一種在載玻片表面固定dna堿基的方法
【專利摘要】一種在載玻片表面固定DNA堿基的方法，適用于在載玻片表面固定DNA堿基。將載玻片截成小片，清洗，浸泡在95％HCL和99.7％無水乙醇混合溶液中，酸處理后洗凈；然后將載玻片浸入到APTES無水乙醇溶液中，制備成硅烷化載玻片；將硅烷化載玻片浸入到戊二醛水溶液中，反應(yīng)、沖洗，晾干備用；制備緩沖溶液，在緩沖溶液中加入助溶劑和表面活性劑制備成表面活性劑溶液，加入DNA堿基充分?jǐn)嚢柚镣耆芙?，制成DNA溶液；取DNA溶液在載玻片上點(diǎn)樣，在恒溫箱中溫育，清凈，完成DNA堿基的固定。通過對載玻片的雙重修飾，提高載玻片的潤濕性，從而提高DNA堿基的固定率；采用激光共焦拉曼光譜儀對堿基進(jìn)行表征，可避免因采用熒光等分光法所需的熒光標(biāo)記和基因的擴(kuò)增雜交等步驟，大大簡化了DNA堿基固定步驟。
【專利說明】-種在載玻片表面固定DNA堿基的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種固定DNA堿基的方法，尤其是一種適用于在載玻片表面固定DNA 堿基的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] DNA 是由腺噪呤（A，Adenine)、鳥噪呤（G，Guanine)胞啼陡（C，Cytosine)、胸腺啼 (T，Thymine)四種堿基組成的螺旋結(jié)構(gòu)，其中噪呤堿基是雙環(huán)結(jié)構(gòu)，啼陡堿基是單環(huán)結(jié) 構(gòu)，在DNA分子結(jié)構(gòu)中，由于堿基之間的氫鍵具有固定的數(shù)目和DNA兩條鏈之間的距離保持 不變，使得堿基配對必須遵循一定的規(guī)律，即A = T，G = C。堿基間的這種一一對應(yīng)的關(guān)系 叫做堿基互補(bǔ)配對原則。
[0003] 基于納米孔的第三代基因測序儀或者相關(guān)的關(guān)鍵技術(shù)對于保護(hù)我國自己的基因 資源具有戰(zhàn)略意義。要實(shí)現(xiàn)基因測序技術(shù)，就必須明晰這四種堿基與生物納米孔壁相互作 用的機(jī)理。這一研究的前提是DNA堿基的有效固定，通常選用結(jié)合較為固定的共價(jià)交聯(lián)方 法。
[0004] 目前已經(jīng)有許多方法通過共價(jià)結(jié)合或特異性吸附在玻璃、單晶硅、聚丙乙烯等載 體上，多種官能團(tuán)修飾的表面用于固定DNA堿基。但這些方法涉及高溫（環(huán)氧表面）、制備 試劑昂貴（異硫氰酸酯表面）、不穩(wěn)定（巰基表面）等制約因素。另外，在進(jìn)行DNA堿基固 定率檢測中，基本采用熒光成像分析法，這就要求DNA堿基的熒光標(biāo)記，大大增加了堿基固 定的時(shí)間。因此，尋找制備方法簡便、堿基固定穩(wěn)定且密度高、成本低的載體官能團(tuán)修飾方 法是目前開展堿基特異性作用研究的重要環(huán)節(jié)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 技術(shù)問題：本發(fā)明的目的是克服已有技術(shù)中的不足，提供一種方法簡便、堿基固定 穩(wěn)定且密度高、成本低的在載玻片表面固定DNA堿基的方法。
[0006] 技術(shù)方案：本發(fā)明的在載玻片表面固定DNA堿基的方法，包括如下步驟：
[0007] a.將載玻片截取成10X 10mm的小片，用洗潔精浸泡5min，自來水沖洗1-3次，再 用去離子水超聲清洗5-10min，去離子水沖洗1-3次；
[0008] b.取濃度為30% H202、98% H2S04溶液，按體積比為3:7的比例配制成piranha洗 液，待piranha洗液冷卻至室溫后，將載玻片放入piranha洗液中，加熱至90°C保溫2h，取 出載玻片用蒸餾水洗1-3次；
[0009] C.取濃度為95% HCL、99. 7%無水乙醇溶液，按體積比為1:1的比例混合均勻，將 載玻片浸泡在該溶液中加溫至37°C恒溫，酸處理lh，取出載玻片用去離子水洗凈，完成載 玻片的預(yù)處理，將其保存在蒸餾水中備用，保存期為一周；
