檢測(cè)血清中抗gp73抗體的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測(cè)血清中抗GP73抗體的試劑盒，屬于醫(yī)藥生物【技術(shù)領(lǐng)域】。所述試劑盒包括GP73蛋白抗原、封閉液、酶標(biāo)的GP73蛋白抗原、兔抗人GP73多克隆抗體標(biāo)準(zhǔn)品、包被緩沖液、顯色液、洗滌液、終止液、稀釋液，其中，所述GP73蛋白抗原具有序列表SEQIDN0:1所示的氨基酸序列。本發(fā)明可以準(zhǔn)確計(jì)算出患者血清內(nèi)的抗GP73抗體的濃度，真實(shí)反應(yīng)出血清中抗GP73抗體的存在水平，可以應(yīng)用于臨床對(duì)原發(fā)性肝癌進(jìn)行診斷，通過對(duì)抗GP73抗體水平進(jìn)行檢測(cè)，還能反映腫瘤自身分子變化的過程，從而判斷患病機(jī)體的自身免疫反應(yīng)能力。本發(fā)明的試劑盒還具有特異性良好，靈敏度、準(zhǔn)確性和精密度高的優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】檢測(cè)血清中抗GP73抗體的試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說，是涉及一種檢測(cè)血清中抗GP73抗體的 試劑盒，以及使用該試劑盒檢測(cè)肝癌患者血清標(biāo)記物抗GP73抗體的檢測(cè)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 肝癌發(fā)病率在全世界是位列第四位、中國位列第二的惡性腫瘤，且在世界范圍內(nèi) 呈逐年上升趨勢(shì)，現(xiàn)總發(fā)病率已超過56萬。肝癌發(fā)病之初較為隱匿，臨床難以檢出，臨床診 斷檢出一般多為晚期，治療效果差，如若早期發(fā)現(xiàn)肝癌并且及時(shí)治療可以提高患者的5年 存活率，因此肝癌的早期發(fā)現(xiàn)具有重要的臨床意義。
[0003]目前肝癌的檢測(cè)手段包括肝超聲影像分析和血清學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)，其中最常使用的 血清學(xué)標(biāo)志物是甲胎蛋白（AFP)，但是AFP在早期肝癌診斷中靈敏度不高，只有50%?60% 的肝癌患者AFP呈陽性，并且慢性肝炎、肝硬化患者等肝癌高危人群也可引起甲胎蛋白的 升高。因此臨床上需要獲得比甲胎蛋白（AFP)特異性和靈敏度更高的新血清學(xué)指標(biāo)，或者 能與AFP進(jìn)行互補(bǔ)的指標(biāo)。
[0004] 近年來，蛋白組學(xué)技術(shù)的發(fā)展使得高通量篩選新的腫瘤標(biāo)志物成為可能，各種有 前景的新腫瘤標(biāo)志物被相繼發(fā)現(xiàn)，其中高爾基體蛋白GP73最有可能成為更好的肝癌診斷， 尤其是早期肝癌診斷的血清標(biāo)志物。
[0005] 目前已經(jīng)有多個(gè)研究組驗(yàn)證了 GP73是一種新的肝癌標(biāo)志物，并有用ELISA方法檢 測(cè)血清中腫瘤相關(guān)標(biāo)記物GP73蛋白含量的報(bào)道。專利申請(qǐng)?zhí)枮?00910041621的中國專利 還公開了一種高爾基蛋白GP73的夾心ELISA定量檢測(cè)方法及其檢測(cè)試劑盒，提高了檢測(cè) GP73的靈敏度和特異性。
[0006] 雖然針對(duì)肝癌病人血清中GP73自身蛋白的檢測(cè)已有相關(guān)報(bào)道，但當(dāng)肝癌組織釋 放腫瘤相關(guān)標(biāo)記物GP73蛋白到血液后，機(jī)體對(duì)該蛋白產(chǎn)生免疫反應(yīng)產(chǎn)生抗體的情況如何， 機(jī)體針對(duì)該蛋白產(chǎn)生抗體對(duì)肝癌的診斷有何作用還未見報(bào)道。檢測(cè)抗體不僅反映的是腫瘤 自身分子變化的過程，更重要的是反映患病機(jī)體的自身免疫反應(yīng)能力，對(duì)后期的診斷和治 療都具有重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的發(fā)明目的在于：利用ELISA技術(shù)建立一種檢測(cè)患者血清中抗GP73抗體的 試劑盒，通過檢測(cè)抗體的水平可以了解患者自身的免疫能力，對(duì)肝癌的診斷和治療具有重 要意義，以彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的研究空白。
[0008] 本發(fā)明實(shí)現(xiàn)上述目的采用的技術(shù)方案如下：
