一種單細(xì)胞水平快速鑒定微藻的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及微藻鑒定領(lǐng)域，具體是一種基于單細(xì)胞拉曼光譜的在單細(xì)胞水平快速鑒定微藻的方法。采集微藻細(xì)胞的單細(xì)胞拉曼光譜，建立微藻單細(xì)胞拉曼光譜數(shù)據(jù)庫，根據(jù)未知微藻的單細(xì)胞拉曼光譜與建立的微藻單細(xì)胞拉曼光譜數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)進(jìn)而在單細(xì)胞水平實(shí)現(xiàn)微藻鑒定或突變體篩選。本發(fā)明利用單細(xì)胞拉曼光譜技術(shù)鑒定微藻，提供了一種簡單、快速、非侵入的在單細(xì)胞水平鑒定微藻的方法，為微藻鑒定和突變體篩選提供了一種高效的判別方法。
【專利說明】一種單細(xì)胞水平快速鑒定微藻的方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微藻鑒定領(lǐng)域，具體是一種基于單細(xì)胞拉曼光譜的在單細(xì)胞水平快速鑒定微藻的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]微藻為一類光合自養(yǎng)微生物，能夠利用光能和CO2合成蛋白質(zhì)、糖類、脂質(zhì)、色素等物質(zhì)并放出02 ;微藻種類多、數(shù)量大、繁殖快，是生態(tài)系統(tǒng)中的初級(jí)生產(chǎn)者，是生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)和能量循環(huán)的重要組成部分；同時(shí)微藻在食品、保健、醫(yī)藥、環(huán)保和新型生物燃料煉制領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。例如，小球藻、柵列藻、新月藻、螺旋藻等蛋白質(zhì)含量高，已被用作蛋白質(zhì)來源；小球藻、螺旋藻、杜氏鹽藻、雨生紅球藻等含豐富的不飽和脂肪酸(DHA、EPA),微藻多糖及多種具生理活性蛋白和分子，已被用作功能食品和醫(yī)藥工業(yè)；小球藻、微擬球藻等淀粉、脂質(zhì)含量高，被公認(rèn)為是最有潛力的新型生物燃料的原料供應(yīng)者。
[0003]微藻的分類鑒定是研究微藻的基礎(chǔ)，微藻傳統(tǒng)分類鑒定方法分為形態(tài)學(xué)鑒定法、生化鑒定法和分子生物學(xué)鑒定法。每種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，形態(tài)學(xué)鑒定法主要根據(jù)藻細(xì)胞外部形態(tài)和結(jié)構(gòu)來確定其歸屬，是最傳統(tǒng)和直接的分類鑒定方法。形態(tài)學(xué)鑒定法存在許多制約因素，第一，需要具有豐富經(jīng)驗(yàn)的專業(yè)人員，且費(fèi)時(shí)費(fèi)力；第二，微藻在不同生長階段或條件下，其形態(tài)結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化；第三，大多微藻的鑒定需要經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)，增大了鑒定的難度。生化鑒定法是根據(jù)細(xì)胞內(nèi)以糖類、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子的組成來對(duì)微藻分類鑒定的方法。生化鑒定法需要定量或定性分析細(xì)胞中的微藻“特征化學(xué)成分”，因此需要昂貴的化學(xué)物質(zhì)分離提取和分析儀器；需要經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)，以提取相當(dāng)量的生物大分子；生化特性只是對(duì)傳統(tǒng)分類方法的一個(gè)補(bǔ)充，不是一個(gè)完整的分類體系。分子生物學(xué)分類是通過比較真核生物核糖體rDNA序列的同源性確定其分類地位。分子生物學(xué)鑒定方法由于操作容易、結(jié)果可靠，廣泛應(yīng)用于微藻的分類鑒定，但其仍是基于對(duì)純種微藻群體的分析，無法鑒定復(fù)雜微藻生物群落 中的微藻。