[0010] d.將預(yù)先處理后的載玻片浸入到配制好的濃度為1?10%的APTES無水乙醇溶 液中，室溫下反應(yīng)10-30min，制備成娃燒化載玻片，取出娃燒化載玻片用蒸饋水浸洗lmin， 瞭干備用；
[0011] e.將硅烷化載玻片浸入到濃度為10%的戊二醛水溶液中，室溫下反應(yīng)30? 60min，取出后在蒸餾水沖洗3?4次，晾干備用；
[0012] f.制備緩沖溶液，緩沖溶液為磷酸鹽溶液，緩沖溶液的pH為5?11，在緩沖溶液 中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的助溶劑；
[0013] g.選用體積比為1 :1的LAS和ΑΕ0表面活性劑加入到緩沖溶液中制備成濃 度為0.01?2%的表面活性劑溶液，再加入DNA堿基充分?jǐn)嚢柚镣耆芙?，制成濃度?1. 〇-10mg/mlDNA 溶液；
[0014] h.取DNA溶液在載玻片上點(diǎn)樣，在溫度為36°C的恒溫箱中溫育10?12h，用濃度 為0. 2% SDBS溶液清洗2次，再用蒸餾水清洗2-3次，晾干，完成DNA堿基的固定。
[0015] 所述的助溶劑為苯甲酸鈉或水楊酸鈉。
[0016] 有益效果：由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明通過對載玻片進(jìn)行雙重修飾，大大提 高了載玻片的潤濕性，并進(jìn)一步提高了 DNA堿基的固定率，采用激光共焦拉曼光譜儀對堿 基進(jìn)行表征，可避免因采用熒光或可見光線等的分光法所需的熒光標(biāo)記基因的擴(kuò)增和雜交 等一系列步驟，大大簡化了 DNA堿基修飾的步驟。其方法簡便、堿基固定穩(wěn)定且密度高、成 本低，在本【技術(shù)領(lǐng)域】內(nèi)具有廣泛的實(shí)用性。

【具體實(shí)施方式】
[0017] 本發(fā)明的在載玻片表面固定DNA堿基的方法，具體步驟如下：
[0018] a、將載玻片截取成10 X 10mm的小片，用洗潔精浸泡5min，自來水沖洗1-3次，再用 去離子水超聲清洗5-10min，去離子水沖洗1-3次；
[0019] b、取濃度為30% H202、98% H2S04溶液，按體積比為3:7的比例配制成piranha洗 液，待piranha洗液冷卻至室溫后，將載玻片放入piranha洗液中，加熱至90°C保溫2h，取 出載玻片用蒸餾水洗1-3次；
[0020] c、取濃度為95% HCL、99. 7%無水乙醇溶液，按體積比為1:1的比例混合均勻，將 載玻片浸泡在該溶液中加溫至37°C恒溫，酸處理lh，取出載玻片用去離子水洗凈，完成載 玻片的預(yù)處理，將其保存在蒸餾水中備用，保存期為一周；
[0021] d、將預(yù)先處理后的載玻片浸入到配制好的濃度為1?10%的APTES無水乙醇溶液 中，室溫下反應(yīng)10-30min，制備成娃燒化載玻片，取出娃燒化載玻片用蒸饋水浸洗lmin，瞭 干備用，一方面對預(yù)處理的載玻片進(jìn)行硅烷化，另一方面降低載玻片的熒光效應(yīng)；
[0022] e、將硅烷化載玻片浸入到配置好的濃度為10%的戊二醛水溶液中，室溫下反應(yīng) 30?60min，取出后在蒸饋水沖洗3?4次，瞭干備用；
[0023] f、制備緩沖溶液，緩沖溶液為磷酸鹽溶液，緩沖溶液的pH為5?11，緩沖溶液中加 入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為〇. 1 %的助溶劑，以增加 DNA堿基的溶解度，所述的助溶劑為苯甲酸鈉或水楊 酸鈉；
[0024] g、選用體積比為1 :1的LAS和ΑΕ0表面活性劑加入到緩沖溶液中制備成濃度 為0. 01 %?2 %的表面活性劑溶液，再加入DNA堿基充分?jǐn)嚢柚镣耆芙?，制成濃度?1. 0-10mg/mlDNA 的點(diǎn)樣液；
[0025] h、取DNA點(diǎn)樣液在載玻片上點(diǎn)樣，在溫度為36°C的恒溫箱中溫育10?12h，用表 面活性劑溶液清洗2次，再用蒸餾水清洗2-3次，晾干，完成堿基的固定；
[0026] i、采用激光共焦拉曼光譜儀對固定堿基后的載玻片進(jìn)行檢測，分析堿基是否固定 成功；