[0009] 提供一種檢測(cè)血清中抗GP73抗體的試劑盒，包括GP73蛋白抗原、封閉液、酶標(biāo)的 GP73蛋白抗原、兔抗人GP73多克隆抗體標(biāo)準(zhǔn)品（320ng/ml)、包被緩沖液、顯色液、洗滌液、 終止液、稀釋液，其中，所述GP73蛋白抗原具有序列表SEQIDN0:1所示的氨基酸序列。
[0010] 其中，上述GP73蛋白抗原的制作方法為：通過構(gòu)建GP73基因工程重組載體，利用 基因工程技術(shù)表達(dá)、純化his-GP73蛋白抗原片段而制得GP73蛋白抗原，其具體步驟如下：
[0011] (1)根據(jù)GP73蛋白抗原基因設(shè)計(jì)引物，包括上游引物
[0012] 5，-GGAACGGTACCCACC
[0013] ATCATCATCATCATCAGGCTGCCCTGTCAGTGAGCCAGGAAAA-3'，下游引
[0014] 5，-GGAACGTCGAC
[0015] TCAGAGTGTATGATTCCGCTTTTCACGCTGATCAAGTAAATT-3'，RT-PCR 擴(kuò)增 GP73 基因，步 驟是：取無菌PCR管，依次加入2XTaqMasterMix25iil，上游引物和下游引物各2iil，H印G2 細(xì)胞總RNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 Ul，ddH20補(bǔ)足至50 u 1 ;將加好的各PCR管輕微離心混勻，放 至PCR儀進(jìn)行反應(yīng)，目的片段大小為330bp ；
[0016] 反應(yīng)條件：95°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸45s，30個(gè)循 環(huán)，72°C終延伸5min，反應(yīng)完畢，取3U1PCR產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定；
[0017] (2)將擴(kuò)增的GP73基因和表達(dá)質(zhì)粒pColdlll經(jīng)過限制性內(nèi)切酶后，用T4DNA連接 酶構(gòu)建重組質(zhì)粒；
[0018] (3)重組子篩選與鑒定：重組子經(jīng)藍(lán)白斑篩選、菌落PCR、雙酶切鑒定、測(cè)序后，測(cè) 序后與GenBank中序列比對(duì)確認(rèn)基因序列是否正確；
[0019] (4)GP73目的蛋白表達(dá)及鑒定：將pColdIII-GP73重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli.BL21，誘 導(dǎo)表達(dá)條件為37°C過夜培養(yǎng)菌液，0D600達(dá)到0. 4-0. 5時(shí)，冷卻到15°C并放置45min，加入 終濃度0. 5mM的IPTG，15°C誘導(dǎo)24h ;SDS_PAGE鑒定GP73蛋白是否成功表達(dá)；
[0020] (5)GP73目的蛋白純化：將IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的基因工程菌超聲破菌，離心，收集上清 過Ni-NTA親和層析柱，電泳鑒定目的蛋白純度，Bradford法測(cè)定蛋白濃度。
[0021] 進(jìn)一步地，上述酶標(biāo)的GP73蛋白抗原的制作方法具體過程如下：
[0022] (l)HRP標(biāo)記試劑盒（商品化試劑盒，武漢三鷹公司產(chǎn)品，_20°C貯存），室溫條件下 平衡30分鐘，使反應(yīng)啟動(dòng)液和反應(yīng)終止液充分解凍后混勻；
[0023] (2)向每10 U 1待標(biāo)記抗原溶液中加入1 U 1反應(yīng)啟動(dòng)液，用移液槍反復(fù)吹打若干 次以充分混勻，避免產(chǎn)生氣泡；
[0024] (3)打開辣根過氧化酶管蓋，將上述已啟動(dòng)抗原溶液直接加到該管中，用移液槍反 復(fù)吹打若干次以充分混勻，避免產(chǎn)生氣泡，室溫放置3小時(shí)；
[0025] (4)向辣根過氧化酶反應(yīng)管中加入反應(yīng)終止液，比例為每10 u 1抗原溶液加入1ml 反應(yīng)終止液，充分混勻，室溫放置1小時(shí)；
[0026] (5)終止完成后，加入與反應(yīng)管內(nèi)反應(yīng)液等體積的甘油，充分混勻，置于_20°C保 存。
[0027] 優(yōu)選地,所述包被緩沖液為pH9. 6、0. 05mol/L碳酸鹽緩沖液。
[0028] 優(yōu)選地，所述顯色液包括A液和B液，A液是稱取3，3'，5，5' -四甲基聯(lián)苯胺 17. 2mg，加二甲基亞砜lml溶解，然后加 0. lmol/L, pH5. 5的醋酸鈉緩沖液66ml制得；B液 是取雙蒸水100ml，加 30% H20217微升制得，顯色液使用時(shí)將A液和B液等體積混勻即可。
