一種快速檢測(cè)納米材料生物有效性的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種快速檢測(cè)納米材料生物有效性的方法，屬于納米材料生物有效性的檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明的步驟包括細(xì)菌熒光品系構(gòu)建，將載有熒光蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)菌體內(nèi)，獲取性狀穩(wěn)定的個(gè)體；納米材料的生物樣品暴露過(guò)程，將上述步驟中挑取的性狀穩(wěn)定的細(xì)菌個(gè)體分散在有一定濃度納米材料的緩沖液稀釋后的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；熒光蛋白的表達(dá)檢測(cè)，檢測(cè)出上述步驟中培養(yǎng)的細(xì)菌內(nèi)熒光蛋白的表達(dá)情況；細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖水平測(cè)定，對(duì)上述步驟中培養(yǎng)的細(xì)菌吸光值和克隆形成數(shù)目進(jìn)行測(cè)定。本發(fā)明通過(guò)使用細(xì)菌作為研究對(duì)象，對(duì)納米材料的生物有效性進(jìn)行快速檢測(cè)，解決了以往納米材料生物有效性評(píng)價(jià)過(guò)程耗時(shí)長(zhǎng)、有效劑量濃度范圍難以確定的問(wèn)題。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種快速檢測(cè)納米材料生物有效性的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于納米材料生物有效性的檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體地說(shuō)，涉及一種快速檢測(cè)納米材料生物有效性的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]納米材料是指在三維空間中至少有一維處于納米尺度范圍(1-1OOnm)或由它們作為基本單元構(gòu)成的材料，這大約相當(dāng)于10?100個(gè)原子緊密排列在一起的尺度。納米金屬材料是20世紀(jì)80年代中期研制成功的，后來(lái)相繼問(wèn)世的有納米半導(dǎo)體薄膜、納米陶瓷、納米磁性材料和納米生物醫(yī)學(xué)材料等。人工納米材料是目前在材料學(xué)、工程學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的一種先進(jìn)材料，納米技術(shù)在新世紀(jì)將推動(dòng)信息技術(shù)、醫(yī)學(xué)、環(huán)境科學(xué)、自動(dòng)化技術(shù)及能源科學(xué)的發(fā)展，像抗生素、集成電路和人造聚合物在二十世紀(jì)發(fā)揮了重要作用一樣，納米技術(shù)在新世紀(jì)將人類(lèi)的生活帶來(lái)深遠(yuǎn)影響。其中，人工納米材料在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用異常廣泛而重要，如核磁共振成像技術(shù)、細(xì)胞分離和染色技術(shù)、作為藥物或基因載體、生物替代納米材料、生物傳感器等很多領(lǐng)域。
[0003]然而，科學(xué)家在對(duì)人工納米材料的安全性評(píng)價(jià)中發(fā)現(xiàn)，根據(jù)其劑量差異，存在不同的毒理學(xué)效應(yīng)。在一定的劑量范圍內(nèi)，人工納米材料可有效的促進(jìn)功能蛋白的表達(dá)，從而可以應(yīng)用到抗體的制備中，以及在使用納米材料作為藥物輸送的載體中，調(diào)節(jié)其使用劑量可以很好地增強(qiáng)免疫應(yīng)答，提高療效的效果，但另一方面，據(jù)美國(guó)紐約羅切斯特大學(xué)研究人員的實(shí)驗(yàn)顯示，實(shí)驗(yàn)白鼠吸入納米材料可能對(duì)多個(gè)臟器和中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生不良影響。進(jìn)入21世紀(jì)，我國(guó)開(kāi)始高度關(guān)注納米生物效應(yīng)與安全性的研究。納米材料在創(chuàng)造巨大經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)，其毒性和健康效應(yīng)也開(kāi)始弓I起人們的關(guān)注。
