一種具有生物活性的納米纖維膜的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種具有生物活性的納米纖維膜的制備方法。本發(fā)明將丙烯腈-丙烯酸共聚物配制成N，N-二甲基甲酰胺溶液，將酶配置成酶溶液并加入聚合物紡絲溶液，一起加以高壓電在電極上電紡成纖維膜，制得生物傳感器。本發(fā)明解決了過去方法存在的制作繁瑣、后處理步驟多，制備時(shí)間長或者制備后無法立即投入使用，以及在準(zhǔn)確度、靈敏度、操作穩(wěn)定性、使用壽命、選擇性等方面存在著不足的缺陷。本發(fā)明制備出的生物傳感器穩(wěn)定性好、靈敏度高、重現(xiàn)性好，而所需的酶量少。由于制作方法也非常簡單，所以投入市場的可能性較大。用同一固定材料可制備不同功能的生物傳感器，適合多種酶底物的檢測，可廣泛用于醫(yī)學(xué)、食品、環(huán)境等領(lǐng)域，具有較高的經(jīng)濟(jì)效益。
【專利說明】 一種具有生物活性的納米纖維膜的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于以高分子聚合物包裹、摻雜酶活性分子通過電紡納米纖維膜制備具有生物活性的納米纖維膜電極的方法，特別涉及一種具有生物活性的納米纖維膜的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]生物傳感器的基本原理是基于生物活性材料具有優(yōu)異的分子識別功能，對測定物質(zhì)具有較高的選擇性和靈敏度；生物活性物質(zhì)構(gòu)成分子識別部分，被識別的信息再經(jīng)過信息轉(zhuǎn)換部分以可檢測的信號輸出。生物傳感器核心主要由分子識別和信息轉(zhuǎn)換兩部分組成，其中分子識別部分是指固定化的酶、微生物、抗體、細(xì)胞或組織等，它是生物傳感器的核心。因此生物活性分子的固定化是生物傳感器制備的關(guān)鍵步驟。
[0003]在本發(fā)明之前，現(xiàn)有的固定酶等生物活性分子的方法主要有吸附、交聯(lián)、共價(jià)鍵合、包埋等。但是，這些方法都具有一個(gè)相同的缺點(diǎn)那就是制作繁瑣、后處理步驟多，制備時(shí)間長或者制備后無法立即投入使用，同時(shí)在提高生物傳感器測量的準(zhǔn)確度、靈敏度、操作穩(wěn)定性、使用壽命、選擇性等方面存在著不足和局限。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的就在于克服上述缺陷，提供一種具有生物活性的納米纖維膜的制備方法。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案是:
[0006]一種具有生物活性的納米纖維膜的制備方法，其主要技術(shù)特征在于:將丙烯腈-丙烯酸共聚物配制成N，N- 二甲基甲酰胺溶液，將酶配置成酶溶液并加入聚合物紡絲溶液，一起加以高壓電在電極上電紡成纖維膜，制得生物傳感器。
[0007]所述丙烯腈-丙烯酸共聚物溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6?15%，其粘均分子量為30000?100000，丙烯酸鏈段的含量為1%?5%。
[0008]所述酶溶液需配置成高濃度，移取少量加入聚合物紡絲液中混合均勻。
[0009]所述酶為血紅蛋白酶、多酚氧化酶、葡萄糖氧化酶、黃嘌呤氧化酶、酪氨酸酶、半乳糖氧化酶、脲酸酶、過氧化物酶、膽堿氧化酶、乙酰膽堿脂酶、谷氨酸氧化酶、膽固醇氧化酶、丙酮酸氧化酶、抗壞血酸氧化酶、肌氨酸氧化酶、乙醇脫氫酶、乙醇氧化酶、乳酸脫氫酶、乳酸氧化酶、超氧化物歧化酶、脲酶、賴氨酸氧化酶、亞硫酸鹽氧化酶、漆酶、脂肪酶、異檸檬酸脫氫酶中的任何一種。