[0029]所述洗滌液包含 0. 02mol/LpH7. 4 的 PBS，0. 05% Tween-20。
[0030] 所述稀釋液為0. Olmol/IPBS,終止液為2MH2S04溶液。
[0031] 本發(fā)明還提供了使用上述試劑盒檢測(cè)血清中抗GP73抗體含量的檢測(cè)方法，所述 方法包括以下步驟：
[0032] (1)將兔抗人GP73多克隆抗體標(biāo)準(zhǔn)品（320ng/ml)用0. Olmol/IPBS稀釋液稀分 別釋成160ng/mL、80ng/mL、40ng/mL、20ng/mL、10ng/mL五個(gè)濃度，或?qū)⒋郎y(cè)病人血清稀釋5 倍;
[0033] (2)制作吸光度與抗體濃度關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線：
[0034] ①包被：用包被緩沖液0. 05mol/L碳酸鹽緩沖液（pH9. 6)將GP73蛋白抗原稀釋到 4ng/ml,4°C包被過夜。
[0035] ②封閉：洗滌液洗板，拍干，用封閉液0.5%牛血清白蛋白BSA封閉lh。
[0036] ③加入標(biāo)準(zhǔn)品蛋白或樣品：洗滌液洗板，拍干，向包被板的微孔中加入上述不同稀 釋濃度的兔抗人GP73多克隆抗體標(biāo)準(zhǔn)品50 ill或稀釋的病人血清50 iil，重復(fù)2孔，用封板 膜封板后置37°C溫育30min。
[0037] ④加入酶標(biāo)GP73抗原：洗滌液洗板，拍干，每孔加入酶標(biāo)GP73蛋白抗原50 yl，空 白孔除外。用封板膜封板后置37°C溫育30min。
[0038] ⑤顯色：洗滌液洗板，拍干，每孔先加入顯色劑A50 u 1，再加入顯色劑B50 ii 1，輕 輕震蕩混勻，37 °C避光顯色10分鐘。
[0039] ⑥終止：每孔加終止液50 U 1，終止反應(yīng)。
[0040] ⑦測(cè)定0D值：以空白孔調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（0D值）。測(cè)定應(yīng) 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。
[0041] ⑧繪制濃度和吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線：以吸光度為橫坐標(biāo)，GP73多抗?jié)舛葹榭v坐標(biāo)，繪 制吸光度隨GP73多抗?jié)舛茸兓臉?biāo)準(zhǔn)曲線，將待測(cè)樣品吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線即可求出 病人血清標(biāo)本中的抗GP73抗體濃度值。
[0042] 本發(fā)明人在研究過程中，為了確定血清中抗GP73抗體的水平與肝癌發(fā)病的關(guān) 系，用該試劑盒檢測(cè)了 100例正常對(duì)照組、100例肝炎、肝硬化組（即良性肝病組）、127 例原發(fā)性肝癌組血清的GP73抗體，結(jié)果這三組抗體濃度分別為46. 36 ± 13. 18ng/ml， 140. 34±18. 38ng/ml，259. 23±86. 72ng/ml。原發(fā)性肝癌患者血清中GP73抗體濃度顯著高 于正常組和肝炎、肝硬化組（P < 0. 05)，因此GP73抗體可以作為原發(fā)性肝癌診斷和篩查的 指標(biāo)，測(cè)試GP73抗體水平為肝癌的診斷和篩查提供了一種新的可靠和有效的方法。
[0043] 由于采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果為：
[0044] (1)利用基因工程技術(shù)成功表達(dá)GP73蛋白抗原，并成功對(duì)GP73抗原進(jìn)行HRP標(biāo) 記，所得GP73蛋白抗原與抗His鼠源單克隆抗體和抗GP73抗體都能特異性結(jié)合，將其運(yùn)用 于抗GP73抗體的檢測(cè)，具有很高的醫(yī)學(xué)價(jià)值。
[0045] (2)提供了一種檢測(cè)患者血清中抗GP73抗體的試劑盒，彌補(bǔ)了現(xiàn)有技術(shù)的空白。 使用本發(fā)明的抗GP73抗體檢測(cè)試劑盒可以準(zhǔn)確計(jì)算出患者血清內(nèi)的抗GP73抗體的濃度， 能真實(shí)地反應(yīng)出血清中抗GP73抗體的存在水平，可以應(yīng)用于臨床對(duì)原發(fā)性肝癌進(jìn)行診斷， 通過對(duì)抗GP73抗體水平進(jìn)行檢測(cè)，還能反映腫瘤自身分子變化的過程，從而判斷患病機(jī)體 的自身免疫反應(yīng)能力。本發(fā)明的試劑盒特異性良好，靈敏度達(dá)77. 4%、準(zhǔn)確性達(dá)84. 58%, 相比于AFP的敏感性50-60%，本發(fā)明的試劑盒有顯著提高。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0046] 本發(fā)明將通過例子并參照附圖的方式說明，其中：
