高通量多通道低豐度生物分子的磁傳感識(shí)別方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種高通量多通道低豐度生物分子的磁傳感識(shí)別方法，屬于生物分子識(shí)別【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明主要針對基于抗原－抗體、細(xì)胞因子－細(xì)胞因子受體、生物活性肽－受體、生物素－親和素、手性分子等系統(tǒng)構(gòu)成的免疫標(biāo)記生物分子檢測、監(jiān)測和識(shí)別方法。以超順磁的磁性粒子和高性能磁傳感器構(gòu)成生物分子探針和探測系統(tǒng)。其可以應(yīng)用于生物、醫(yī)藥和食品安全等應(yīng)用領(lǐng)域，可以進(jìn)行生物分子識(shí)別、檢測和監(jiān)測；臨床疾病診斷；食品安全檢測；病毒和細(xì)菌檢測。
【專利說明】高通量多通道低豐度生物分子的磁傳感識(shí)別方法
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及一種高通量多通道低豐度生物分子的磁傳感識(shí)別方法，屬于生物分子識(shí)別【技術(shù)領(lǐng)域】。其可以應(yīng)用于生物、醫(yī)藥和食品安全等應(yīng)用領(lǐng)域，可以進(jìn)行生物分子識(shí)別、檢測和監(jiān)測；臨床疾病診斷；食品安全檢測；病毒和細(xì)菌檢測。
[0003]
【背景技術(shù)】
[0004]生物分子識(shí)別在RNA鏈識(shí)別，基因檢測，細(xì)菌診斷，新的藥物發(fā)現(xiàn)，DNA缺陷及生物戰(zhàn)中致命毒劑，食品安全和以惡性腫瘤為代表的重大疾病的早期診斷檢測等方面有著廣泛的應(yīng)用。隨著人類基因圖的完成，對過去大量未知基因鏈信息的了解已成為可能。生物分子識(shí)別和檢測已從科學(xué)研究的領(lǐng)域擴(kuò)展至我們現(xiàn)代人類社會(huì)的每一個(gè)角落。
[0005]無標(biāo)記和免疫標(biāo)記是生物分子檢測的兩種主要的方法。無標(biāo)記技術(shù)直接測量生物分子的質(zhì)量和介電性能，從而避免了生物分子的修飾。電荷、折射率、電化學(xué)氧化和質(zhì)譜是無標(biāo)記生物分子檢測常用的測量手段，其中生物質(zhì)譜技術(shù)是最具有廣泛應(yīng)用前景的無標(biāo)志物生物分子檢測技術(shù)。然而，生物質(zhì)譜技術(shù)在多種生物標(biāo)志物的分子量非常接近的情況，通過質(zhì)譜儀直接測量全段標(biāo)志物分子的質(zhì)量并不能實(shí)現(xiàn)可靠的分子識(shí)別。根據(jù)需要，質(zhì)譜還常將某個(gè)肽離子經(jīng)過誘導(dǎo)碰撞碎裂成為更小的碎片離子，通過測量這些碎片離子的質(zhì)荷比和強(qiáng)度，獲得二級或串聯(lián)質(zhì) 譜。此外質(zhì)譜檢測出來的蛋白質(zhì)還需要傳統(tǒng)方法鑒定，小分子量標(biāo)志物分子的檢測難度大，影響因素較多和敏感度相對較低。
[0006]標(biāo)記免疫分析是另一種高靈敏度、高特異性生物分子檢測技術(shù)。因其具有許多獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，已成為生物分子檢驗(yàn)的重要技術(shù)手段。目前生物分子標(biāo)記技術(shù)主要有抗原一抗體、細(xì)胞因子一細(xì)胞因子受體、生物活性肽一受體、生物素一親和素系統(tǒng)等靶向系統(tǒng)。通過不同的靶向途徑，可以將示蹤劑精確地導(dǎo)向生物分子，從而提高生物分子檢靈敏度。由于大多數(shù)生物分子的含量甚微，標(biāo)記生物分子檢測的最大挑戰(zhàn)和關(guān)鍵在于能否擁有探測到極小濃度甚至單生物分子的超高靈敏度的診斷科學(xué)和技術(shù)。
[0007]常見的標(biāo)記生物分子識(shí)別方法是光或電生物信號(hào)探測。電生物分子識(shí)別技術(shù)是轉(zhuǎn)換生物識(shí)別過程到一個(gè)電信號(hào)的探測，通常電流、電阻、電抗及電容的變化。大多數(shù)電生物敏感器利用電化學(xué)反應(yīng)來實(shí)施信號(hào)傳遞。酶分子標(biāo)識(shí)是最常見的用于電化學(xué)生物傳感器方法。當(dāng)用酶標(biāo)識(shí)的分子連接被探測生物分子時(shí)，由于氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生一個(gè)電流，借助于可探測的電流及電流的大小來識(shí)別生物分子與生物分子的量。電生物探測的一個(gè)巨大優(yōu)勢是它能利用現(xiàn)有的集成電路，特別是場效應(yīng)晶體管(FET)來測量電信號(hào)，然而至今的實(shí)驗(yàn)表明，即使運(yùn)用高靈敏納米FET或碳納米管，仍不能探測發(fā)自于10 pi以下生物分子的信號(hào)，所以生物分子探測需要更高靈敏度及準(zhǔn)確的識(shí)別方法。
[0008]用熒光分子或熒光納米晶體標(biāo)識(shí)生物分子和半導(dǎo)體量子點(diǎn)，其探測過程是可見的。直接、簡單和可見的探測過程是生物分子光標(biāo)識(shí)及探測的最大優(yōu)點(diǎn)。通過探測光的波長及強(qiáng)度來確定被探測的生物分子是否存在及量的大小。然而光標(biāo)識(shí)方法探測生物分子有著固有的缺點(diǎn)，即光致脫色及串活干擾。若勵(lì)激激光太強(qiáng)，光對熒光分子的損傷引起熒光特性的丟失，從而檢測失效。同樣光對熒光分子的勵(lì)激，由于雜質(zhì)及背景的存在，可能產(chǎn)生一個(gè)寬的光譜，引起串活干擾。最后，用于熒光探測的激光掃描系統(tǒng)通常體積大、速度慢而且價(jià)格昂貴，不能滿足針對社區(qū)醫(yī)療、農(nóng)村基層醫(yī)療與家庭對重大疾病快速早期診斷和食品安全大規(guī)模篩查的需求。
