一種用于檢測待測溶液中細(xì)胞凋亡程度的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測待測溶液中細(xì)胞凋亡程度的方法，其包括：設(shè)計并合成一段多肽序列，將其牢固修飾于工作電極表面，并通過占位分子使其有序排列，通過該多肽特異性識別待檢測溶液中凋亡細(xì)胞表面的磷脂酰絲氨酸的性質(zhì)，將凋亡細(xì)胞固定于電極表面。由于電極表面覆蓋了一層凋亡細(xì)胞，工作電極的電化學(xué)響應(yīng)會發(fā)生相應(yīng)改變，通過對比檢測前后，其電化學(xué)信號變化的程度，可檢測待測樣品中細(xì)胞凋亡的程度。這種方法避免使用抗原抗體的特異性結(jié)合，可以有效降低檢測成本。
【專利說明】—種用于檢測待測溶液中細(xì)胞凋亡程度的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及電化學(xué)檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種基于多肽識別體系的細(xì)胞凋亡電化學(xué)檢測方法。

【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)胞死亡根據(jù)發(fā)生機(jī)制、誘因、死亡范圍、形態(tài)特征、生化特征等可分為壞死和凋亡。凋亡是細(xì)胞程序性死亡的表現(xiàn)形式，由體內(nèi)外因素誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序，從而導(dǎo)致細(xì)胞主動性死亡，在形態(tài)和生化特征上都有別于壞死，該過程是由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡，不會引起機(jī)體的炎癥反應(yīng)，能夠維持人體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，對整個生物個體正常生長發(fā)育、免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)、機(jī)體清除受損或衰老細(xì)胞起著非常重要的作用。已證實腫瘤發(fā)生的相關(guān)因素如細(xì)胞增殖和死亡的失衡、異常血管形成、腫瘤的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散均與細(xì)胞凋亡的異常有關(guān)。對細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制研究和精確檢測能有助于闡明多種疾病的發(fā)病機(jī)理并為這些疾病治療探索新的方法。
[0003]目前已開發(fā)出多種細(xì)胞凋亡的檢測方法，按照方法學(xué)可將其分為形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)和分子生物學(xué)測定法。流式細(xì)胞分析是目前用于細(xì)胞凋亡分析和檢測較多的方法，它具有以下優(yōu)點:(I)快速靈敏；(2)重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確；(3)可對活體細(xì)胞進(jìn)行分析，結(jié)果真實；(4)可定量檢測凋亡細(xì)胞數(shù)等。然而該方法依賴于大型儀器，且所用試劑十分昂貴，因此仍需開發(fā)一些操作方便，成本低廉的檢測方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種基于多肽識別體系的細(xì)胞凋亡電化學(xué)檢測方法，其根據(jù)修飾于工作電極的特定序列多肽，將凋亡細(xì)胞固定于電極表面，改變工作電極的環(huán)境，根據(jù)電化學(xué)響應(yīng)的變化，定性得出待測溶液中細(xì)胞的凋亡程度。
[0005]本發(fā)明提供一種用于檢測待測溶液中細(xì)胞凋亡程度的方法，將修飾有多肽序列的工作電極插入到待測溶液中，當(dāng)待測溶液中有凋亡細(xì)胞時，凋亡細(xì)胞表面外翻的磷酯酰絲氨酸與多肽序列發(fā)生反應(yīng)，從而使凋亡細(xì)胞固定于工作電極上的多肽序列表面，檢測工作電極的電化學(xué)響應(yīng)值，并與未固定有凋亡細(xì)胞但修飾有多肽序列的工作電極的電化學(xué)響應(yīng)值比較，從而確定待測溶液中細(xì)胞的凋亡程度；所述多肽序列至少包含由人工合成的序列片段 “FNFRLKAGAKIRFG”。
[0006]優(yōu)選的是，所述的用于檢測待測溶液中細(xì)胞凋亡程度的方法，所述多肽序列為FNFRLKAGAKIRFGRGC。
[0007]優(yōu)選的是，所述的用于檢測待測溶液中細(xì)胞凋亡程度的方法，所述多肽序列由固相合成法或液相合成法合成。