[0004]單細(xì)胞拉曼光譜技術(shù)(Single-Cell Raman Spectroscopy, SCRS)是將光學(xué)囚禁技術(shù)與顯微拉曼光譜技術(shù)相結(jié)合用于檢測細(xì)胞的一項(xiàng)新技術(shù)。拉曼光譜在細(xì)菌種類鑒定上有少許報(bào)道，Susan等應(yīng)用拉曼光譜鑒定牛奶中的布魯氏菌,準(zhǔn)確率達(dá)到94% ；Sandra等應(yīng)用拉曼光譜鑒定了引起尿道感染的微生物，在種水平上，其準(zhǔn)確率為92%。應(yīng)用單細(xì)胞拉曼光譜技術(shù)鑒定微藻還未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種單細(xì)胞水平快速鑒定微藻的方法。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0007]—種單細(xì)胞水平快速鑒定微藻的方法，采集微藻細(xì)胞的單細(xì)胞拉曼光譜，建立微藻單細(xì)胞拉曼光譜數(shù)據(jù)庫，根據(jù)未知微藻的單細(xì)胞拉曼光譜與建立的微藻單細(xì)胞拉曼光譜數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)進(jìn)而在單細(xì)胞水平實(shí)現(xiàn)微藻鑒定或突變體篩選。[0008]進(jìn)一步的說，將不同種類的微藻在不同條件下培養(yǎng)至不同的生長時(shí)期，利用拉曼光鉗捕獲不同種類不同條件下不同生長時(shí)期的微藻單細(xì)胞，同時(shí)瞬間淬滅細(xì)胞內(nèi)的色素，采集細(xì)胞的拉曼光譜，進(jìn)而獲得不同種類微藻中每一種微藻所對(duì)應(yīng)的一組拉曼光譜數(shù)據(jù)，構(gòu)建微藻的拉曼光譜數(shù)據(jù)庫；將未知待測藻株或突變體的拉曼光譜與相應(yīng)的微藻拉曼光譜數(shù)據(jù)庫中的拉曼光譜進(jìn)行比對(duì)進(jìn)而在單細(xì)胞水平實(shí)現(xiàn)微藻鑒定或突變體篩選。
[0009]再進(jìn)一步的說，
[0010]I)將不同種類的微藻細(xì)胞在不同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)至不同的生長時(shí)期；
[0011]2)用ddH20洗凈細(xì)胞，重懸，吸入毛細(xì)管中；
[0012]3 )在顯微視野下用拉曼光鉗捕獲不同種類微藻不同生長時(shí)期的微藻細(xì)胞，采集細(xì)胞的拉曼光譜；并測定細(xì)胞周圍背景的拉曼信號(hào)；
[0013]4)數(shù)據(jù)處理。
[0014]所述步驟中激發(fā)光源波長為532nm，功率為100mW，拉曼光譜采集時(shí)間為2秒。
[0015]所述步驟中數(shù)據(jù)處理包括扣除背景值、基線校準(zhǔn)、歸一化處理等，多維數(shù)據(jù)分析方法為主成分分析(Principal Component Analysis, PCA)、線性判別式分析(LinearDiscriminant Analysis, LDA)、支持向量機(jī)(Support Vector Machine, SVM)分析等。
[0016]同時(shí)可以在單細(xì)胞水平上實(shí)現(xiàn)微藻鑒定和突變體篩選；微藻可為四月藻、筒柱藻、微擬球藻、杜氏鹽藻、三角褐指藻、金藻，也可為四株萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)突變體 CC124, CC4324, CC4333 和 CC4334。
[0017]本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn):
[0018]本發(fā)明利用單細(xì)胞拉曼光譜技術(shù)的簡單、快速、非侵入的在單細(xì)胞水平鑒定微藻。與傳統(tǒng)細(xì)胞鑒定技術(shù)相比，單細(xì)胞拉曼光譜技術(shù)具有以下優(yōu)勢:(1)細(xì)胞是生命活動(dòng)的基本單位，單細(xì)胞拉曼光譜從單細(xì)胞層面鑒定細(xì)胞的種類，樣本需求量小，不需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)以獲得大量的生物質(zhì)，避免群體分析引入的誤差；(2)無需添加化學(xué)染料及其他標(biāo)記，不侵入細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞不產(chǎn)生或產(chǎn)生較少的損傷，因此對(duì)鑒定的細(xì)胞可以分離并再培養(yǎng)；(3)簡單快速，不需要復(fù)雜的分析步驟，每個(gè)細(xì)胞拉曼光譜采集時(shí)間僅為2秒；(4)拉曼光譜反應(yīng)了整個(gè)細(xì)胞中的化學(xué)物質(zhì)指紋圖譜，如核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和糖類等，可用于監(jiān)測細(xì)胞的代謝過程。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的四株萊茵衣藻突變體不同培養(yǎng)條件、不同生長時(shí)期的平均拉曼光譜。