[0009]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明在思路、材料、器件、技術(shù)途徑等多個(gè)方面均具有明顯的獨(dú)創(chuàng)性。首先在思路上，充分發(fā)揮磁技術(shù)的優(yōu)勢。磁分子探針、磁傳感探測器、標(biāo)識(shí)分子的磁分離、磁流體器件采用全新的“磁”技術(shù)。在材料采用方面，大磁矩超順磁納米粒子材料，磁傳感器包括量子隧穿傳感材料，新的磁粒子和磁傳感表面的包裹和生物功能化材料都是全新和系統(tǒng)的引入。在生物分子識(shí)別和檢測模式上，提出以磁傳感器為核心的單分子高靈敏檢測技術(shù)，將突破以光、聲、影為主要生物分子識(shí)別和檢測技術(shù)的局限性，開辟全新的磁生物分子識(shí)別和檢測技術(shù)。本發(fā)明主要針對基于抗原一抗體、細(xì)胞因子一細(xì)胞因子受體、生物活性肽一受體、生物素一親和素、手性分子等系統(tǒng)構(gòu)成的免疫標(biāo)記生物分子檢測、監(jiān)測和識(shí)別方法。以超順磁的磁性粒子和高性能磁傳感器構(gòu)成生物分子探針和探測系統(tǒng)。
[0011]本發(fā)明的目的是提供了一種高通量多通道低豐度多通道生物分子的磁傳感識(shí)別方法，包括如下步驟:
第I步、磁納米粒子的表面修飾:在磁納米粒子上包覆殼層，所述的殼層的材料是惰性金屬、高分子聚合物或者二氧化硅，得到表面修飾的磁納米粒子；
第2步、磁粒子的表面生物功能化:在第I步所得的表面修飾的磁納米粒子上包覆上鏈霉親和素，得到探測探針；
第3步、磁傳感器薄膜的沉積:利用薄膜真空沉積方法制作磁傳感器薄膜；
第4步、磁傳感器微納米制造:將磁傳感器薄膜制造成傳感器陣列，并在傳感器的兩端安裝釘扎層器件結(jié)構(gòu)；
第5步、標(biāo)定磁傳感器的磁電阻:對第4步制得的傳感器進(jìn)行磁電阻的測定；
第6步、磁量子傳感器的表面修飾:在磁傳感器上依次進(jìn)行金屬氧化物和高分子多表面層的修飾，再在高分子多層表面層上鍵合要檢測的生物分子抗原對應(yīng)的抗體，得到鍵合抗體的磁量子傳感器；
第7步、生物分子與傳感器的偶聯(lián):將設(shè)定濃度的需要檢測的生物分子作為抗原偶聯(lián)在第6步所得的磁量子傳感器的抗體上；
第8步、分析抗體與生物素的偶聯(lián):將要檢測的生物分子抗原對應(yīng)的抗體與生物素偶
聯(lián)；
第9步、將第8步得到的偶聯(lián)生物素的抗體與第7步所得的磁量子傳感器通過抗原-抗體結(jié)合，得到有抗體-抗原-生物素偶聯(lián)抗體的磁量子傳感器；
第10步、探測探針的偶聯(lián):將第2步得到的探測探針偶聯(lián)至第9步中得到有生物素偶聯(lián)的抗體上；
第11步、偶聯(lián)和非偶聯(lián)磁性探針的磁分離:開啟磁場，將沒有和有生物素偶聯(lián)的磁量子傳感器偶聯(lián)的探測探針從傳感器表面分離；
第12步、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以及生物分子的測定:測定第11步所得的磁量子傳感器的磁電阻，與事先在第5步標(biāo)定的磁電阻進(jìn)行比較，得到來自磁探針的響應(yīng)；
第13步、改變抗原的濃度，重復(fù)第7步-第12步，得到抗原的濃度與磁電阻值之間關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
第14步、對待測樣本進(jìn)行測定，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到待測樣本中抗原的濃度。
[0012]本發(fā)明所述的生物分子包括:抗原一抗體、細(xì)胞因子一細(xì)胞因子受體、生物活性肽一受體、生物素一親和素、手性分子等生物分子。
[0013]生物素-親合素系統(tǒng)(BAS)，是七十年代后期發(fā)展起來的一種生物反應(yīng)放大系統(tǒng)。二者具有高度的特異的親和性。生物素為小分子物質(zhì)；親和素有卵白素(又稱親和素)和鏈親和素。生物素與親和素/鏈親和素之間的親和性，至少是抗原(Ag)抗體(Ab)間的一萬倍以，且不易受外界干擾，復(fù)合物穩(wěn)定。二者均可偶聯(lián)蛋白質(zhì)、核、多糖和酶等生物活性物質(zhì)，同時(shí)還能與固相材料結(jié)合，通過這些特性可將它們偶聯(lián)起來。
[0014]生物素-親和素/鏈親和素既可偶聯(lián)生物大分子，又可連接標(biāo)記材料。因此，該方法的應(yīng)用范圍是具有抗原及其對應(yīng)抗體的廣泛標(biāo)本的檢測中，例如:可以用于對蛋白質(zhì)、核酸、多糖、HBsAg, TP、HCV、HIV等生物大分子，也可將其應(yīng)用于生物標(biāo)記物的檢測，例如:對腫瘤標(biāo)志物如前列腺癌(PSA, PAP)，乳腺癌(CA15-3，CA125, CA27.29，CEABRCA1,BRCA2, MUC-1, CEA, NY-BR-1, ING-1),白血病(Chromosomalabnormalities),睪丸癌(a -Fetoprotein (AFP), β -human chor1nic, gonadatropin, CAGE-1, ESO—1)，卵巢癌(CA125, AFP, hCG, p51, CEA),其他固體腫瘤(Circulating tumour cells in b1logicalfluids, express1n of targeted growth factor receptors),結(jié)腸癌和膜腺癌(CEA,CA19-9, CA24-2, p53),肺癌(NY-ESO-l, CEA, CA19-9, SCC, CYFRA21-1, NSE),黑素瘤(Tyrosinase, NY-ESO-l)，肝癌甲胎蛋白(AFP)，CEA,胃癌(CA72-4，CEA, CA19-9)，食道癌(SCC)，滋養(yǎng)層腫瘤(SCC, hCG)，膀胱癌(BAT, FDP, NMP22, HA-Hase, BLCA-4, CYFRA21-1)、前列腺特異性抗原(PSA)等的檢測，和對雌二醇、雌三醇、T3、T4、人促甲狀腺激素等激素類分子的檢測。