芯片式高通量生物檢測(cè)冷凍均勻進(jìn)樣方法
【專利摘要】一種芯片式高通量生物檢測(cè)冷凍均勻進(jìn)樣方法，包括如下步驟：步驟1：將待測(cè)溶液充分?jǐn)嚢杈鶆颍徊襟E2：將攪拌混勻的待測(cè)液體置于與芯片匹配的容器中；步驟3：冷凍待測(cè)液體，獲得固態(tài)冰片；步驟4：將固態(tài)冰片置于芯片上方，融化后實(shí)現(xiàn)液體均勻進(jìn)入到芯片上的微型孔中。本發(fā)明人工參與少，不依賴復(fù)雜設(shè)備與平臺(tái)，進(jìn)樣準(zhǔn)確，效率高，均勻性好，尤其適用于數(shù)字化PCR檢測(cè)等要求單模板的高通量微反應(yīng)體系。
【專利說(shuō)明】
芯片式高通量生物檢測(cè)冷凍均勻進(jìn)樣方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及芯片式高通量生物檢測(cè)方法中樣品導(dǎo)入領(lǐng)域，尤其涉及一種芯片式高通量生物檢測(cè)冷凍均勻進(jìn)樣方法。
【背景技術(shù)】
[0002]在高通量生物檢測(cè)中，將待檢測(cè)物質(zhì)均勻?qū)敕磻?yīng)位點(diǎn)是整個(gè)檢測(cè)的第一步。待檢測(cè)物進(jìn)入芯片微孔是否均一，占孔率的高低，單模板占孔數(shù)的多少，對(duì)于芯片的利用率、檢測(cè)試驗(yàn)的成功率、檢測(cè)結(jié)果的有效性都十分重要。
[0003]目前的進(jìn)樣方法主要包括手動(dòng)刮液，微流控以及液滴噴打幾種方式。各自的思路分別為:
[0004]手動(dòng)刮液式:將液體滴注到芯片表面，用玻片刮勻，使溶液在玻片的壓力之下逐步進(jìn)入微孔。
[0005]微流控:通過(guò)設(shè)計(jì)帶有微流控功能的芯片，通過(guò)外部壓力及溝道導(dǎo)引使溶液進(jìn)入芯片微孔。
[0006]液滴噴打:通過(guò)精細(xì)的微動(dòng)平臺(tái)及高精度噴頭，精準(zhǔn)生成微升級(jí)的液滴并噴打至芯片微孔。
[0007]現(xiàn)有幾種方法分別存在以下問(wèn)題:首先，手動(dòng)刮液式進(jìn)樣方法對(duì)操作人員要求高，需要十分嚴(yán)謹(jǐn)?shù)挠?xùn)練以及高度專注，同時(shí)難以保證進(jìn)液效果，芯片污染乃至實(shí)驗(yàn)失敗的風(fēng)險(xiǎn)高;其次，微流控芯片導(dǎo)流進(jìn)樣的方式會(huì)明顯增加測(cè)試芯片的成本，且同樣面臨液體流動(dòng)不暢導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)效果被削弱的風(fēng)險(xiǎn);最后，對(duì)于高精度液滴噴打的方式，需要依賴昂貴復(fù)雜的液體打印平臺(tái)，難以在實(shí)際檢測(cè)中廣泛實(shí)施。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明鑒于上述情況而做出，其目的是提供一種芯片式高通量生物檢測(cè)冷凍均勻進(jìn)樣方法，該方法只需要簡(jiǎn)單的操作、利用自然的物理相變過(guò)程，準(zhǔn)確有效地實(shí)現(xiàn)芯片微孔均勻進(jìn)樣。人工參與少，不依賴復(fù)雜設(shè)備與平臺(tái)，進(jìn)樣準(zhǔn)確，效率高，均勻性好，尤其適用于數(shù)字化PCR檢測(cè)等要求單模板的高通量微反應(yīng)體系。
[0009]本發(fā)明提供一種一種芯片式高通量生物檢測(cè)冷凍均勻進(jìn)樣方法，包括如下步驟:
[0010]步驟1:將待測(cè)溶液充分?jǐn)嚢杈鶆颍?br>[0011]步驟2:將攪拌混勻的待測(cè)液體置于與芯片匹配的容器中；
[0012]步驟3:冷凍待測(cè)液體，獲得固態(tài)冰片；
[0013]步驟4:將固態(tài)冰片置于芯片上方，融化后實(shí)現(xiàn)液體均勻進(jìn)入到芯片上的微型孔中。
[0014]本發(fā)明的有益效果是，該方法只需要簡(jiǎn)單的操作、利用自然的物理相變過(guò)程，準(zhǔn)確有效地實(shí)現(xiàn)芯片微孔均勻進(jìn)樣。人工參與少，不依賴復(fù)雜設(shè)備與平臺(tái)，進(jìn)樣準(zhǔn)確，效率高，均勻性好，尤其適用于數(shù)字化PCR檢測(cè)等要求單模板的高通量微反應(yīng)體系。
【附圖說(shuō)明】