[0010]采用本發(fā)明方法制備出的生物傳感器穩(wěn)定性好、靈敏度高、重現(xiàn)性好，而所需的酶量少。由于制作方法也非常簡單，所以投入市場的可能性較大。用同一固定材料可制備不同功能的生物傳感器，適合多種酶底物的檢測，可廣泛用于醫(yī)學(xué)、食品、環(huán)境等領(lǐng)域，具有較高的經(jīng)濟(jì)效益。【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1為靜電紡絲法制備的納米纖維膜的掃描電鏡圖，其中A為同軸靜電紡絲法制備的Hb/P(AN-C0-AA)纖維膜掃描電鏡圖，B為A圖的局部放大圖。(因?yàn)樵撿o電紡絲法制備的不同酶的含有生物活性的納米纖維形貌基本一致，直徑也相仿，故而只挑選Hb/P(AN-co-AA)纖維膜的掃描電鏡作為代表。)
[0012]圖2為靜電紡絲法制備的Hb/P (AN-co-AA)纖維膜電極在磷酸緩中溶液中對H2O2溶液反應(yīng)的時(shí)間電流曲線圖。
[0013]圖3為Hb/P (AN-co-AA)纖維膜電極對H2O2濃度變化的直線部分校正曲線擬合圖。
[0014]圖4為Hb/P (AN-co-AA)纖維膜電極的表觀米氏常數(shù)的線性范圍的直線擬合圖。
[0015]圖5為靜電紡絲法制備的PPO/P (AN-co-AA)纖維膜電極在磷酸緩沖溶液中對兒茶酚溶液反應(yīng)的時(shí)間電流曲線圖。
[0016]圖6為PPO/P (AN-co-AA)纖維膜電極對兒茶酚濃度變化的直線部分校正曲線擬合圖。
[0017]圖7為PPO/P (AN-co-AA)纖維膜電極的表觀米氏常數(shù)的線性范圍的直線擬合圖。
[0018]圖8為靜電紡絲法制備的GOD/P (AN-co-AA)纖維膜電極在磷酸緩中溶液中對葡萄糖溶液反應(yīng)的時(shí)間電流曲線圖。
[0019]圖9為GOD/P (AN-co-AA)纖維膜電極對葡萄糖溶液濃度變化的直線部分校正曲線擬合圖。
[0020]圖10為GOD/P (AN-co-AA)纖維膜電極的表觀米氏常數(shù)的線性范圍的直線擬合圖。【具體實(shí)施方式】
[0021]本發(fā)明的基本思路是:
[0022]用靜電紡絲法制得的纖維比傳統(tǒng)紡絲法制得的纖維細(xì)得多，直徑一般在幾十納米至幾微米之間，且納米纖維膜具有很好的力學(xué)性能、高的比表面積、高孔隙率、高吸附性。丙烯腈-丙烯酸聚合物有非常好的成纖能力，且因?yàn)橐媵然哂泻芎玫纳锵嗳菪?；將酶活性分子摻雜進(jìn)聚合物紡絲溶液中一同靜電紡絲，制備生物傳感器，制備簡單、大大減少了酶的用量、增大了酶的固定量和酶的固定穩(wěn)定性。
[0023]下面具體說明本發(fā)明。
[0024]本發(fā)明采用靜電紡絲法制備納米纖維膜生物傳感器，其主要步驟如下:
[0025]步驟1:采用自由基聚合法合成丙烯腈-丙烯酸共聚物，其粘均分子量為30000?100000，共聚物中丙烯酸鏈段的含量為1%?5%。
[0026]步驟2:將丙烯腈-丙烯酸共聚物配制成濃度為6?15%的N，N- 二甲基甲酰胺溶液，再配置檢測所需的血紅蛋白、多酚氧化酶、葡萄糖氧化酶溶液。
[0027]步驟3:將摻雜有酶的聚合物復(fù)合紡絲溶液，一起加以15KV高壓電、15cm的紡絲距離、20?50%的濕度、室溫下在電極上電紡成纖維膜，即可制得生物傳感器。該方法制備的生物傳感器制備操作簡單，需要的酶量小、固定量高。
[0028]實(shí)施例1:
[0029]制備血紅蛋白酶傳感器