該方法也可以應(yīng)用于樣本中的細(xì)菌、農(nóng)藥、激素等的檢測。在食品安全檢測中，可以對肉制品、水產(chǎn)品、乳制品、蜂蜜等動(dòng)物源性食品中氯霉素，水產(chǎn)品、乳制品中蓖麻毒素B，魚、蝦等水產(chǎn)品中孔雀石綠，肉、食品中的膠質(zhì)纖維蛋白，牛奶中的葡萄球菌，C2型腸毒素，蔬菜、水果中的氨基甲酸甲酯，肉或肉制品中的肉毒毒素B，畜禽、水產(chǎn)品、組織中的鹽酸克倫特羅，食糖、餅干、自制葡萄酒中的罌粟堿，哺乳動(dòng)物口腔唾液、胃液、反流嘔吐等中的幽門螺桿菌，轉(zhuǎn)基因玉米、大豆中的CryI (Ab)和CP4-EPSPS蛋白，火鍋湯料，調(diào)料，涼皮中的阿片生物堿，米、面包、和餅干中的葡萄球菌等。
[0015]本發(fā)明中所述的磁納米粒子是指:超順磁性Fe3O4或者M(jìn)Fe2O4 (Μ是指Mn、Mg、Fe、Co、Ni或者Zn中的一種),或者是鐵磁性的金屬元素(例如Fe、Co、Ni)或者其合金(例如:FeCo、FeN1、CoNi和三元系(FeCoNi ))，本發(fā)明采用的磁量子顆粒具有小尺寸、單分散、窄尺寸分布、粒徑和形貌可控的其磁化強(qiáng)度和磁化率可調(diào)可控。目前已知和在商業(yè)上很容易獲得多種形式的磁納米粒子。示例包括在US-A-4554088和US-A-3917538中所述的氧化鐵顆粒、如在B1tec.和B1engr.XIX:101-124( 1977)中所述的氧化鎳顆粒、如在US-A-4732811中所述的包含磁顆粒的瓊脂糖-聚醛小球、DYNAL小球(商業(yè)上可獲得的、磁性聚苯乙烯涂覆的小球)、Magogel44 (磁性聚丙烯酰胺-瓊脂糖小球)、如在Clin.Chim.Acta.69:387-396(1976)中所述的ENZACRY (聚M苯二胺/氧化鐵)。包含氧化鐵顆粒的纖維素在Clin.Chem.26:1281-1284 (1980)中介紹，且白蛋白磁微球在 J.1MMUNOL.Methods53:109-122(1982)中介紹。磁多孔玻璃顆粒在W0-A-93/10162中介紹。Fe3O4是已知的和在商業(yè)上很容易獲得的磁納米粒子。MFe2O4磁納米粒子需要通過化學(xué)合成獲得。
[0016]本發(fā)明的超順磁性是指在無外加磁場時(shí)，超順磁性粒子無任何磁性是單相分離的納微米粒子，不會(huì)產(chǎn)生粒子集聚。當(dāng)超順磁性粒子暴露在磁場時(shí)，超順磁性粒子發(fā)生磁化，產(chǎn)生磁偶極子。本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知，一般情況下，在飽和磁化時(shí)，一克5納米超順磁性粒子具有45emu的磁動(dòng)量和每一 5納米超順磁性粒子在飽和磁化下能在I微米的距離處產(chǎn)生3?4 Oe的邊緣場。
[0017]在第I步中，在磁納米粒子上包覆殼層的目的是為了實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的磁性納米粒子的磁學(xué)特性、避免后續(xù)的化學(xué)和生物過程對磁粒子修飾和容易實(shí)現(xiàn)鏈酶親和素和磁性納米粒子的偶聯(lián)。所述的殼層的材料是可以選自惰性金屬、高分子聚合物或者二氧化硅等。這些包覆方法可以采用常規(guī)的化學(xué)方法實(shí)現(xiàn)。例如JfTriton X-100均勻混合，形成透明穩(wěn)定的微乳液體系。再向其中加入Fe3O4，用超聲處理后取出上層液，攪拌使之均勻。加入濃氨水和正硅酸乙酯攪拌10小時(shí)。靜置沉淀，用乙醇清洗，將清洗后的粒子在高溫下鍛燒1-4小時(shí)，收集粒子，得到S12殼修飾的磁納米粒子。
[0018]第2步中，包覆鏈酶親和素的方法可以采用常規(guī)的生物分子偶聯(lián)方法。具體方法分為二個(gè)步驟:首先實(shí)現(xiàn)磁性粒子的氨基膠鏈，然后實(shí)現(xiàn)鏈霉親和素的偶聯(lián)。在惰性金屬、高分子或者氧化硅材料上的氨基膠鏈包覆的方法可采用共性的[N- (2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷](AEAPS)磁性納米粒子表面偶聯(lián)方法。具體方法為:取一定量的S12表面修飾的磁性納米粒子加入到一定量的甲醇和丙三醇的混合溶液中，超聲處理號(hào)；取一定量的AEAPS加入到混合溶液中，超聲處理使溶液混合均勻；在一定溫度下，反應(yīng)2-3個(gè)小時(shí)，然后取出粒子用甲醇清洗和一定溫度下真空干燥兩小時(shí)，收集粒子。鏈霉親和素的偶聯(lián)的具體方法為:用去Rnase酶水配置PB緩沖液(磷酸鹽緩沖溶液)，然后進(jìn)行高壓滅菌。將鏈霉親和素溶于PB溶液中，取一定量裝在EP管中。將修飾好氨基的粒子放入滅菌水中浸泡，用PB緩沖清洗后，再加入PB和超聲分散。以后將修飾好氨基的粒子PB懸濁液加入上述鏈酶親和素溶液，室溫下振蕩反應(yīng)一定時(shí)間。反應(yīng)完全后，向其中加入戊二醛培養(yǎng)。然后用PB緩沖液洗滌多次，最后將粒子分散在PB溶液中，40°C下保存待用。