[0027] j、采用納米力學(xué)測試系統(tǒng)對載玻片進(jìn)行無限接近以及橫向剪切，根據(jù)特異性作用 確定堿基的種類。利用激光共焦拉曼光譜儀檢測堿基是否成功固定，并采用納米力學(xué)測試 系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)對該堿基固定率及固定強(qiáng)度的檢測。
[0028] 注：1、載玻片必須保持清潔，泡酸后須蒸餾水充分水洗；
[0029] 2、新鮮配制溶液須經(jīng)超聲處理，使溶液混合均勻并達(dá)到除氣效果
[0030] 實(shí)施例1、
[0031] 將載玻片截取成10X 1〇_的小片，用洗潔精浸泡5min，自來水沖洗1-3次，再用 去離子水超聲清洗5-10min，去離子水沖洗1-3次；分別取濃度為30% H202、98% &504溶 液，按體積比為3:7的比例配制成piranha洗液，待piranha洗液冷卻至室溫后，將載玻片 放入piranha洗液中，加熱至90°C保溫2h，取出載玻片用蒸餾水洗1-3次；取濃度為95% HCL、99. 7%無水乙醇溶液，按體積比為1:1的比例混合均勻，將載玻片浸泡在該溶液中加 溫至37°C恒溫，酸處理lh，取出載玻片用去離子水洗凈，完成載玻片的預(yù)處理，將其保存在 蒸餾水中備用；將預(yù)先處理后的載玻片浸入到配制好的濃度為1%的APTES無水乙醇溶液 中，室溫下反應(yīng)lOmin，制備成娃燒化載玻片，取出娃燒化載玻片用蒸饋水浸洗lmin，瞭干 備用；將硅烷化載玻片浸入到配置好的濃度為10%的戊二醛水溶液中，室溫下反應(yīng)30min， 取出后在蒸餾水沖洗3?4次，晾干備用；配置pH = 5的磷酸鹽溶液，并加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 1%的苯甲酸鈉，以增加 DNA堿基的溶解度；選用體積比為1 :1的LAS和AEO表面活性劑加 入到緩沖溶液中制備成濃度為0. 02%的表面活性劑溶液，再加入DNA堿基充分?jǐn)嚢柚镣耆?溶解，制成濃度為lmg/mlDNA的點(diǎn)樣液；取DNA點(diǎn)樣液在載玻片上點(diǎn)樣，在溫度為36°C的恒 溫箱中溫育12h，用表面活性劑溶液清洗2次，再用蒸餾水清洗2-3次，晾干，完成堿基的固 定。
[0032] 實(shí)施例2、
[0033] 將載玻片截取成10X 10mm的小片，用洗潔精浸泡5min，自來水沖洗1-3次，再用 去離子水超聲清洗5-10min，去離子水沖洗1-3次；分別取濃度為30% H202、98% &504溶 液，按體積比為3:7的比例配制成piranha洗液，待piranha洗液冷卻至室溫后，將載玻片 放入piranha洗液中，加熱至90°C保溫2h，取出載玻片用蒸餾水洗1-3次；取濃度為95% HCL、99. 7%無水乙醇溶液，按體積比為1:1的比例混合均勻，將載玻片浸泡在該溶液中加 溫至37°C恒溫，酸處理lh，取出載玻片用去離子水洗凈，完成載玻片的預(yù)處理，將其保存在 蒸餾水中備用；將預(yù)先處理后的載玻片浸入到配制好的濃度為5%的APTES無水乙醇溶液 中，室溫下反應(yīng)20min，制備成娃燒化載玻片，取出娃燒化載玻片用蒸饋水浸洗lmin，瞭干 備用；將硅烷化載玻片浸入到配置好的濃度為10%的戊二醛水溶液中，室溫下反應(yīng)45min， 取出后在蒸餾水沖洗3?4次，晾干備用；配置pH = 7的磷酸鹽溶液，并加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 1%的苯甲酸鈉，以增加 DNA堿基的溶解度；選用體積比為1 :1的LAS和AEO表面活性劑加 入到緩沖溶液中制備成濃度為0. 02%的表面活性劑溶液，再加入DNA堿基充分?jǐn)嚢柚镣耆?溶解，制成濃度為5mg/mlDNA的點(diǎn)樣液；取DNA點(diǎn)樣液在載玻片上點(diǎn)樣，在溫度為36°C的恒 溫箱中溫育12h，用表面活性劑溶液清洗2次，再用蒸餾水清洗2-3次，晾干，完成堿基的固 定。
[0034] 實(shí)施例3、