[0015]為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明了，下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，其中:
[0016]圖1是本發(fā)明的芯片式高通量生物檢測(cè)冷凍式均勻進(jìn)樣方法操作流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017]應(yīng)該理解的是，這些描述只是示例性的，而并非要限制本發(fā)明的范圍。此外，在以下說(shuō)明中，省略了對(duì)公知結(jié)構(gòu)和技術(shù)的描述，以避免不必要地混淆本發(fā)明的概念。
[0018]請(qǐng)參閱圖1所示，本發(fā)明提供一種芯片式高通量生物檢測(cè)冷凍均勻進(jìn)樣方法，包括如下步驟:
[0019]步驟1:將待測(cè)溶液充分?jǐn)嚢杈鶆颍?br>[0020]步驟2:將攪拌混勻的待測(cè)液體置于與芯片匹配的容器中；
[0021 ]步驟3:冷凍待測(cè)液體，獲得固態(tài)冰片；
[0022]步驟4:將固態(tài)冰片置于芯片上方，融化后實(shí)現(xiàn)液體均勻進(jìn)入到芯片上的微型孔中，所述冰片融化進(jìn)入到芯片上的微型孔中，是常溫融化自然進(jìn)液。
[0023]本發(fā)明提供一種芯片式高通量生物檢測(cè)過(guò)程中冷凍式均勻進(jìn)樣方法，只需要簡(jiǎn)單的操作，不依賴復(fù)雜設(shè)備與平臺(tái)，進(jìn)樣準(zhǔn)確，效率高，均勻性好，尤其適用于數(shù)字化PCR檢測(cè)等要求單模板的高通量微反應(yīng)體系。
[0024]圖1是本發(fā)明的芯片式高通量生物檢測(cè)冷凍均勻進(jìn)樣方法操作流程圖。
[0025]如圖1所示，一種芯片式高通量生物檢測(cè)冷凍均勻進(jìn)樣方法，所述方法包括步驟:
[0026]步驟I，將待測(cè)溶液充分?jǐn)嚢杈鶆颉?br>[0027]通過(guò)溶劑對(duì)待檢物質(zhì)的充分溶解，使之均勻分布于溶液中，獲得自然狀態(tài)下理想的均一性。溶液體積根據(jù)芯片微孔的總?cè)莘e進(jìn)行配置，應(yīng)控制在芯片總?cè)莘e的90%以內(nèi)。
[0028]步驟2，將溶液置于與芯片配套的容器中定型。
[0029]盛放溶液的容器需要具備與芯片形狀相同的底面以及適當(dāng)高度的垂直管壁，目的是將液體定型為與芯片形狀相同的薄片。容器應(yīng)當(dāng)具備可拆卸的功能，或者有塑料膜等與容器隔離，方便拆取。
[0030]步驟3，將待測(cè)溶液冷凍，獲得固態(tài)冰片。
[0031]通過(guò)冷凍的方式將溶液由液態(tài)轉(zhuǎn)為固態(tài)。從而實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)物質(zhì)的直接機(jī)械操作。
[0032]步驟4，將冰片置于芯片上方，融化后實(shí)現(xiàn)溶液均勻進(jìn)孔。
[0033]通過(guò)自然融化使均勻固定在冰片中的待測(cè)物質(zhì)隨著液化而進(jìn)入芯片微孔。
[0034]步驟4中，冰片的轉(zhuǎn)移可以通過(guò)鑷子直接夾取置于芯片上方。
[0035]步驟4中，通常采用室溫將冰片溫和融化，通過(guò)降低溫度減慢融化速度可以使進(jìn)樣過(guò)程更加穩(wěn)定。
[0036]步驟4中，如采用可拆卸或倒扣式容器，可將容器直接置于芯片上方。
[0037]實(shí)施例
[0038]均勻進(jìn)樣是數(shù)字化PCR檢測(cè)的關(guān)鍵步驟。數(shù)字化PCR是一種核酸檢測(cè)和絕對(duì)定量的新方法。同傳統(tǒng)PCR以及qPCR相比，數(shù)字PCR增加了一步分液的操作，將已經(jīng)配好的包含有引物、模板、buffer、酶等組分的PCR反應(yīng)體系分隔成了眾多微小的、獨(dú)立的反應(yīng)體系。在分配的過(guò)程中，引物、酶等組分過(guò)量，而模板則是不過(guò)量的。模板DNA分子隨機(jī)地進(jìn)入到各個(gè)小的反應(yīng)體系中，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后，包含模板的體系完成擴(kuò)增，不包含模板的體系無(wú)擴(kuò)增。模板DNA分子進(jìn)入各個(gè)小的反應(yīng)體系的過(guò)程滿足泊松分布規(guī)律，因此，檢測(cè)擴(kuò)增PCR產(chǎn)物的信號(hào)強(qiáng)度，帶入泊松分布公式計(jì)算，即可計(jì)算出起始模板DNA分子的拷貝數(shù)。