[0047] 圖1為純化的GP73蛋白的SDS-PAGE電泳圖，其中，M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1 :沒有經(jīng)柱層 析純化的樣品溶液；2:樣品上層析柱后，未結(jié)合在層析柱上的雜蛋白流出液；3:用不含咪 唑的洗脫液洗脫出來的蛋白；4-9:分別用含有20mM，40mM, 60mM, 80mM, lOOmM, 150mM咪唑的 洗脫液洗脫出來的蛋白。
[0048] 圖2為基因工程表達(dá)的GP73蛋白與抗GP73抗體結(jié)合的WesternBlot分析結(jié)果， 其中，M :蛋白標(biāo)記物；
[0049] 1 ：pColdIII-GP73基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Transetta(DE3)工程菌，未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的 蛋白分析；
[0050] 2 ：pColdIII-GP73基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Transetta(DE3)工程菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的 蛋白分析；
[0051] 3:pColdIII-GP73基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BL21工程菌，未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)目的蛋白分析；
[0052] 4:pColdIII-GP73基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BL21工程菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后目的蛋白分析；
[0053] 5:空質(zhì)粒pColdlll轉(zhuǎn)染Transetta(DE3)工程菌，未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的蛋白分析；
[0054] 6:空質(zhì)粒pColdlll轉(zhuǎn)染Transetta(DE3)工程菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的蛋白分析；
[0055] 7:空質(zhì)粒pColdlll轉(zhuǎn)染BL21工程菌，未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的蛋白分析；
[0056] 8:空質(zhì)粒pColdlll轉(zhuǎn)染BL21工程菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的蛋白分析。
[0057] 圖3為吸光度隨兔抗人GP73多克隆抗體標(biāo)準(zhǔn)品濃度變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0058] 圖4為GP73自身抗體在正常組、良性肝病組、原發(fā)性肝癌組的表達(dá)值（ng/ml)。

【具體實(shí)施方式】
[0059] 本發(fā)明提供了一種檢測(cè)血清中抗GP73抗體的試劑盒，包括GP73蛋白抗原、封閉 液、酶標(biāo)的GP73蛋白抗原、兔抗人GP73多克隆抗體標(biāo)準(zhǔn)品（320ng/ml)、包被緩沖液、顯色 液、洗滌液、終止液、稀釋液。本發(fā)明試劑盒自主創(chuàng)新的兩個(gè)試劑是GP73蛋白抗原和酶標(biāo)抗 原?？乖前l(fā)明人通過基因工程技術(shù)表達(dá)純化出來，酶標(biāo)抗原是自主標(biāo)記。其余試劑為商 品化試劑。
[0060] 本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，會(huì)提供GP73蛋白抗原的制備方法。
[0061] 酶標(biāo)的GP73蛋白抗原是用辣根過氧化酶標(biāo)記GP73而獲得的，在本發(fā)明的一些實(shí) 施方案中，還提供酶標(biāo)的GP73蛋白抗原的具體制備過程。