[0019]本發(fā)明中所述的磁傳感器是指以下傳感器:各向異性磁電阻傳感器(Anisotropicmagnetic resistance, AMR)、電線圈感應(yīng)傳感器(Coil inducted sensor)、巨磁阻傳感器(Giant Magnetoresistance,GMR)和自旋電子隧穿傳感器(Tunneling Magneto Resistance,TMR);從原理上來看，這些傳感器都能用于本發(fā)明的生物分子檢測。傳感器的選擇取決于實(shí)際生物分子檢測量對傳感器靈敏度的要求。在巨磁阻傳感器和自旋電子隧穿傳感器的器件結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)中，為提高靈敏度、信號(hào)輸出和抑制傳感器噪聲，本發(fā)明在巨磁阻和自旋電子隧穿傳感器結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)中在傳感器的兩端引入超晶格反鐵磁釘扎層。超晶格反鐵磁釘扎層由硬磁CoPt/Ru/CoPt材料構(gòu)成，在退火磁化后，超晶格反鐵磁釘扎層提供強(qiáng)的磁釘場，其能夠釘著傳感器自由層中邊緣磁疇的旋轉(zhuǎn)、抑制薄膜磁噪聲從而增強(qiáng)傳感器信號(hào)，這些傳感器經(jīng)優(yōu)化后能提供足夠的供生物分子檢測的靈敏度。
[0020]第3步中，在磁傳感器上依次修飾上金屬氧化物和高分子材料的方法，是用等離子化學(xué)氣相沉積和化學(xué)方法形成。例如:首先用等離子化學(xué)氣相沉積方法在傳感器表面沉積金屬氧化物(Ti02、RuO2, Ta3O5等)，然后用聚烯丙基胺溶液化學(xué)反應(yīng)方法沉積高分子1-乙基-3- (3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和N -羥基琥珀酰亞胺層。在磁傳感器上修飾抗體的方法可以采用常規(guī)的生物滴入、沖洗和偶聯(lián)。首先用移液器在傳感器表面滴入被測量抗原的抗體，在4°C溫度下停放12小時(shí)最后用封閉緩沖液沖洗兩次，并進(jìn)一步在同一緩沖液中和在室溫下阻斷60分鐘。
[0021]第5步中，探測抗體與生物素偶聯(lián)的方法是采用常規(guī)的生物和化學(xué)反應(yīng)方法:用無水DMSO配制生物素N-羥基琥珀酰亞胺酯溶液。探測抗體用硼酸鹽緩沖配制適當(dāng)濃度的抗體溶液，按比率將生物素N-羥基琥珀酰亞胺酯溶液加入抗體中，混合均勻并在室溫下孵育。將抗體溶液用PBS或其他所需的緩沖液透析，以除去未結(jié)合的生物素。
[0022]作為本方法的改進(jìn)，可以在同一個(gè)檢測系統(tǒng)中設(shè)置針對多種目標(biāo)分子的磁納米粒子探針以及修改的磁感應(yīng)器，可以實(shí)現(xiàn)多種目標(biāo)分子的同時(shí)檢測。
[0023]有益效果
本發(fā)明能極大的提高生物分子識(shí)別、檢測和監(jiān)測的靈敏度同時(shí)實(shí)現(xiàn)高通量和多通道的即時(shí)、在位的檢測和監(jiān)測。在檢測靈敏度上，本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)單生物分子的檢測；本發(fā)明構(gòu)建高性能微納磁傳感器陣列(在標(biāo)準(zhǔn)化驗(yàn)薄片上集成10000個(gè)器件，可參見圖8)可對多種生物分子同時(shí)進(jìn)行多通道檢測；由于采用磁傳感檢測、磁分離器件、磁微流體器件、新的生物分子包裹和功能化和微弱電信號(hào)的檢測和處理器件，本發(fā)明極大的提高了檢測的效率，對100個(gè)標(biāo)志物同時(shí)測量的時(shí)間〈10分鐘，實(shí)現(xiàn)高通量的生物分子識(shí)別、檢測和監(jiān)測。
[0024]【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1是磁傳感生物分子檢測原理的示意圖；
圖2是生物分子識(shí)別和探測的磁傳感系統(tǒng)的總體結(jié)構(gòu)；
圖3(a)和圖3 (b)是磁納米粒子表面修飾的示意圖,其中圖3 Ca)是指:磁納米粒子的表面用金屬、高分子聚合物或者二氧化硅的修飾，產(chǎn)生了修飾層，圖3 (b)是指:在磁納米粒子的修飾層上再進(jìn)行表面生物功能化；
圖4是磁納米粒子和探測分子(抗體)的生物偶聯(lián)；
圖5是磁傳感器和超晶格反鐵磁釘扎層器件結(jié)構(gòu)；
圖6是磁傳感器多層超薄金屬氧化物膜和高分子聚合物表面改性；
圖7是捕獲分子和傳感器表面的生物偶聯(lián)；
圖8是磁流體器件的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)；
圖9a是磁場開啟前的微型磁分離系統(tǒng)；
圖9b是磁場開啟后的微型磁分離系統(tǒng) 圖10超晶格反鐵磁釘扎層的傳感器系統(tǒng)
圖11實(shí)施例1中利用這種傳感器檢測乳腺癌生物標(biāo)志物分子的結(jié)果(可檢測Femto M(10 15)濃度的分子)。
[0026]圖12實(shí)施例2中使用傳感器檢測大米中黃曲霉毒素(AFBl)的結(jié)果(可檢測NanoM(10_9)濃度的分子)。
[0027]
【具體實(shí)施方式】
[0028]實(shí)施例1:醫(yī)學(xué)應(yīng)用:乳腺癌標(biāo)志物分子CEA的檢測
整個(gè)的識(shí)別方法的原理示意圖可以如圖1，其顯示了各個(gè)無器件、抗體、抗原之前的連接修飾方式；整個(gè)步驟過程，如圖2所示；
第I步磁納米粒子的合成和表面修飾:
為改善磁粒子的化學(xué)穩(wěn)定性和生物相容性，考慮三維空間結(jié)構(gòu)、氫鍵、靜電力、疏水作用，本發(fā)明在磁納米粒子表面采用包裹惰性金屬、高分子聚合物以及二氧化硅殼層直接表面改性技術(shù)，使磁納米粒子表面具有化學(xué)穩(wěn)定性和優(yōu)異的生物相容性。本實(shí)施例中以Fe3O4磁性粒子為例，具體方法為稱取氯化亞鐵1.2 gFeCl2.4H20溶于60 mL超聲脫氣蒸餾水中，加入15 mL0.6 mo I/L的氯化鐵FeCl3.6H20水溶液。在60 °C、攪拌與超聲作用下，用噴霧器向溶液中噴入2 mol/L的氫氧化鈉NaOH溶液使pH值達(dá)到11?12，反應(yīng)60 min，使所得Fe3O4微粒充分熟化。磁分離Fe3O4微粒并用蒸餾水清洗5次，攪拌，分散Fe3O4微粒于120mL水中，超聲震蕩15 min，加入油酸鈉水溶液，攪拌，于80 °C反應(yīng)30 min,降溫至30 V，再加入十二烷基苯磺酸(SDBS)鈉水溶液，調(diào)節(jié)溶液pH值為7，再反應(yīng)15 min后稀釋到250mL,超聲Imin ,冷卻，即得穩(wěn)定的水基Fe3O4磁性粒子。