[0020]圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的四株萊茵衣藻突變體基于單細(xì)胞拉曼光譜的PC-LDAscore值圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021]以下的實(shí)施例可以使本專業(yè)【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員更全面的了解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
[0022]本發(fā)明將不同種類的微藻在不同條件下培養(yǎng)(按照常規(guī)技術(shù)以適合各自微藻的培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng))至不同的生長時(shí)期，利用拉曼光鉗捕獲不同種類不同條件下不同生長時(shí)期的微藻單細(xì)胞，同時(shí)瞬間淬滅細(xì)胞內(nèi)的色素，采集細(xì)胞的拉曼光譜，進(jìn)而獲得不同種類微藻中每一種微藻所對(duì)應(yīng)的一組拉曼光譜數(shù)據(jù)，構(gòu)建微藻的拉曼光譜數(shù)據(jù)庫；將未知待測藻株或突變體的拉曼光譜與相應(yīng)的微藻拉曼光譜數(shù)據(jù)庫中的拉曼光譜進(jìn)行比對(duì)進(jìn)而在單細(xì)胞水平實(shí)現(xiàn)微藻鑒定或突變體篩選。
[0023]實(shí)施例
[0024]I)四株萊茵衣藻(Chlamydonomas reinhardtii)突變體 CC124、CC4324、CC4333 和CC4334購自 Chlamydomonas Resource Center:http://chlamycollection.0rg/strains/。
[0025]2)萊茵衣藻分別接種到有氮或缺氮的TAP (Tris acetate phosphate)液體培養(yǎng)基中(3個(gè)生物學(xué)重復(fù))，150 μ mol photons IrTiV1光照，25°C,通氣攪拌培養(yǎng)。培養(yǎng)至Oh、12h、24h、48h、72h和96h時(shí)取樣。其中，有氮或缺氮的TAP液體培養(yǎng)基，TAP(Tris acetatephosphate)培1 養(yǎng)基:
[0026]NH4Cl (7.48mM)，MgSO4 (406 μ Μ)，CaCl2 (340 μ Μ)，K2HPO4 (540 μ Μ)，KH2PO4 (463 μ Μ)，20mM Tris, 17.4mM acetate, H3BO3 (184 μ Μ)，ZnSO4 (76.5 μ Μ)，MnCl2 (25.5 μ Μ)，F(xiàn)eSO4 (17.9μ Μ)，CoCl2 (6.77 μ Μ)，(ΝΗ4) 6Μο7024 (0.88 μ Μ)，CuSO4 (6.29 μ Μ)，and Na2EDTA (148 μ Μ)
[0027]3)取步驟2)不同培養(yǎng)時(shí)間的藻液，每個(gè)樣本取ImL藻液，用ddH20洗滌三次；將藻液吸到扁平毛細(xì)管中(50mm IengthXlmm widthX0.1mm height, Camlab, UK)。
[0028]4)用單細(xì)胞拉曼分選儀(Raman-Activated Cell Sorter, RACS, Wellsens Inc,China)捕捉單細(xì)胞并采集拉曼光譜，激光參數(shù)為100mW、532nm，拉曼采集時(shí)間為2秒，每個(gè)樣本采集20個(gè)細(xì)胞及4個(gè)背景值。
[0029]5)用Labspec5 (HORIBA Scientific)進(jìn)行背景扣除、基線校準(zhǔn)、歸一化處理和求平均值等操作。如圖1所示，為四株萊茵衣藻突變體CC124、CC4324、CC4333和CC4334在有氮(Group N+)或缺氮(Group N-)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)至Oh、12h、24h、48h、72h和96h的平均拉曼圖譜，每條圖譜為60個(gè)細(xì)胞的平均值，范圍為450-1800CHT1和2600-3100011'