[0062] 本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，還提供了利用該抗GP73抗體的試劑盒的來檢測(cè)肝癌 患者血清中抗GP73抗體濃度的檢測(cè)方法。
[0063] 以下通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述。
[0064] 實(shí)施例1檢測(cè)血清中抗GP73抗體的試劑盒的制備方法
[0065] 1、制作GP73蛋白抗原
[0066] 本發(fā)明的試劑盒中的GP73蛋白抗原是由人工合成，構(gòu)成GP73蛋白的氨基酸序列 表如SEQIDN0:1所示。本發(fā)明中GP73蛋白抗原的制備過程如下：
[0067] (1)根據(jù)GP73蛋白抗原的基因設(shè)計(jì)引物，包括上游引物SEQID N0:3 :5' -GGAACGGT ACCCACCATCATCATCATCATCAGGCTGCCCTGTCAGTGAGCCAGGAAAA-3'，下游引物 SEQIDN0:4 :5' -G GAACGTCGACTCAGAGTGTATGATTCCGCTTTTCACGCTGATCA
[0068] AGTAAATT-3'，用RT-PCR擴(kuò)增GP73基因，具體步驟是：取無菌PCR管，依次加入 2XTaqMasterMix25u 1,上游引物和下游引物各2 yl，IfepG2細(xì)胞總RNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 liil，ddH20補(bǔ)足至50iU ;將加好的各PCR管輕微離心混勻，放至PCR儀進(jìn)行反應(yīng)，目的片段 大小為330bp ;反應(yīng)條件：95°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，60°C退火30s，72。。延伸45s，30 個(gè)循環(huán)，72°C終延伸5min，反應(yīng)完畢，取3U1PCR產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定；
[0069] (2)將擴(kuò)增的GP73基因和表達(dá)質(zhì)粒pColdlll經(jīng)過限制性內(nèi)切酶后，用T4DNA連接 酶構(gòu)建重組質(zhì)粒；
[0070] (3)重組子篩選與鑒定：重組子經(jīng)藍(lán)白斑篩選、菌落PCR、雙酶切鑒定、測(cè)序。測(cè)序 結(jié)果表明基因提取完全正確，證實(shí)成功構(gòu)建pColdIII-GP73重組質(zhì)粒；
[0071] (4)GP73目的蛋白表達(dá)及鑒定：將pColdIII-GP73重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli.BL21，最 佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為37°C過夜培養(yǎng)菌液，0D600達(dá)到0. 4-0. 5時(shí)，冷卻到15°C并放置45min， 加入終濃度0. 5mM的IPTG，15°C誘導(dǎo)24h，SDS_PAGE鑒定發(fā)現(xiàn)目的蛋白主要出現(xiàn)在上清中， 說明GP73蛋白主要以可溶性形式表達(dá)電泳結(jié)果見圖1所示，顯示用60mM和80mM咪唑進(jìn)行 洗脫時(shí)目的蛋白純度最高。
[0072] (5)GP73目的蛋白純化：將IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的基因工程菌超聲破菌，離心，收集上 清過Ni-NTA親和層析柱，電泳鑒定目的蛋白純度可達(dá)85% ;質(zhì)譜鑒定證實(shí)所獲得蛋白為 His-GP73融合蛋白；用Bradford法進(jìn)行濃度測(cè)定測(cè)得蛋白濃度為57ng/yl ；
[0073] westernblot結(jié)果顯示目的條帶與抗His鼠源單克隆抗體和抗GP73抗體都能 特異性結(jié)合（如圖2所示），表明表達(dá)純化的GP73蛋白具有抗原性，圖中還可以看出， pColdIII-GP73基因重組質(zhì)粒經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，有較多目的蛋白與抗GP73抗體結(jié)合。
[0074] 2、制備酶標(biāo)的GP73抗原
[0075] 本發(fā)明優(yōu)選采用辣根過氧化酶標(biāo)記GP73抗原，其制作的具體過程如下：
[0076] (l)HRP標(biāo)記試劑盒（商品化試劑盒，武漢三鷹公司產(chǎn)品，_20°C貯存），室溫條件下 平衡30分鐘，使反應(yīng)啟動(dòng)液和反應(yīng)終止液充分解凍后混勻；