[0029]接下來，將Triton X_100(聚乙二醇辛基苯基醚)、正己醇、環(huán)己烷按體積比1:2:5的比例均勻混合，形成透明穩(wěn)定的微乳液體系。再向其中加入0.5g的Fe3O4磁性粒子,用超聲處理6分鐘后取出上層液倒入三頸瓶中，攪拌30分鐘使之均勻。加入Iml濃氨水和3ml正硅酸乙酯30°C攪拌10小時(shí)。靜置沉淀，用乙醇清洗，將清洗后的粒子在400-700°C的條件下鍛燒1-4小時(shí)，收集粒子，得到S12殼修飾的磁納米粒子，如圖3 Ca)所示。
[0030]第2步、磁粒子的表面生物功能化:在第I步所得的S12殼修飾的磁納米粒子上包覆上鏈霉親和素，得到探測探針，首先實(shí)現(xiàn)磁性粒子的氨基膠鏈。包覆的方法采用[N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷](AEAPS)磁性納米粒子表面。
[0031]取20mgSi02表面修飾的磁性納米粒子加入到500mL的甲醇和丙三醇的混合溶液中，超聲30分鐘。用超聲波處理20-60分鐘；取50uL的AEAPS加入到混合溶液中，超聲處理10-60分鐘，使溶液混合均勻；在15-90°C的反應(yīng)條件下，反應(yīng)2-3個(gè)小時(shí)，然后取出粒子用甲醇清洗2-3次，一定溫度下真空干燥兩小時(shí)，收集粒子。
[0032]然后在磁性納米粒子上連接鏈酶親和素。具體方法為用去Rnase酶水配置PB緩沖液(磷酸鹽緩沖溶液)(0.lmol/L,PH=7.0)，進(jìn)行高壓滅菌。將0.5mg的鏈霉親和素(上海生工)溶于0.5mL的PB溶液中，取50 μ L裝在EP管中。將5mg修飾好氨基的粒子放入滅菌水中浸泡，用PB緩沖清洗3次后，再加入ImL PB,超聲分散10 min。將修飾好氨基的粒子PB懸濁液500 μ L，加入50 μ L的上述鏈酶親和素溶液，室溫下振蕩反應(yīng)24h。反應(yīng)完全后，向其中加入I mL的戊二醛培養(yǎng)兩小時(shí)。用PB緩沖液洗滌清洗4次，每次用量為I mL，最后將粒子分散在I mL的PB溶液中，40°C保存待用。[0033]整個(gè)修飾完成后的結(jié)構(gòu)如圖3(b)所示。
[0034]第3步、磁量子傳感器陣列的制造:在磁傳感器上依次進(jìn)行金屬氧化物和高分子多層表面層的修飾，再在高分子多層表面層上鍵合需要檢測的生物分子對應(yīng)的抗體，得到修飾后的磁量子傳感器；金屬氧化物的表面修飾薄膜和磁傳感器多層膜的沉積是用同一PVD (物理氣相沉積)連續(xù)沉積的。金屬氧化物層可以是Ti02、Ta305、Ru0等。
[0035]具體的磁各向異性磁電阻傳感器、電線圈感應(yīng)傳感器、巨磁阻傳感器(GMR)和自旋電子隧穿傳感器(TMR)和金屬氧化物薄膜的具體制作過程是:(1)磁各向異性電阻傳感器:利用磁控濺射在清洗過的熱氧化二氧化硅單晶硅片上沉積100納米磁性材料(N1、Co、Fe、Mn、NiFe, CoFe, NiMn, CoMn, NiFeCoJP NiCoMn)，以后用化學(xué)氣相沉積方法沉積T12 (30nm)層，做后利用半導(dǎo)體工藝將磁各向異性薄膜微制造成120X120微米的微傳感器陣列；(2)電線圈感應(yīng)傳感器:利用電鍍的方法在化學(xué)清洗過的熱氧化二氧化硅單晶硅片上沉積I微米的非磁性的金屬薄膜(Cu、Au、Ag、Al等)，然后在利用半導(dǎo)體工藝將非磁性的金屬薄膜微制造成直徑為100微米的微線圈后，用化學(xué)氣相沉積方法在微線圈上沉積T12 (30nm)層。最后用半導(dǎo)體工藝制作120X120微米的微傳感器陣列；(3)巨磁阻傳感器(GMR)和金屬氧化物薄膜:在清洗過的熱氧化二氧化硅單晶硅片上，通過磁控濺射(Veeco, CMY PVD)依次沉積 CoFe (5nm) /IrMn (7nm) /CoFe (2.5nm) /Ru (8.4nm) /NiFe (3.5nm) /Ta (5nm) /Ru (1nm) /Ta (20nm),以后用化學(xué)氣相沉積方法沉積T12 (30nm)層；然后利用利用半導(dǎo)體工藝技術(shù)同步形成幾十或幾百微米尺寸的微傳感器陣列和在每個(gè)微傳感器兩側(cè)導(dǎo)入超晶格反鐵磁釘扎層器件結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)如圖5所示，最終將GMR薄膜微制造成微傳感器件陣列。(4)自旋電子隧穿傳感器(TMR)和金屬氧化物薄膜:利用Anelva磁控濺射設(shè)備依次沉積作 NiFe (I μ m)/CoFe (2.5nm) /IrMn (5nm) /CoFe (2.lnm) /Ru (0.84nm) /CoFe (2.3nm) /Mg (0.2nm) /MgO (2.5nm) /MgO (0.3nm) /CoFe (2.lnm) /NiFe (2.5nm) /Ta (4.5nm) /Ru (12nm) /Ta (6nm) /T12 (30nm)超晶格TMR結(jié)構(gòu)和金屬氧化物層，T12層是專為生物功能化的金屬氧化物層；然后利用利用半導(dǎo)體工藝技術(shù)同步形成幾十或幾百微米尺寸的微傳感器陣列和在每個(gè)微傳感器兩側(cè)導(dǎo)入超晶格反鐵磁釘扎層器件結(jié)構(gòu)，最終將TMR薄膜微制造成120X120微米的微傳感器件陣列。
[0036]120X120微米尺寸的AMR傳感器具有250歐姆的電阻和在100 Oe磁場下產(chǎn)生1.5%的磁電阻變化；相同尺寸的GMR微傳感器具有700歐姆的電阻和在100 Oe磁場下產(chǎn)生7%的磁電阻變化。TMR微傳感器具有30K歐姆的電阻和在100 Oe磁場下產(chǎn)生45%的磁電阻變化。最后在傳感器的電極引線被電子束蒸發(fā)的三層(S1 20nm/Si3N4 50nm/Si0 20nm)鈍化膜所保護(hù)后，微傳感器被移至進(jìn)一步的表面化學(xué)和生物功能化處理。