[0008]優(yōu)選的是，所述的用于檢測待測溶液中細(xì)胞凋亡程度的方法，工作電極在修飾有多肽序列后、插入待測溶液前加入占位分子，以輔助多肽序列在工作電極表面的有序排布。
[0009]優(yōu)選的是，所述的用于檢測待測溶液中細(xì)胞凋亡程度的方法，所述工作電極為金電極或碳電極。
[0010]優(yōu)選的是，所述的用于檢測待測溶液中細(xì)胞凋亡程度的方法，所述電化學(xué)響應(yīng)通過循環(huán)伏安法或差分脈沖伏安法或交流阻抗法測得。
[0011]本發(fā)明的有益效果是:將多肽-凋亡細(xì)胞識別體系與電化學(xué)技術(shù)有機(jī)結(jié)合，用于細(xì)胞凋亡的定性檢測，它不僅克服了對流式細(xì)胞儀等昂貴儀器的依賴，還避免了抗原抗體等昂貴試劑的使用，極大地降低了檢測成本，有助于相關(guān)疾病的早期診斷。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1為本發(fā)明所述的用于檢測待測溶液中細(xì)胞凋亡程度的方法的流程圖。
[0013]圖2為本發(fā)明所述的電化學(xué)檢測方法中交流阻抗法所得表征數(shù)據(jù)圖譜，其中，(a)裸電極、(b)多肽修飾電極、(C)浸泡正常細(xì)胞后的多肽修飾電極、(d)浸泡凋亡細(xì)胞后的多肽修飾電極。
[0014]圖3為本發(fā)明所述的電化學(xué)檢測方法中的循環(huán)伏安圖，其中，(a)裸電極、(b)多肽修飾電極、(c)浸泡正常細(xì)胞后的多肽修飾電極、(d)浸泡凋亡細(xì)胞后的多肽修飾電極。
[0015]圖4為本發(fā)明所述的電化學(xué)方法檢測不同濃度的雙氧水誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的差分脈沖伏安圖，從上到下濃度依次為0、25、50、80、100μΜ。
[0016]圖5為本發(fā)明所述的電化學(xué)方法檢測不同濃度的雙氧水誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的差分脈沖伏安曲線峰電流與雙氧水濃度的線性關(guān)系圖。

【具體實施方式】
[0017]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實施。
[0018]本發(fā)明提供一種用于檢測待測溶液中細(xì)胞凋亡程度的方法，包括以下步驟:
[0019]步驟I)將多肽序列修飾在工作電極表面，檢測其電化學(xué)響應(yīng)，得到第一響應(yīng)值；
[0020]步驟2)將工作電極浸泡入待測溶液中，當(dāng)待測溶液中含有凋亡細(xì)胞時，利用多肽序列特異性識別凋亡細(xì)胞表面外翻的磷酯酰絲氨酸的性質(zhì)，將凋亡細(xì)胞固定于工作電極上的多肽序列表面，并檢測此時工作電極的電化學(xué)響應(yīng)，得到第二響應(yīng)值；
[0021]步驟3)通過比較第一響應(yīng)值和第二響應(yīng)值來確定待測溶液中細(xì)胞的凋亡程度。
[0022]請參見圖1，其更清晰地表示出了本案的總流程圖，圖中多肽序列為FNFRLKAGAKIRFGRGC,下劃線部分為“核心序列”片段，它可以與凋亡細(xì)胞外翻的磷酯釀絲氨酸特異性結(jié)合，“RGC”片段為“改性序列”，它的作用是通過增加多肽長度，來使得固定于電極表面的“核心序列”和凋亡細(xì)胞在相互作用時不會受到影響。“RGC”片段中C端的半胱氨酸提供巰基基團(tuán)，可以與工作電極如金電極發(fā)生共價反應(yīng)，從而連接到工作電極。多肽序列由人工設(shè)計并合成，可通過固相合成法或液相合成法來合成獲得。
[0023]上述步驟2)中的工作電極在修飾有多肽序列后、插入待測溶液前應(yīng)加入占位分子，占位分子本身具有一定的長度，它是通過小分子的空間位阻效應(yīng)來輔助多肽序列在工作電極表面的有序排布。工作電極可優(yōu)選為金電極或碳電極。電化學(xué)響應(yīng)可以通過循環(huán)伏安法或差分脈沖伏安法或交流阻抗法測得。
[0024]實施例
[0025]本實施例中使用的占位分子為巰基己醇，使用的細(xì)胞為MCF-7，使用的工作電極為金電極。
[0026]1.1、多肽修飾電極的制備
[0027]a、打磨金電極,步驟包括砂紙研磨，不同顆粒大小的三氧化二招衆(zhòng)研磨，乙醇/水超聲，50%硝酸浸泡，0.5M硫酸電化學(xué)清洗等。
[0028]b、金電極浸泡入0.1mM多肽溶液中，反應(yīng)過夜,然后去離子水清洗電極。
[0029]C、接著將電極浸泡0.1mM巰基己醇,反應(yīng)30min,再用去離子水清洗電極。
[0030]1.2、培養(yǎng)細(xì)胞
[0031]MCF-7細(xì)胞使用DMEM培養(yǎng)基(10%血清)培養(yǎng)，溫度為37°C，二氧化碳濃度為5%，細(xì)胞培養(yǎng)到指數(shù)期時，將細(xì)胞消化，清洗以待用。