[0077] (2)向每10 U 1待標(biāo)記抗原溶液中加入1 U 1反應(yīng)啟動(dòng)液，用移液槍反復(fù)吹打若干 次以充分混勻，避免產(chǎn)生氣泡；
[0078] (3)打開辣根過氧化酶管蓋，將上述已啟動(dòng)抗原溶液直接加到該管中，用移液槍反 復(fù)吹打若干次以充分混勻，避免產(chǎn)生氣泡，室溫放置3小時(shí)；
[0079] (4)向辣根過氧化酶反應(yīng)管中加入反應(yīng)終止液，比例為每10 u 1抗原溶液加入lml 反應(yīng)終止液，充分混勻，室溫放置1小時(shí)；
[0080] (5)終止完成后，加入等體積的甘油，充分混勻，置于_20°C保存。
[0081] 3、試劑盒其他溶劑的配制：
[0082] 兔抗人GP73多克隆抗體標(biāo)準(zhǔn)品：濃度為320ng/ml，購于武漢三鷹生物技術(shù)公司；
[0083] 封閉液：0. 5%牛血清白蛋白（BSA)；
[0084] 包被緩沖液：0. 05mol/L碳酸鹽緩沖液（pH9. 6)；
[0085] 顯色液：包括A液和B液。A液的制備：稱取TMB(3，3'，5，5' -四甲基聯(lián)苯 胺)17. 2mg,加 DMS0 ( 二甲基亞砜)lml溶解，然后加醋酸鈉緩沖液(0. lmol/L, pH5. 5) 66ml。 B液的制備：取雙蒸水100ml，加 30% H202 (雙氧水)17微升。使用時(shí)A :B液等體積混勻即 可。
[0086]洗滌液：0. 02mol/LPBS(pH7. 4) ,0. 05% Tween-20 ；
[0087] 終止液：2mol/L硫酸溶液；
[0088]稀釋液：0. Olmol/IPBS。
[0089] 實(shí)施例2檢測(cè)血清中抗GP73抗體的試劑盒的使用方法
[0090] 本發(fā)明還提供使用上述試劑盒檢測(cè)血清中抗GP73抗體含量的檢測(cè)方法，所述方 法包括以下步驟：
[0091] (1)將兔抗人GP73多克隆抗體標(biāo)準(zhǔn)品（320ng/ml)用0. Olmol/IPBS稀釋液稀分別 釋成 160ng/mL、80ng/mL、40ng/mL、20ng/mL、10ng/mL 五個(gè)濃度。
[0092] (2)制作吸光度與抗體濃度關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線：
[0093] ①包被：用包被緩沖液0. 5%牛血清白蛋白（BSA)將GP73蛋白抗原稀釋到4ng/ ml，4 °C包被過夜。
[0094] ②封閉：洗滌液洗板，拍干，用0. 5% BSA封閉lh。
[0095] ③加入標(biāo)準(zhǔn)品蛋白：洗滌液洗板，拍干，向包被板的微孔中加入上述不同稀釋濃度 的兔抗人GP73多克隆抗體標(biāo)準(zhǔn)品50 u 1,重復(fù)2孔，用封板膜封板后置37°C溫育30min。
[0096] ④加入酶標(biāo)GP73蛋白抗原：洗滌液洗板，拍干，每孔加入酶標(biāo)GP73蛋白抗原 50 u 1,空白孔除外。用封板膜封板后置37°C溫育30min。
[0097] ⑤顯色：洗滌液洗板，拍干，每孔先加入顯色劑A50 u 1，再加入顯色劑B50 ii 1，輕 輕震蕩混勻，37 °C避光顯色10分鐘。
[0098] ⑥終止：每孔加終止液50 U 1，終止反應(yīng)。
[0099] ⑦測(cè)定0D值：以空白孔調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（0D值）。測(cè)定應(yīng) 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。
[0100] ⑧繪制濃度和吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線：以吸光度為橫坐標(biāo)，GP73多抗?jié)舛葹榭v坐標(biāo)，繪 制吸光度隨GP73多抗?jié)舛茸兓臉?biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示。
[0101] 在使用試劑盒檢測(cè)待測(cè)病人血清中抗GP73抗體時(shí)，將待測(cè)病人血清用稀釋液稀 釋5倍，將上述步驟③中加入標(biāo)準(zhǔn)品蛋白換成加入待測(cè)病人血清稀釋液50 u 1進(jìn)行測(cè)試，測(cè) 得吸光度值。將待測(cè)樣品吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線即可求出病人血清中抗GP73抗體濃度。
[0102] 實(shí)施例3試劑盒對(duì)正常人標(biāo)本，肝炎、肝硬化標(biāo)本，以及肝癌標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果
