pg/yg總蛋白質(zhì)。與該頻率分布相比而判斷為DJ-1的表達(dá)量大的標(biāo)準(zhǔn)可自由地進(jìn)行設(shè)定，例如，將平均值為2.epg/μ g總蛋白質(zhì)以上的值判斷為DJ-1的表達(dá)量大?；蛘?，由于2.3pg/μ g總蛋白質(zhì)的累積頻率為約50%，所以也可將超過(guò)2.3pg/ μ g總蛋白質(zhì)的值判斷為DJ-1的表達(dá)量大。其次，可判斷為DJ-1的表達(dá)量越大則人類皮膚的應(yīng)激蓄積量越大。
【權(quán)利要求】
1.一種人類皮膚的應(yīng)激蓄積量的評(píng)價(jià)方法，其特征在于，將皮膚角質(zhì)層的DJ-1表達(dá)量與預(yù)先或同時(shí)測(cè)定的正常人類皮膚的DJ-1表達(dá)量進(jìn)行對(duì)比。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的評(píng)價(jià)方法，其特征在于，具備下述工序:采集工序，采集受試者的評(píng)價(jià)對(duì)象部位的角質(zhì)層；測(cè)定工序，測(cè)定所述采集工序所采集的角質(zhì)層中的DJ-1表達(dá)量；和對(duì)比工序，將所述測(cè)定工序所測(cè)定的DJ-1表達(dá)量與具有健康肌膚者的所述評(píng)價(jià)對(duì)象部位角質(zhì)層中的DJ-1表達(dá)量進(jìn)行對(duì)比。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2中所述的評(píng)價(jià)方法，其特征在于，具備下述工序:采集工序，采集受試者的評(píng)價(jià)對(duì)象部位的角質(zhì)層；測(cè)定工序，測(cè)定所述采集工序所采集的角質(zhì)層中的DJ-1表達(dá)量；和對(duì)比工序，將所述測(cè)定工序所測(cè)定的DJ-1表達(dá)量與樣本組的所述評(píng)價(jià)對(duì)象部位角質(zhì)層中的DJ-1表達(dá)量分布進(jìn)行對(duì)比。
4.根據(jù)權(quán)利要求1?3中任一項(xiàng)所述的評(píng)價(jià)方法，其特征在于，采集皮膚角質(zhì)層的工序通過(guò)膠帶剝離法進(jìn)行。
5.根據(jù)權(quán)利要求1?4中任一項(xiàng)所述的評(píng)價(jià)方法，其特征在于，人類皮膚的應(yīng)激蓄積量為紫外線損傷或氧化所導(dǎo)致的應(yīng)激蓄積量。
【文檔編號(hào)】G01N21/31GK104007057SQ201410054223
【公開(kāi)日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2014年2月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年2月22日
【發(fā)明者】石渡潮路, 加藤惠美子, 高橋美奈子 申請(qǐng)人:株式會(huì)社芳珂