[0032]1.3、電極表面多肽與凋亡細(xì)胞相互作用
[0033]將多肽修飾電極浸泡入待測細(xì)胞溶液中，孵育I小時，然后清洗干凈，并將其作為工作電極。使用鉬絲電極作為對電極，飽和甘汞電極作為參比電極，構(gòu)建三電極系統(tǒng)。
[0034]凋亡程度高的細(xì)胞溶液中有更多凋亡細(xì)胞結(jié)合到電極表面，阻礙電子傳遞，通過使用交流阻抗、循環(huán)伏安或差分脈沖伏安法檢測工作電極的電化學(xué)響應(yīng)，從而反映細(xì)胞的凋亡程度。
[0035]圖2為交流阻抗法所得表征數(shù)據(jù)圖譜，其中，(a)裸電極、(b)多肽修飾電極、(C)浸泡正常細(xì)胞后的多肽修飾電極、(d)浸泡凋亡細(xì)胞后的多肽修飾電極。由圖可知，多肽修飾電極導(dǎo)致阻抗增大，其浸泡正常細(xì)胞后，由于非特異性吸附，也會造成阻抗一定程度的增大，而多肽修飾電極浸泡凋亡細(xì)胞后，由于多肽特異性捕獲凋亡細(xì)胞，導(dǎo)致阻抗急劇增大。
[0036]圖3為循環(huán)伏安圖，其中，(a)裸電極、(b)多肽修飾電極、(C)浸泡正常細(xì)胞后的多肽修飾電極、(d)浸泡凋亡細(xì)胞后的多肽修飾電極。阻抗越大，循環(huán)伏安圖的峰電流越小。圖3中的循環(huán)伏安圖結(jié)果與圖2中的交流阻抗譜一致。
[0037]圖4為不同濃度的雙氧水誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的差分脈沖伏安圖，從上到下濃度依次為
0、25、50、80、100μΜ。由圖可知，隨著雙氧水濃度的增加，細(xì)胞凋亡程度增加，電化學(xué)系統(tǒng)檢測到的峰電流值也相應(yīng)下降。
[0038]圖5為不同濃度的雙氧水誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的差分脈沖伏安曲線峰電流與雙氧水濃度的線性關(guān)系圖。由圖可知，雙氧水的濃度與峰電流下降值呈正相關(guān)。
[0039]盡管本發(fā)明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列運(yùn)用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細(xì)節(jié)和這里示出與描述的圖例。
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測待測溶液中細(xì)胞凋亡程度的方法，其特征在于，將修飾有多肽序列的工作電極插入到待測溶液中，當(dāng)待測溶液中有凋亡細(xì)胞時，凋亡細(xì)胞表面外翻的磷酯酰絲氨酸與多肽序列發(fā)生反應(yīng)，從而使凋亡細(xì)胞固定于工作電極上的多肽序列表面，檢測工作電極的電化學(xué)響應(yīng)值，并與未固定有凋亡細(xì)胞但修飾有多肽序列的工作電極的電化學(xué)響應(yīng)值比較，從而確定待測溶液中細(xì)胞的凋亡程度；所述多肽序列至少包含由人工合成的序列片段 “FNFRLKAGAKIRFG”。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測待測溶液中細(xì)胞凋亡程度的方法，其特征在于，所述多肽序列為FNFRLKAGAKIRFGRGC。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測待測溶液中細(xì)胞凋亡程度的方法，其特征在于，所述多肽序列由固相合成法或液相合成法合成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測待測溶液中細(xì)胞凋亡程度的方法，其特征在于，工作電極在修飾有多肽序列后、插入待測溶液前加入占位分子，以輔助多肽序列在工作電極表面的有序排布。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測待測溶液中細(xì)胞凋亡程度的方法，其特征在于，所述工作電極為金電極或碳電極。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測待測溶液中細(xì)胞凋亡程度的方法，其特征在于，所述電化學(xué)響應(yīng)通過循環(huán)伏安法或差分脈沖伏安法或交流阻抗法測得。
【文檔編號】G01N27/327GK104049010SQ201410300637
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2014年6月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月27日
【發(fā)明者】繆鵬, 王弼陡, 殷建, 韓坤, 唐玉國 申請人:中國科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所