[0103] 發(fā)明人用該試劑盒檢測(cè)了 100例正常對(duì)照組，100例肝炎、肝硬化組（即良性肝病 組)，127例原發(fā)性肝癌組血清的GP73抗體，結(jié)果這三組抗體濃度分別為46. 36± 13. 18ng/ ml, 140. 34±18. 38ng/ml，259. 23±86. 72ng/ml，如圖 3 所示。原發(fā)性肝癌患者血清 GP73 抗 體濃度顯著高于正常組和肝炎、肝硬化組（P < 0. 05)，肝炎、肝硬化患者血清GP73抗體濃度 與正常組之間也有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P < 0. 05)。
[0104] 以正常組作為肝癌對(duì)照組，按照正常人平均檢測(cè)值加上正負(fù)3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差（x±3sd) 界定異常血清臨界值（cutoff值），則cutoff值為85. 90ng/ml ;根據(jù)這一界定標(biāo)準(zhǔn),劃分出 陽性血清標(biāo)本，100例良性肝病組和127例原發(fā)性肝癌血清中全為陽性，100例正常人血清 有0例陽性，其敏感性、特異性和準(zhǔn)確度均為100%。
[0105] 以肝炎肝硬化即肝病組作為對(duì)照組，按照肝病病人x±3sd界定肝癌血清陽性值 (cutoff值），則cutoff值為為195. 48ng/ml，根據(jù)這一界定標(biāo)準(zhǔn)，127例肝癌有35例小于 195. 48ng/ml，92例大于195. 48ng/ml。即127例肝癌患者檢出率為92例，其敏感性、特異 性和準(zhǔn)確度分別為77. 4 %、100 %、84. 58 %。
[0106] 本試劑盒的精密度測(cè)試：
[0107] 取標(biāo)準(zhǔn)品抗體160ng/ml，進(jìn)行同一批次8次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，計(jì)算結(jié)果分別是： 161. 706ng/ml、162. 837ng/ml、162. 278ng/ml、162. 538ng/ml、163. 179ng/ml、161. 432ng/ ml、161. 789ng/ml、162. 835ng/ml。
[0108]標(biāo)準(zhǔn)差 SD = 0. 628722
[0109]平均值 X = 162. 32425
[0110]變異系數(shù)=0. 628722/162. 32425X100%= 0. 38%
[0111] 取標(biāo)準(zhǔn)品抗體160ng/ml，進(jìn)行4批次實(shí)驗(yàn)，每批次計(jì)算平均值分別是：162. 271ng/ ml, 162. 408ng/ml, 162. 908ng/ml, 162. 312ng/ml，計(jì)算其變異系數(shù)為 0. 18% 0
[0112] 綜上所述，本發(fā)明的試劑盒可以用于檢測(cè)患者血清內(nèi)的抗GP73抗體的濃度，能真 實(shí)地反應(yīng)出血清中抗GP73抗體的存在水平，可以應(yīng)用于臨床對(duì)原發(fā)性肝癌進(jìn)行診斷，從而 判斷患病機(jī)體的自身免疫反應(yīng)能力，對(duì)肝癌的治療也有參考價(jià)值。本發(fā)明的試劑盒在測(cè)試 血清中抗GP73抗體是，具有特異性良好，敏感性、準(zhǔn)確性和精密度高的優(yōu)點(diǎn)。
【權(quán)利要求】
1.檢測(cè)血清中抗GP73抗體的試劑盒，其特征在于：包括GP73蛋白抗原、封閉液、酶標(biāo) 的GP73蛋白抗原、兔抗人GP73多克隆抗體標(biāo)準(zhǔn)品、包被緩沖液、顯色液、洗滌液、終止液、稀 釋液，其中，所述GP73蛋白抗原具有序列表SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)血清中抗GP73抗體的試劑盒，其特征在于所述GP73蛋 白抗原的制備步驟如下： (1)根據(jù)GP73蛋白抗原基因設(shè)計(jì)引物，包括上游引物5' -GGAACGGTACCCACCATCATCATC ATCATCAGGCTGCCCTGTCAGTGAGCCAGGAAAA-3'，下游引物 5' -GGAACGTCGACTCAGAGTGTATGATTC CGCTITTCACGCTGATCAAGTAAATT-3'，RT-PCR 擴(kuò)增 GP73 基因，步驟是：取無菌 PCR 管，依次加 入2XTaqMasterMix25iil，上游引物和下游引物各2iil，HepG2細(xì)胞總RNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 liil，ddH20補(bǔ)足至50iU ;將加好的各PCR管輕微離心混勻，放至PCR儀進(jìn)行反應(yīng)，目的片段 大小為330bp ;反應(yīng)條件：95°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，60°C退火30s，72。。