[0037]金屬氧化物層和高分子層修飾的目的是消除其他化學(xué)生物環(huán)境對靶分子與目標(biāo)分子相互作用的干擾，實(shí)現(xiàn)對靶分子的特異性相互作用，實(shí)現(xiàn)捕獲抗體分子和感應(yīng)器表面的直接鍵合。
[0038]在對傳感器陣列上進(jìn)行高分子修飾之前，需要測量表面修飾前的傳感器的磁電阻。
[0039]第4步、磁量子傳感器的表面修飾:在高分子層上鍵合檢測生物分子抗原對應(yīng)的抗體的方法是:本實(shí)施例中采用GMR傳感器，在該傳感器T12表面先用丙酮、甲醇、異丙醇清洗，并隨后暴露于氧等離子體3分鐘。在Mill1-Q純凈水(經(jīng)0.22 μ m孔隙的濾膜過濾，電阻率?18.2ΜΩ.cm，25°C)加入2% (重量/體積)聚烯丙基胺溶液。傳感器陣列侵泡在溶液里5分鐘后用Mill1-Q水漂洗三次和150 °C烘烤45分鐘。然后在傳感器表面用移液器滴入10% (重量/體積)1-乙基-3- (3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和10% (重量/體積)N -羥基琥珀酰亞胺溶液，在室溫下放置I小時(shí)后，該傳感器陣列在40°C溫度下干燥和形成制備好的高分子生物功能化的表面，整個(gè)修飾完成的傳感器及表面結(jié)構(gòu)如圖6所示。
[0040]第5步、捕獲抗體與傳感器表面鍵合的化學(xué)方法:用移液器在傳感器表面分三次(每次360pL)滴入總數(shù)InL的CEA抗原的抗體，(從美國R & D system Inc.或中國上海生物化學(xué)購買)用移液器在傳感器表面分三次(每次360pL)滴入總數(shù)InL的CEA捕獲抗體。在控制傳感器部分(沒有捕獲抗體的傳感器)用移液器滴入50mL牛血清白蛋白(bovineserum albumin, BSA)。傳感器芯片然后在4°C溫度下停放12小時(shí)最后用封閉緩沖液(I %BSA和0.2% Tween 20加入PBS)沖洗兩次，并進(jìn)一步在同一緩沖液中和在室溫下阻斷60分鐘。傳感器表面的偶聯(lián)方式一般是放上抗原或抗體、細(xì)胞因子或細(xì)胞因子受體、生物活性肽或受體、生物素或親和素，抗原一抗體、細(xì)胞因子一細(xì)胞因子受體、生物活性肽一受體、生物素一親和素。
[0041]第6步、檢測分子的生物偶聯(lián):將需要檢測的生物分子的抗原偶聯(lián)在第5步所得的抗體上；具體步驟為:被測試生物分子乳腺癌抗原(CEA)分子(從美國R & D system Inc.或中國上海生物化學(xué)購買)首先以PBS緩沖液中稀釋到所需濃度。用移液器滴入20 μ L該分子溶液至傳感器芯片表面并在室溫下孵育I小時(shí)，接著，芯片用封閉緩沖液(I % BSA和
0.2% Tween 20加入PBS)漂洗兩次。
[0042]第7步、探測分子的生物偶聯(lián):先將探測分子的抗體與生物素偶聯(lián):以后與檢測生物分子的抗原偶聯(lián)，形成抗體-抗原-抗體(含有生物素)的三明治結(jié)構(gòu)。首先制備生物素和抗體連接:用無水DMSO配制10mg/ml生物素N-輕基琥拍酰亞胺酯溶液。乳腺癌胚CEA抗原對應(yīng)的抗體(上?？ㄅ锟萍加邢薰?用硼酸鹽緩沖(0.lmol/L, pH8.8)配制濃度至少為I?3mg/ml的抗體溶液，若抗體儲(chǔ)存時(shí)加入了疊氮鈉，則標(biāo)記前須先在硼酸鹽緩沖液中充分透析以除去疊氮鈉。按25?100 μ g/mg的比率將生物素N-羥基琥珀酰亞胺酯溶液加入抗體中，混合均勻并在室溫下孵育4小時(shí)。在完成結(jié)合反應(yīng)之前DMSO的終濃度不能低于5%，否則生物素酯會(huì)出現(xiàn)沉淀。高濃度的生物素酯會(huì)導(dǎo)致多個(gè)生物素分子結(jié)合在抗體上，因此可能會(huì)使所有抗體都被標(biāo)記。較低的比率則會(huì)是使生物素化保持在最低限度(25 μ g生物素酯/mg抗體的最初摩爾比為10:1)。每250 μ g生物素酯內(nèi)加入20 μ mol/L的氯化銨，室溫孵育10分鐘。將抗體溶液用PBS或其他所需的緩沖液透析，以除去未結(jié)合的生物素。由于生物素分子較大，故透析比預(yù)料中的要慢，或者用蛋白A或蛋白G層析柱再次純化抗體。按純化抗體的儲(chǔ)存方法保存標(biāo)記抗體。
[0043]再將生物素偶聯(lián)抗體與磁感應(yīng)器上的抗原連接。具體的方法是:將生物素偶聯(lián)抗體首先以PBS緩沖液中稀釋到所需濃度。用移液器滴入10 μ L該分子溶液至感應(yīng)器表面并在室溫下孵育I小時(shí)，接著，芯片用封閉緩沖液(I% BSA和0.2% Tween 20加入PBS)漂洗三次。
[0044]第8步、探針分子的生物偶聯(lián):第2步產(chǎn)生的帶有鏈霉親和素的磁性探針和第7步中帶有生物素的抗體偶聯(lián)，形成抗體-抗原-抗體(生物素)-磁性針(鏈霉親和素)結(jié)構(gòu)，如圖4所示。具體過程為:鏈酶親和素連接的磁性納米粒子(50/μυ放入磁和水混合的流體系統(tǒng)。磁流體系統(tǒng)循環(huán)速率約100ml/min。10分鐘后，磁流體系統(tǒng)停止運(yùn)行，磁納米粒子在室溫下和無攪拌下孵育20分鐘。這樣完成了在磁量子傳感器上抗體-抗原-抗體=生物素-鏈霉親和素=探測磁性粒子的生物偶聯(lián)，如圖7所示。
[0045]第9步、偶聯(lián)和非偶聯(lián)磁性探針的磁分離:開啟磁場,加電流200mA，產(chǎn)生100e的磁場，沒有和抗體(生物素)偶聯(lián)-的磁性針(鏈霉親和素)從磁量子傳感器表面分離出去。在磁量子傳感器表面只留下實(shí)現(xiàn)了抗體-抗原-抗體(生物素)_磁性針(鏈霉親和素)偶聯(lián)的磁性粒子。應(yīng)用外加磁場進(jìn)行未偶聯(lián)和偶聯(lián)磁探針的分離是一種簡易的物理方法，其優(yōu)勢是避免傳統(tǒng)化學(xué)飄洗帶來的對磁性粒子的化學(xué)腐蝕和磁學(xué)性能的損傷。