[0030]先將丙烯腈-丙烯酸共聚物配制成濃度為6%的N，N- 二甲基甲酰胺溶液，再用磷酸緩沖溶液配置8mg/ml的血紅蛋白酶溶液，移取100 μ I酶溶液加入聚合物紡絲液，混合均勻后立即紡絲，在15KV電壓、15cm的紡絲距離、40%的濕度、室溫下進(jìn)行靜電紡絲，設(shè)置推注速度為0.3mm/min,紡絲時(shí)間設(shè)為40s,用常規(guī)的玻碳電極(直徑為0.3mm)為接收器，即可制備納米纖維膜生物傳感器。以該電極為工作電極、鉬絲電極為輔助電極、飽和甘汞電極為參比電極，以-0.3V恒定電位，pH為7.0的磷酸緩沖溶液中測定該生物傳感器對H2O2溶液的響應(yīng)。
[0031]該生物傳感器對H2O2的響應(yīng)時(shí)間為10秒；測量H2O2的線性范圍為10?50mM ;檢測限為2.973mM ;靈敏度為0.541mA.Μ-1.cm—2 ;米氏常數(shù)KMapp為46.74mM ;線性相關(guān)度為
0.998 ;傳感器具有較高的操作穩(wěn)定性，在ImM H2O2溶液中連續(xù)測量50次后，響應(yīng)電流基本保持不變，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)僅為3.0%。對應(yīng)于說明附圖1-4，圖1為該靜電紡絲法制備的納米纖維膜的掃描電鏡圖，其中A為同軸靜電紡絲法制備的Hb/P(AN-co-AA)纖維膜掃描電鏡圖，B為A圖的局部放大圖，可以看出該方法制得的納米纖維膜均一度高，直徑在300-400nm之間；圖2可以看出該方法制備的傳感器有較短的響應(yīng)時(shí)間，說明底物可以快速與酶發(fā)生催化反應(yīng)；圖3可以看出低濃度時(shí)催化反應(yīng)為一級反應(yīng)，該方法制備的傳感器催化底物的反應(yīng)有非常好的線性關(guān)系，且測定濃度先行范圍寬，根據(jù)斜率可求出靈敏度；圖4為該方法制得的傳感器米氏常數(shù)測定曲線。
[0032]實(shí)施例2:
[0033]制備多酚氧化酶傳感器
[0034]先將丙烯腈-丙烯酸共聚物配制成濃度為6%的N，N- 二甲基甲酰胺溶液，再用磷酸緩沖溶液配置8mg/ml的多酚氧化酶酶溶液，移取100 μ I酶溶液加入聚合物紡絲液，混合均勻后立即紡絲，在15KV電壓、15cm的紡絲距離、40%的濕度、室溫下進(jìn)行靜電紡絲，設(shè)置推注速度為0.3mm/min,紡絲時(shí)間設(shè)為40s,用常規(guī)的玻碳電極(直徑為0.3mm)為接收器，即可制備納米纖維膜生物傳感器。以該電極為工作電極、鉬絲電極為輔助電極、飽和甘汞電極為參比電極，以-0.2V恒定電位，pH為6.0的磷酸緩沖溶液中測定該生物傳感器對兒茶酚溶液的響應(yīng)。
[0035]該生物傳感器對兒茶酚的響應(yīng)時(shí)間為12秒；測量兒茶酚的線性范圍為0.5nM?250nM ;檢測限為0.28InM ;靈敏度為173.57mA.Μ—1.cm—2 ;米氏常數(shù)KMapp為0.326mM ;線性相關(guān)度為0.998 ;電極制作的重現(xiàn)性好(六支電極同時(shí)制備的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.4% )。對應(yīng)于說明附圖5-7，圖5可以看出該方法制備的傳感器有較短的響應(yīng)時(shí)間，說明底物可以快速與酶發(fā)生催化反應(yīng)；圖6可以看出低濃度時(shí)催化反應(yīng)為一級反應(yīng)，該方法制備的傳感器催化底物的反應(yīng)有非常好的線性關(guān)系，且測定濃度先行范圍寬，根據(jù)斜率可求出靈敏度；圖7為該方法制得的傳感器米氏常數(shù)測定曲線。
[0036]實(shí)施例3:
[0037]制備葡萄糖氧化酶傳感器