[0035] 將載玻片截取成10X 10mm的小片，用洗潔精浸泡5min，自來水沖洗1-3次，再用 去離子水超聲清洗5-10min，去離子水沖洗1-3次；分別取濃度為30% H202、98% &504溶 液，按體積比為3:7的比例配制成piranha洗液，待piranha洗液冷卻至室溫后，將載玻片 放入piranha洗液中，加熱至90°C保溫2h，取出載玻片用蒸餾水洗1-3次；取濃度為95% HCL、99. 7%無水乙醇溶液，按體積比為1:1的比例混合均勻，將載玻片浸泡在該溶液中加 溫至37°C恒溫，酸處理lh，取出載玻片用去離子水洗凈，完成載玻片的預(yù)處理，將其保存在 蒸餾水中備用；將預(yù)先處理后的載玻片浸入到配制好的濃度為10%的APTES無水乙醇溶液 中，室溫下反應(yīng)30min，制備成娃燒化載玻片，取出娃燒化載玻片用蒸饋水浸洗lmin，瞭干 備用；將硅烷化載玻片浸入到配置好的濃度為10%的戊二醛水溶液中，室溫下反應(yīng)60min， 取出后在蒸餾水沖洗3?4次，晾干備用；配置pH = 11的磷酸鹽溶液，并加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 1%的苯甲酸鈉，以增加 DNA堿基的溶解度；選用體積比為1 :1的LAS和ΑΕ0表面活性劑加 入到緩沖溶液中制備成濃度為0. 02%的表面活性劑溶液，再加入DNA堿基充分?jǐn)嚢柚镣耆?溶解，制成濃度為10mg/mlDNA的點(diǎn)樣液；取DNA點(diǎn)樣液在載玻片上點(diǎn)樣，在溫度為36°C的 恒溫箱中溫育12h，用表面活性劑溶液清洗2次，再用蒸餾水清洗2-3次，晾干，完成堿基的 固定。
【權(quán)利要求】
1. 一種在載玻片表面固定DNA堿基的方法，其特征在于，包括如下步驟： a. 將載玻片截取成10X l〇mm的小片，用洗潔精浸泡5min，自來水沖洗1-3次，再用去 離子水超聲清洗5-10min，去離子水沖洗1-3次； b. 取濃度為30% H202、98% H2S04溶液，按體積比為3:7的比例配制成piranha洗液， 待piranha洗液冷卻至室溫后，將載玻片放入piranha洗液中，加熱至90°C保溫2h，取出載 玻片用蒸餾水洗1-3次； c. 取濃度為95% HCL、99. 7%無水乙醇溶液，按體積比為1:1的比例混合均勻，將載玻 片浸泡在該溶液中加溫至37°C恒溫，酸處理lh，取出載玻片用去離子水洗凈，完成載玻片 的預(yù)處理，將其保存在蒸餾水中備用，保存期為一周； d. 將預(yù)先處理后的載玻片浸入到配制好的濃度為1?10 %的APTES無水乙醇溶液中， 室溫下反應(yīng)10-30min，制備成娃燒化載玻片，取出娃燒化載玻片用蒸饋水浸洗lmin，瞭干 備用； e. 將硅烷化載玻片浸入到濃度為10%的戊二醛水溶液中，室溫下反應(yīng)30?60min，取 出后在蒸餾水沖洗3?4次，晾干備用； f. 制備緩沖溶液，緩沖溶液為磷酸鹽溶液，緩沖溶液的pH為5?11，在緩沖溶液中加 入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的助溶劑； g. 選用體積比為1 :1的LAS和AEO表面活性劑加入到緩沖溶液中制備成濃度 為0. 01?2 %的表面活性劑溶液，再加入DNA堿基充分?jǐn)嚢柚镣耆芙?，制成濃度?1. 〇-10mg/mlDNA 溶液； h. 取DNA溶液在載玻片上點(diǎn)樣，在溫度為36°C的恒溫箱中溫育10?12h，用濃度為 0. 2% SDBS溶液清洗2次，再用蒸餾水清洗2-3次，晾干，完成DNA堿基的固定。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種在載玻片表面固定DNA堿基的方法，其特征在于：所述 的助溶劑為苯甲酸鈉或水楊酸鈉。
【文檔編號】G01N1/28GK104142262SQ201410351542
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2014年7月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月22日
【發(fā)明者】羅勇, 劉秋真, 陳文文, 許浩 申請人:中國礦業(yè)大學(xué)