在芯片式數(shù)字化PCR中，通過(guò)數(shù)以萬(wàn)計(jì)的芯片微孔實(shí)現(xiàn)分液，由于微孔數(shù)量巨大，可以將制備好的低濃度測(cè)試溶液分隔為單模板，確保真正的單分子擴(kuò)增:即實(shí)現(xiàn)每個(gè)孔徑中最多含有I個(gè)模板，每個(gè)位點(diǎn)中包含DNA模板數(shù)為O或I，實(shí)現(xiàn)真正意義的單分子擴(kuò)增。擴(kuò)增完成后對(duì)包含有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的液滴計(jì)數(shù)，就可以直接得到DNA模板分子數(shù)，實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量。進(jìn)樣過(guò)程的均勻性是實(shí)現(xiàn)單模板的根本保證，同時(shí)也是決定數(shù)字化PCR實(shí)驗(yàn)成敗的第一步。
[0039]本發(fā)明將能夠在進(jìn)行數(shù)字化PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)，實(shí)現(xiàn)反應(yīng)體系的分液過(guò)程自然而均勻，完成檢測(cè)試劑的均勻進(jìn)樣，確保單模板數(shù)字化效果順利實(shí)現(xiàn)。通過(guò)實(shí)際操作發(fā)現(xiàn)，進(jìn)行數(shù)字化PCR實(shí)驗(yàn)采用本發(fā)明方法實(shí)現(xiàn)進(jìn)樣后，可以將試劑溶液以高度的均勻性填充至微孔中，形成一致性非常好的分液效果。
[0040]本發(fā)明的一種芯片式高通量生物檢測(cè)冷凍均勻進(jìn)樣方法，適用于大量微孔位點(diǎn)的芯片式反應(yīng)檢測(cè)應(yīng)用場(chǎng)合。尤其在超高通量生化檢測(cè)問(wèn)題中，一次檢測(cè)采用的微孔數(shù)量達(dá)到數(shù)十上百萬(wàn)，如何保證均勻有效進(jìn)樣對(duì)傳統(tǒng)手段而言挑戰(zhàn)巨大。例如噴打的方式如果重復(fù)上百萬(wàn)次，出錯(cuò)幾率極高。本發(fā)明的方法不受微孔數(shù)量影響，操作簡(jiǎn)便，可靠性高，無(wú)論芯片的孔距、尺寸、深度如何，一律可以用相同方式處理。對(duì)于更大通量的檢測(cè)手段，如ISFET芯片，位點(diǎn)可達(dá)上千萬(wàn)，該方法優(yōu)勢(shì)更加明顯。
[0041]應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明的上述【具體實(shí)施方式】?jī)H僅用于示例性說(shuō)明或解釋本發(fā)明的原理，而不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。因此，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。此外，本發(fā)明所附權(quán)利要求旨在涵蓋落入所附權(quán)利要求范圍和邊界、或者這種范圍和邊界的等同形式內(nèi)的全部變化和修改例。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種芯片式高通量生物檢測(cè)冷凍均勻進(jìn)樣方法，包括如下步驟: 步驟I:將待測(cè)溶液充分?jǐn)嚢杈鶆颍?步驟2:將攪拌混勻的待測(cè)液體置于與芯片匹配的容器中； 步驟3:冷凍待測(cè)液體，獲得固態(tài)冰片； 步驟4:將固態(tài)冰片置于芯片上方，融化后實(shí)現(xiàn)液體均勻進(jìn)入到芯片上的微型孔中。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的芯片式高通量生物檢測(cè)冷凍均勻進(jìn)樣方法，其中所述冰片融化進(jìn)入到芯片上的微型孔中，是常溫融化自然進(jìn)液。
【文檔編號(hào)】G01N1/42GK106018862SQ201610532200
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年7月7日
【發(fā)明人】劉元杰, 俞育德, 劉文文, 魏清泉
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院半導(dǎo)體研究所