[0046]第10步、傳感器檢測:開啟掃描磁場，測試擁有抗體-抗原-抗體(生物素)_磁性針(鏈霉親和素)偶聯(lián)的傳感器和控制傳感器的磁電阻。通過比較得出傳感器的信號(hào)強(qiáng)度和生物分子量的大小。
[0047]利用這種方法，可實(shí)現(xiàn)fL (10_15 molar)量級的CEA檢測，在5個(gè)不同的傳感器芯片上和連續(xù)5次的測量，獲得小于1%精確性。利用這種方法檢測的結(jié)果如圖11所示。
[0048]在圖11中，橫坐標(biāo)是CEA抗原的濃度，單位是Log (摩爾分?jǐn)?shù))，縱坐標(biāo)是GMR傳感器的輸出電壓，單位是Log (電壓(毫伏))，從圖中可以看出，在該濃度范圍內(nèi)，抗原濃度與輸出電壓的對數(shù)值，呈一定的線性關(guān)系，可以通過該方法對該CEA抗原進(jìn)行識(shí)別以及定量分析。
[0049]實(shí)施例2:食品安全應(yīng)用:大米中黃曲霉毒素(AFBl)含量的檢測 第I步磁納米粒子的合成和表面修飾:與實(shí)施例1第I步相同。
[0050]第2步、磁粒子的表面生物功能化:與實(shí)施例1第2步相同。
[0051]第3步、磁量子傳感器陣列的制造:與實(shí)施例1第3步相同，但傳感器陣列的尺寸為 50x50 微米(μπι)。
[0052]第4步、磁量子傳感器的表面修飾:與實(shí)施例1第4步相同。
[0053]第5步、捕獲抗體與傳感器表面鍵合的化學(xué)方法:用移液器在傳感器表面滴入50nL的AFBl抗原的抗體，(美國，Sigma - Aldrich, St.Louis, MO,購買),在控制傳感器部分用移液器滴入50mL牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)?傳感器芯片然后在4°C溫度下停放12小時(shí)最后用封閉緩沖液(1% BSA和0.2% Tween 20加入PBS)沖洗兩次，并進(jìn)一步在同一緩沖液中和在室溫下阻斷60分鐘。
[0054]第6步、檢測分子的生物偶聯(lián):用將黃曲霉毒素AFBl的標(biāo)準(zhǔn)品(美國，Sigma-Aldrich, St.Louis, MO,購買)配置成不同濃度的溶液，樣品通過搖動(dòng)45分鐘，再并用PBS稀釋(溶液:PBS=1:5，V / V，體積比)。用移液器滴入20 μ L該樣品溶液至傳感器芯片表面并在室溫下孵育I小時(shí)，接著，芯片用封閉緩沖液(I% BSA和0.2% Tween 20加入PBS)漂洗兩次。
[0055]第7步、探測分子的生物偶聯(lián):先將探測分子的抗體與生物素偶聯(lián):以后與檢測生物分子的抗原偶聯(lián)，形成抗體-抗原-抗體(含有生物素)的三明治結(jié)構(gòu)。首先制備生物素和抗體連接:用無水DMSO配制10mg/ml生物素N-羥基琥拍酰亞胺酯溶液。AFBl抗原的抗體，(美國，Sigma - Aldrich, St.Louis, MO,購買)用硼酸鹽緩沖(0.2mol/L, ρΗ8.6)配制濃度至少為I~3mg/ml的抗體溶液。按25~100 μ g/mg的比率將生物素N-羥基琥珀酰亞胺酷溶液加入抗體中，混合均勾并在室溫下鮮育4小時(shí)。在完成結(jié)合反應(yīng)之如DMSO的終濃度不能低于5%，否則生物素酯會(huì)出現(xiàn)沉淀。高濃度的生物素酯會(huì)導(dǎo)致多個(gè)生物素分子結(jié)合在抗體上，因此可能會(huì)使所有抗體都被標(biāo)記。較低的比率則會(huì)是使生物素化保持在最低限度(25 μ g生物素酯/mg抗體的最初摩爾比為10:1)。每250 μ g生物素酯內(nèi)加入20μηιο1/L的氯化銨，室溫孵育10分鐘。將抗體溶液用PBS或其他所需的緩沖液透析，以除去未結(jié)合的生物素。由于生物素分子較大，故透析比預(yù)料中的要慢，或者用蛋白A或蛋白G層析柱再次純化抗體。按純化抗體的儲(chǔ)存方法保存標(biāo)記抗體。
[0056]再將生物素偶聯(lián)抗體與磁感應(yīng)器上的抗原連接。具體的方法是:將生物素偶聯(lián)抗體首先以PBS緩沖液中稀釋到所需濃度。用移液器滴入10 μ L該樣品溶液至感應(yīng)器表面并在室溫下孵育I小時(shí)，接著，芯片用封閉緩沖液(I% BSA和0.2% Tween 20加入PBS)漂洗三次。
[0057]第8步、探針分子的生物偶聯(lián):第2步產(chǎn)生的帶有鏈霉親和素的磁性探針和第7步中帶有生物素的抗體偶聯(lián)，形成抗體-抗原-抗體(生物素)-磁性針(鏈霉親和素)結(jié)構(gòu)。具體過程為:鏈酶親和素連接的磁性納米粒子(50/yL)放入磁和水混合的流體系統(tǒng)。磁流體系統(tǒng)循環(huán)速率約100ml/min。10分鐘后，磁流體系統(tǒng)停止運(yùn)行，磁納米粒子在室溫下和無攪拌下孵育20分鐘。這樣完成了在磁量子傳感器上抗體-抗原-抗體=生物素-鏈霉親和素=探測磁性粒子的生物偶聯(lián)。
[0058]第9步、偶聯(lián)和非偶聯(lián)磁性探針的磁分離:開啟磁場,加電流200mA，產(chǎn)生100e的磁場，沒有和抗體(生物素)偶聯(lián)-的磁性針(鏈霉親和素)從磁量子傳感器表面分離出去。在磁量子傳感器表面只留下實(shí)現(xiàn)了抗體-抗原-抗體(生物素)_磁性針(鏈霉親和素)偶聯(lián)的磁性粒子。應(yīng)用外加磁場進(jìn)行未偶聯(lián)和偶聯(lián)磁探針的分離是一種簡易的物理方法，其優(yōu)勢是避免傳統(tǒng)化學(xué)飄洗帶來的對磁性粒子的化學(xué)腐蝕和磁學(xué)性能的損傷，磁場開啟前后的磁傳感器的表面形式圖，如圖9a和圖9b所示，開啟磁場之后，未與磁傳感器結(jié)合的探針器件在流場中被分離。
[0059]第10步、傳感器檢測:開啟掃描磁場，測試擁有抗體-抗原-抗體(生物素)_磁性針(鏈霉親和素)偶聯(lián)的傳感器和控制傳感器的磁電阻。通過比較得出傳感器的信號(hào)強(qiáng)度和生物分子量的大小。