[0038]先將丙烯腈-丙烯酸共聚物配制成濃度為6%的N，N- 二甲基甲酰胺溶液，再用磷酸緩沖溶液配置8mg/ml的葡萄糖氧化酶溶液，移取1001酶溶液加入聚合物紡絲液，混合均勻后立即紡絲，在15KV電壓、15cm的紡絲距離、40%的濕度、室溫下進(jìn)行靜電紡絲，設(shè)置推注速度為0.3mm/min，紡絲時(shí)間設(shè)為40s，用常規(guī)的鉬電極(直徑為0.2mm)為接收器，即可制備納米纖維膜生物傳感器。以該電極為工作電極、鉬絲電極為輔助電極、飽和甘汞電極為參比電極，以0.6V恒定電位，pH為7.0的磷酸緩沖溶液中測定該生物傳感器對葡萄糖溶液的響應(yīng)。
[0039]該生物傳感器對薊萄糖的響應(yīng)時(shí)間為10秒；測量葡萄糖的線性范圍為0.5mM?8mM ;檢測限為0.4787M ;靈敏度為1.463mA.Μ—1.cm—2 ;米氏常數(shù)KMapp為6.159mM ;線性相關(guān)度為0.996。對應(yīng)于說明附圖8-10，圖8可以看出該方法制備的傳感器有較短的響應(yīng)時(shí)間，說明底物可以快速與酶發(fā)生催化反應(yīng)；圖9可以看出低濃度時(shí)催化反應(yīng)為一級反應(yīng)，該方法制備的傳感器催化底物的反應(yīng)有非常好的線性關(guān)系，且測定濃度先行范圍寬，根據(jù)斜率可求出靈敏度；圖10為該方法制得的傳感器米氏常數(shù)測定曲線。
[0040]采用同樣的方法還可分別制備成黃嘌呤氧化酶、酪氨酸酶、半乳糖氧化酶、脲酸酶、過氧化物酶、膽堿氧化酶、乙酰膽堿脂酶、谷氨酸氧化酶、膽固醇氧化酶、丙酮酸氧化酶、抗壞血酸氧化酶、肌氨酸氧化酶、乙醇脫氫酶、乙醇氧化酶、乳酸脫氫酶、乳酸氧化酶、超氧化物歧化酶、脲酶、賴氨酸氧化酶、亞硫酸鹽氧化酶、漆酶、脂肪酶、異檸檬酸脫氫酶中的任何一種。
[0041 ] 本發(fā)明所采用的電極為本領(lǐng)域公知的基底電極。
【權(quán)利要求】
1.一種具有生物活性的納米纖維膜的制備方法，其特征在于:將丙烯腈-丙烯酸共聚物配制成N，N-二甲基甲酰胺溶液，將酶配置成酶溶液并加入聚合物紡絲溶液，一起加以高壓電在電極上電紡成纖維膜，制得生物傳感器。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有生物活性的納米纖維膜的制備方法，其特征在于:丙烯腈-丙烯酸共聚物溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6?15%，其粘均分子量為30000?100000，丙烯酸鏈段的含量為1%?5%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有生物活性的納米纖維膜的制備方法，其特征在于:酶溶液需配置成高濃度，移取少量加入聚合物紡絲液中混合均勻。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的一種具有生物活性的納米纖維膜的制備方法，其特征在于:所述酶為血紅蛋白酶、多酚氧化酶、葡萄糖氧化酶、黃嘌呤氧化酶、酪氨酸酶、半乳糖氧化酶、脲酸酶、過氧化物酶、膽堿氧化酶、乙酰膽堿脂酶、谷氨酸氧化酶、膽固醇氧化酶、丙酮酸氧化酶、抗壞血酸氧化酶、肌氨酸氧化酶、乙醇脫氫酶、乙醇氧化酶、乳酸脫氫酶、乳酸氧化酶、超氧化物歧化酶、脲酶、賴氨酸氧化酶、亞硫酸鹽氧化酶、漆酶、脂肪酶、異檸檬酸脫氫酶中的任何一種。
【文檔編號】G01N27/327GK103911768SQ201410157624
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年4月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月17日
【發(fā)明者】薛懷國, 侯玉婷, 劉龍杰, 李丹陽, 虞惠艷 申請人:揚(yáng)州大學(xué)