延伸45s，30 個(gè)循環(huán)，72°C終延伸5min，反應(yīng)完畢，取3U1PCR產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定； (2)將擴(kuò)增的GP73基因和表達(dá)質(zhì)粒pColdlll經(jīng)過限制性內(nèi)切酶后，用T4DNA連接酶構(gòu) 建重組質(zhì)粒； (3)重組質(zhì)粒篩選與鑒定：重組質(zhì)粒用藍(lán)白斑篩選、菌落PCR、雙酶切鑒定、測(cè)序后與 GenBank中序列比對(duì)確認(rèn)基因序列是否正確； (4)GP73目的蛋白表達(dá)及鑒定：將pColdIII-GP73重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coli. BL21，誘導(dǎo)表 達(dá)條件為37°C過夜培養(yǎng)菌液，0D600達(dá)到0. 4-0. 5時(shí)，冷卻到15°C并放置45min，加入終濃 度0. 5mM的IPTG，15°C誘導(dǎo)24h ;SDS_PAGE鑒定GP73蛋白是否成功表達(dá)； (5)GP73目的蛋白純化：將IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的基因工程菌超聲破菌，離心，收集上清過 Ni-NTA親和層析柱，電泳鑒定目的蛋白純度，Bradford法測(cè)定蛋白濃度。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)血清中抗GP73抗體的試劑盒，其特征在于：所述酶標(biāo) GP73蛋白抗原的制作過程如下： (1)將辣根過氧化酶（HRP)標(biāo)記試劑盒在室溫條件下平衡30分鐘，使反應(yīng)啟動(dòng)液和反 應(yīng)終止液充分解凍后搖勻； (2)向每lOiil待標(biāo)記GP73蛋白抗原溶液中加入liU反應(yīng)啟動(dòng)液，用移液槍反復(fù)吹打 若干次以充分混勻，避免產(chǎn)生氣泡； (3)打開辣根過氧化酶反應(yīng)管蓋，將上述已啟動(dòng)GP73蛋白抗原溶液直接加到該管中， 用移液槍反復(fù)吹打若干次以充分混勻，避免產(chǎn)生氣泡，室溫放置3小時(shí)； (4)向辣根過氧化酶反應(yīng)管中加入反應(yīng)終止液，比例為每10 u 1抗原溶液加入lml反應(yīng) 終止液，充分混勻，室溫放置1小時(shí)； (5)終止完成后，加入與反應(yīng)管內(nèi)反應(yīng)液等體積的甘油，充分混勻，置于_20°C保存。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)血清中抗GP73抗體的試劑盒，其特征在于：所述包被緩 沖液為PH9. 6,0. 05mol/L碳酸鹽緩沖液。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)血清中抗GP73抗體的試劑盒，其特征在于：所述顯色液 包括A液和B液，A液是稱取3，3'，5，5' -四甲基聯(lián)苯胺17. 2mg,加二甲基亞砜lml溶解，然 后加 0. lmol/L,pH5. 5的醋酸鈉緩沖液66ml制得，B液是取雙蒸水100ml，加 30% H20217微 升制得。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)血清中抗GP73抗體的試劑盒，其特征在于：所述洗滌液 包含 0. 02mol/LpH7. 4 的 PBS，0. 05% Tween-20"
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)血清中抗GP73抗體的試劑盒，其特征在于：所述稀釋液 為 0. Olmol/IPBS。
【文檔編號(hào)】G01N33/574GK104215761SQ201410427185
【公開日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2014年8月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月27日
【發(fā)明者】周素芳, 薛冰瀅 申請(qǐng)人:廣西醫(yī)科大學(xué)