[0060]利用這種方法,可實(shí)現(xiàn)年nL (10_9 molar)量級的AFBl檢測，在5個(gè)不同的傳感器芯片上和連續(xù)5次的測量，獲得小于2%精確性。利用這種方法檢測的結(jié)果如圖12所示。
[0061]在圖12中，橫坐標(biāo)是AFBl抗原的濃度，單位是Log(摩爾分?jǐn)?shù))，縱坐標(biāo)是GMR傳感器的輸出電壓，單位是Log (電壓(毫伏))，從圖中可以看出，在該濃度范圍內(nèi)，抗原濃度與輸出電壓的對數(shù)值，呈一定的線性關(guān)系和大的測量范圍。
[0062]樣品檢測:無污染的大米(從本地市場)研磨后，在渦旋混合器上混合后，加入5ml的溶劑(80%甲醇)，并分別摻入了 10nM、100nM、100nM濃度的黃曲霉毒素AFBl (美國，Sigma - Aldrich, St.Louis, MO,購買),樣品通過搖動(dòng)45分鐘,混合,然后以5000rpm的速率離心10分鐘。將上清液小心地取出并用PBS稀釋(1:5，V/V，體積比)。用移液器滴入20 μ L該樣品溶液至第6步中的傳感器芯片表面并在室溫下孵育I小時(shí)，接著，芯片用封閉緩沖液(I % BSA和0.2% Tween 20加入PBS)漂洗兩次。再依同法進(jìn)行檢測，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算加樣回收率，結(jié)果如表I所示。[0063]表1不同標(biāo)準(zhǔn)品加入量的條件下的檢測回收率
【權(quán)利要求】
1.一種高通量多通道低豐度生物分子的磁傳感識(shí)別方法，其特征在于，包括如下步驟: 第I步、磁納米粒子的表面修飾:在磁納米粒子上包覆殼層，所述的殼層的材料是惰性金屬、高分子聚合物或者二氧化硅，得到表面修飾的磁納米粒子； 第2步、磁粒子的表面生物功能化:在第I步所得的表面修飾的磁納米粒子上包覆上鏈霉親和素，得到探測探針； 第3步、磁傳感器薄膜的沉積:利用薄膜真空沉積方法制作磁傳感器薄膜； 第4步、磁傳感器微納米制造:將磁傳感器薄膜制造成傳感器陣列，并在傳感器的兩端安裝釘扎層器件結(jié)構(gòu)； 第5步、標(biāo)定磁傳感器的磁電阻:對第4步制得的傳感器進(jìn)行磁電阻的測定； 第6步、磁量子傳感器的表面修飾:在磁傳感器上依次進(jìn)行金屬氧化物和高分子多表面層的修飾，再在高分子多層表面層上鍵合要檢測的生物分子抗原對應(yīng)的抗體，得到鍵合抗體的磁量子傳感器； 第7步、生物分子與傳感器的偶聯(lián):將設(shè)定濃度的需要檢測的生物分子作為抗原偶聯(lián)在第6步所得的磁量子傳感器的抗體上； 第8步、分析抗體與生物素的偶聯(lián):將要檢測的生物分子抗原對應(yīng)的抗體與生物素偶聯(lián)； 第9步、將第8步得到的偶聯(lián)生物素的抗體與第7步所得的磁量子傳感器通過抗原-抗體結(jié)合，得到有抗體-抗原-生物素偶聯(lián)抗體的磁量子傳感器； 第10步、探測探針的偶聯(lián):將第2步得到的探測探針偶聯(lián)至第9步中得到有生物素偶聯(lián)的抗體上； 第11步、偶聯(lián)和非偶聯(lián)磁性探針的磁分離:開啟磁場，將沒有和有生物素偶聯(lián)的磁量子傳感器偶聯(lián)的探測探針從傳感器表面分離； 第12步、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以及生物分子的測定:測定第11步所得的磁量子傳感器的磁電阻，與事先在第5步標(biāo)定的磁電阻進(jìn)行比較，得到來自磁探針的響應(yīng)； 第13步、改變抗原的濃度，重復(fù)第7步-第12步，得到抗原的濃度與磁電阻值之間關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線； 第14步、對待測樣本進(jìn)行測定，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到待測樣本中抗原的濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高通量多通道低豐度生物分子的磁傳感識(shí)別方法，其特征在于，所述的生物分子是可以通過免疫學(xué)方法連接的生物大分子、生物標(biāo)記物、細(xì)菌、激素或者農(nóng)藥。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高通量多通道低豐度生物分子的磁傳感識(shí)別方法，其特征在于:所述的磁納米粒子是指:超順磁性Fe3O4或者M(jìn)Fe2O4,所述的M是指Mn、Mg、Fe、Co、Ni或者Zn中的一種；或者是鐵磁性的金屬元素或者其合金,所述的合金是指:FeCo、FeN1、CoNi或者 FeCoNi。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高通量多通道低豐度生物的磁傳感識(shí)別方法，其特征在于，所述的第2步中，是通過AEAPS磁性納米粒子表面偶聯(lián)方法進(jìn)行鏈霉親和素的包覆。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高通量多通道低豐度生物分子的磁傳感識(shí)別方法，其特征在于:所述的磁傳感器是各向異性磁電阻傳感器、電線圈感應(yīng)傳感器、巨磁阻傳感器或者自旋電子隧穿傳感器中的一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高通量多通道低豐度生物分子的磁傳感識(shí)別方法，其特征在于:第3步中，通過等離子化學(xué)氣相沉積法在磁傳感器上修飾金屬氧化物層；通過聚烯丙基胺溶液化學(xué)反應(yīng)方法沉 積高分子層。
【文檔編號(hào)】G01N27/72GK104034881SQ201410213233
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年5月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月20日
【發(fā)明者】章偉, 胡雪峰 申請人:南京益得冠電子科技有限公司