[0030]6)對(duì)450-1800CHT1和2600-3100(^1范圍的單細(xì)胞拉曼光譜進(jìn)行主成分分析(Principal Component Analysis, PCA),多個(gè)變量通過線性變換以選出較少個(gè)數(shù)的重要變量。選取8個(gè)變量(變量解釋率為94.66%)，進(jìn)行線性判別式分析(Linear DiscriminantAnalysis, LDA)。圖 2 為四株萊茵衣藻突變體 CC124、CC4324、CC4333 和 CC4334 經(jīng)過PC-LDA分析后得到的Scores值圖，每個(gè)點(diǎn)代表1個(gè)細(xì)胞；圖2可知四株藻株差異明顯，因此通過細(xì)胞的拉曼光譜可以區(qū)分不同的藻株。
[0031]7)四株萊茵衣藻突變體CC124、CC4324、CC4333和CC4334在有氮(Group N+)或缺氮(Group N-)培養(yǎng)條件下(3個(gè)生物學(xué)重復(fù))，培養(yǎng)至12h、24h、48h、72h和96h，每個(gè)樣本隨機(jī)采集20個(gè)細(xì)胞的拉曼光譜，共獲得2400個(gè)細(xì)胞的拉曼光譜；每個(gè)樣本中隨機(jī)抽取15個(gè)細(xì)胞作為訓(xùn)練組，建立微藻的拉曼光譜數(shù)據(jù)庫，共1800個(gè)細(xì)胞建立支持向量機(jī)(SupportVector Machine, SVM)模型；每個(gè)樣本剩余5個(gè)細(xì)胞作為測試組，共600個(gè)細(xì)胞，用已建立的模型預(yù)測測試組細(xì)胞的藻株種類；共進(jìn)行了 10次隨機(jī)分組，每個(gè)模型10倍交叉檢驗(yàn)。表I為鑒定四株藻株的準(zhǔn)確性的靈敏度和特異性；鑒定四株萊茵衣藻突變體藻株的總準(zhǔn)確率為 97.93%。
[0032]表1為本發(fā)明實(shí)施例提供的四株萊茵衣藻突變體基于單細(xì)胞拉曼光譜的SVM (支持向量機(jī)分析)模型的預(yù)測結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種單細(xì)胞水平快速鑒定微藻的方法，其特征在于:采集微藻細(xì)胞的單細(xì)胞拉曼光譜，建立微藻單細(xì)胞拉曼光譜數(shù)據(jù)庫，根據(jù)未知微藻的單細(xì)胞拉曼光譜與建立的微藻單細(xì)胞拉曼光譜數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)進(jìn)而在單細(xì)胞水平實(shí)現(xiàn)微藻鑒定或突變體篩選。
2.按權(quán)利要求1所述的單細(xì)胞水平快速鑒定微藻的方法，其特征在于: 將不同種類的微藻在不同條件下培養(yǎng)至不同的生長時(shí)期，利用拉曼光鉗捕獲不同種類不同條件下不同生長時(shí)期的微藻單細(xì)胞，同時(shí)瞬間淬滅細(xì)胞內(nèi)的色素，采集細(xì)胞的拉曼光譜，進(jìn)而獲得不同種類微藻中每一種微藻所對(duì)應(yīng)的一組拉曼光譜數(shù)據(jù)，構(gòu)建微藻的拉曼光譜數(shù)據(jù)庫；將未知待測藻株或突變體的拉曼光譜與相應(yīng)的微藻拉曼光譜數(shù)據(jù)庫中的拉曼光譜進(jìn)行比對(duì)進(jìn)而在單細(xì)胞水平實(shí)現(xiàn)微藻鑒定或突變體篩選。
3.按權(quán)利要求1或2所述的單細(xì)胞水平快速鑒定微藻的方法，其特征在于: 1)將不同種類的微藻細(xì)胞在不同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)至不同的生長時(shí)期； 2)用ddH20洗凈細(xì)胞，重懸，吸入毛細(xì)管中； 3)在顯微視野下用拉曼光鉗捕獲不同種類微藻不同生長時(shí)期的微藻細(xì)胞，采集細(xì)胞的拉曼光譜；并測定細(xì)胞周圍背景的拉曼信號(hào)； 4)數(shù)據(jù)處理。
4.按權(quán)利要求3所述的單細(xì)胞水平快速鑒定微藻的方法，其特征在于:所述步驟中激發(fā)光源波長為532nm，功率為lOOmW，拉曼光譜采集時(shí)間為2秒。
【文檔編號(hào)】G01N21/65GK103940801SQ201410157736
【公開日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年4月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月17日
【發(fā)明者】徐健, 何曰輝, 籍月彤, 王婷婷, 王允, 黃巍 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所