[0004]中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枮?011104279814，申請(qǐng)日為2011年12月19日，發(fā)明創(chuàng)造名稱(chēng)為:一種評(píng)價(jià)膳食鐵生物有效性的改良模型及其建立方法，該申請(qǐng)案包括模型結(jié)構(gòu)，細(xì)胞種類(lèi)和評(píng)價(jià)指標(biāo)，所述的模型結(jié)構(gòu)中設(shè)置有插入槽，Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)位置設(shè)置在插入槽底膜上，模型結(jié)構(gòu)具備頂側(cè)室和基底側(cè)室；該申請(qǐng)案采用的模型是使用細(xì)胞評(píng)價(jià)膳食中鐵的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，擬解決鐵轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收過(guò)程中的問(wèn)題，未曾考慮鐵元素的毒理學(xué)效應(yīng)、劑量效應(yīng)和作為載體轉(zhuǎn)運(yùn)藥物的問(wèn)題。中國(guó)專(zhuān)利號(hào)ZL2008102024518，申請(qǐng)日為2008年11月10日，發(fā)明創(chuàng)造名稱(chēng)為:一種降低活性污泥中重金屬生物有效性的方法，該專(zhuān)利涉及一種活性污泥中重金屬的處理工藝，根據(jù)活性污泥中所含重金屬種類(lèi)和含量，往活性污泥中添加其重量的7% -70%的粉末腐殖土，室溫下均勻攪拌20-30天后，活性污泥中Zn、Cu、N1、Pb四種重金屬可交換態(tài)和碳酸鹽結(jié)合態(tài)的比例降低1.4-7倍，Zn、Cu、N1、Pb四種重金屬硫化物及有機(jī)質(zhì)結(jié)合態(tài)和殘?jiān)鼞B(tài)的比例得到提高，使活性污泥中重金屬的生物有效性得到降低；該發(fā)明采用的降低活性污泥中重金屬生物有效性的方法，在解決生物污泥中的重金屬含量，并不是針對(duì)生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域金屬納米材料作為藥物傳遞載體的有效性評(píng)價(jià)。中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枮?012105483964，申請(qǐng)日為2012年12月17日，發(fā)明創(chuàng)造名稱(chēng)為:基于生物有效性的土壤Cd污染的植物修復(fù)，該申請(qǐng)是一種利用大生物量非超富集蔬菜生菜修復(fù)治理Cd污染土壤的方法，該申請(qǐng)利用大生物量非超富集蔬菜生菜吸收富集Cd污染土壤中有效態(tài)Cd，并向上轉(zhuǎn)運(yùn)到地上部，當(dāng)生菜生長(zhǎng)到成熟期將生菜整體移除并作為日常食用蔬菜使用，從而達(dá)到保證蔬菜品種的同時(shí)治理污染土壤；通過(guò)生菜的種植，重復(fù)上述過(guò)程，就可以連續(xù)提取污染土壤中的Cd，直到其含量達(dá)到環(huán)境安全標(biāo)準(zhǔn)；該方法采用的污染環(huán)境植物修復(fù)的方法，在使用生菜富集土壤中的Cd離子的含量，以去除土壤中Cd離子為主要研究目的，而不是研究適用于功能蛋白表達(dá)的有效性評(píng)價(jià)。
[0005]由此可見(jiàn)，對(duì)作為藥物載體的納米材料，缺乏適當(dāng)?shù)姆椒z測(cè)其對(duì)生物樣品功能蛋白表達(dá)的檢測(cè)方法及適當(dāng)劑量范圍的生長(zhǎng)繁殖相關(guān)評(píng)價(jià)，作為指導(dǎo)納米材料作為藥物載體的重要參照。因此研制一種簡(jiǎn)單快速地評(píng)估納米材料生物有效性的方法，且同時(shí)能夠提高功能蛋白的表達(dá)和生長(zhǎng)繁殖速率，具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)也是一個(gè)技術(shù)難點(diǎn)。本發(fā)明正是針對(duì)上述問(wèn)題，著重圍繞功能蛋白表達(dá)和生長(zhǎng)繁殖等方面進(jìn)行了改進(jìn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]1.發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題
[0007]本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)中關(guān)于人工納米材料對(duì)生物樣品功能蛋白表達(dá)的檢測(cè)方法及適當(dāng)劑量范圍的生長(zhǎng)繁殖相關(guān)評(píng)價(jià)方法缺乏的不足，提供了一種快速檢測(cè)納米材料生物有效性的方法。采用本發(fā)明的技術(shù)方案，通過(guò)使用細(xì)菌作為研究對(duì)象，對(duì)納米材料的生物有效性進(jìn)行快速檢測(cè)，解決了以往納米材料生物有效性評(píng)價(jià)過(guò)程耗時(shí)長(zhǎng)、有效劑量濃度范圍難以確定的問(wèn)題。
[0008]2.技術(shù)方案
[0009]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:
[0010]本發(fā)明的一種快速檢測(cè)納米材料生物有效性的方法，其步驟包括細(xì)菌熒光品系構(gòu)建、納米材料的生物樣品暴露過(guò)程、熒光蛋白的表達(dá)檢測(cè)和細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖水平測(cè)定；其中，細(xì)菌熒光品系構(gòu)建步驟包括將載有熒光蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)菌體內(nèi)，獲取性狀穩(wěn)定的個(gè)體；納米材料的生物樣品暴露過(guò)程步驟包括將上述步驟中挑取的性狀穩(wěn)定的細(xì)菌個(gè)體在分散有一定濃度納米材料的緩沖液稀釋后的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；熒光蛋白的表達(dá)檢測(cè)步驟包括檢測(cè)出上述步驟中培養(yǎng)的細(xì)菌內(nèi)熒光蛋白的表達(dá)情況；細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖水平測(cè)定步驟包括對(duì)上述步驟中培養(yǎng)的細(xì)菌克隆形成數(shù)目的計(jì)數(shù)。
[0011]作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，快速檢測(cè)納米材料生物有效性的方法步驟具體如下:
[0012]步驟一、細(xì)菌熒光品系的構(gòu)建
[0013]使用綠色熒光蛋白-GFP作為功能蛋白表達(dá)量的標(biāo)記，將綠色熒光蛋白-GFP插入特異性功能蛋白的啟動(dòng)子序列，其中，綠色熒光蛋白-GFP所插入位點(diǎn)為保守持家基因的啟動(dòng)子；然后將載有綠色熒光蛋白-GFP的PUC19質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)菌體內(nèi)，將PUC19質(zhì)粒插入細(xì)菌持家基因的啟動(dòng)子序列之后，挑取性狀穩(wěn)定的個(gè)體以作后續(xù)研究；
[0014]步驟二、納米材料的生物樣品暴露過(guò)程
[0015]實(shí)驗(yàn)組將納米材料以一定濃度分散在PBS緩沖液中，以1:10的體積比將分散有納米材料的PBS緩沖液稀釋到LB培養(yǎng)基中，對(duì)照組加入同樣體積的PBS緩沖液但不含有納米材料，同樣以1:10的體積比將PBS緩沖液稀釋到LB培養(yǎng)基中，同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組接入同等數(shù)量的步驟一中挑取的細(xì)菌熒光品系開(kāi)始進(jìn)行細(xì)菌的納米材料暴露過(guò)程；本步驟的培養(yǎng)過(guò)程在37攝氏度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行，以150-200rpm的速度進(jìn)行4_6小時(shí)的生長(zhǎng)和繁殖培養(yǎng)。
[0016]步驟三、熒光蛋白的表達(dá)檢測(cè)
[0017]在載有綠色熒光蛋白-GFP的細(xì)菌熒光品系經(jīng)過(guò)上述步驟二納米材料處理之后，將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的菌株以1:20的比例稀釋到PBS緩沖液中，進(jìn)行共聚焦顯微鏡的鏡檢；通過(guò)激光器的熒光激發(fā)，觀(guān)測(cè)熒光強(qiáng)度與熒光的分布，對(duì)比綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。
[0018]步驟四、細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖水平測(cè)定
[0019]將步驟二得到的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)菌按同樣倍數(shù)稀釋后對(duì)涂到90mm培養(yǎng)皿中，經(jīng)過(guò)37攝氏度培養(yǎng)8小時(shí)后對(duì)形成的克隆數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。
[0020]作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述的細(xì)菌為大腸桿菌，所述的細(xì)菌熒光品系為將載有綠色熒光蛋白-GFP的PUC19質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌trans-Ι中獲得的性狀穩(wěn)定的個(gè)體。
[0021]作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，步驟三中所述激光器的熒光為488nm。
[0022]作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述的細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖水平測(cè)定還可以采用測(cè)定600nm處吸光值的方法對(duì)細(xì)菌的數(shù)目進(jìn)行測(cè)定。
[0023]作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，PBS緩沖液制備過(guò)程如下:準(zhǔn)確稱(chēng)量KC10.2g，KH2PO40.2g，NaC18.0g, Na2HPO4.2H201.56g，加蒸餾水定容至一升，并調(diào)節(jié) PH 值至 7.4，然后在121攝氏度高溫滅菌20分鐘。
[0024]3.有益效果
[0025]采用本發(fā)明提供的技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下顯著效果:
[0026](I)本發(fā)明的一種快速檢測(cè)納米材料生物有效性的方法，通過(guò)標(biāo)定細(xì)菌功能蛋白質(zhì)的表達(dá)水平和生長(zhǎng)繁殖水平，根據(jù)納米材料的劑量范圍值，對(duì)其生物有效性進(jìn)行安全性界定和對(duì)功能蛋白的表達(dá)進(jìn)行快速評(píng)價(jià)，解決了以往納米材料生物有效性評(píng)價(jià)過(guò)程耗時(shí)長(zhǎng)、有效劑量濃度范圍難以確定的問(wèn)題。
[0027](2)本發(fā)明的一種快速檢測(cè)納米材料生物有效性的方法，選擇具有完整蛋白表達(dá)體系的細(xì)菌一大腸桿菌品系trans-Ι作為主要研究對(duì)象，使得本發(fā)明的方法檢測(cè)結(jié)果更精確，適用于所有納米材料。
[0028](3)本發(fā)明的一種快速檢測(cè)納米材料生物有效性的方法，巧妙利用熒光蛋白作為功能性蛋白表達(dá)情況的觀(guān)察手段，使得細(xì)菌功能蛋白質(zhì)的表達(dá)水平的標(biāo)定過(guò)程簡(jiǎn)單快速，且熒光蛋白插入位點(diǎn)為保守持家基因的啟動(dòng)子，即與生長(zhǎng)繁殖正相關(guān)的蛋白，使結(jié)果更具有代表性和說(shuō)服力。
[0029](4)本發(fā)明的一種快速檢測(cè)納米材料生物有效性的方法，操作過(guò)程簡(jiǎn)單易控，實(shí)驗(yàn)結(jié)果精確。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0030]圖1為本發(fā)明檢測(cè)生物有效性的示意圖；
[0031]圖2為實(shí)施例1中使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組A熒光強(qiáng)度圖；
[0032]圖3為實(shí)施例1中使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組B熒光強(qiáng)度圖；
[0033]圖4為實(shí)施例1中使用共聚焦顯微鏡檢測(cè)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組熒光強(qiáng)度圖；
[0034]圖5為實(shí)施例1中使用分光光度計(jì)檢測(cè)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組細(xì)菌數(shù)目的直方圖；
[0035]圖6為實(shí)施例1中使用克隆數(shù)目統(tǒng)計(jì)檢測(cè)對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組細(xì)菌數(shù)目的直方圖。

【具體實(shí)施方式】
[0036]為進(jìn)一步了解本發(fā)明的內(nèi)容，結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)描述。
[0037]實(shí)施例1
[0038]本實(shí)施例的一種快速檢測(cè)納米材料生物有效性的方法，其步驟包括細(xì)菌熒光品系構(gòu)建、納米材料的生物樣品暴露過(guò)程、熒光蛋白的表達(dá)檢測(cè)和細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖水平測(cè)定；具體如下:
[0039]步驟一、細(xì)菌熒光品系的構(gòu)建
[0040]本實(shí)施例中選擇具有完整蛋白表達(dá)體系的細(xì)菌大腸桿菌品系trans-Ι作為檢測(cè)納米材料生物有效性的方法介質(zhì)，使得本發(fā)明的方法檢測(cè)結(jié)果更精確，可以適用于所有納米材料。首先使用綠色熒光蛋白-GFP作為功能蛋白的代表，將綠色熒光蛋白-GFP插入特異性功能蛋白的啟動(dòng)子序列之后，用于檢測(cè)功能蛋白的表達(dá)情況，其中，綠色熒光蛋白-GFP所插入位點(diǎn)為特異性功能蛋白保守持家基因的啟動(dòng)子，即與生長(zhǎng)繁殖正相關(guān)的蛋白。然后將載有綠色熒光蛋白-GFP的PUC19質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌trans-Ι中，將PUC19質(zhì)粒插入大腸桿菌trans-Ι持家基因的啟動(dòng)子序列之后，挑取性狀穩(wěn)定的個(gè)體以作后續(xù)研究。
[0041 ] 步驟二、納米材料的生物樣品暴露過(guò)程
[0042]本實(shí)施例中采用納米銀顆粒(20_50nm)作為納米材料代表進(jìn)行研究，準(zhǔn)備兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組A、B及一個(gè)對(duì)照組,兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組將納米銀顆粒以A:10mg/L> B:50mg/L的濃度分散在PBS緩沖液中，實(shí)驗(yàn)組A、B均以1:10的體積比將分散有納米銀顆粒的PBS緩沖液稀釋到A、B號(hào)LB培養(yǎng)基中，對(duì)照組加入同樣體積的PBS緩沖液但不含有納米材料，同樣以1:10的體積比將PBS緩沖液稀釋到LB培養(yǎng)基中，同時(shí)對(duì)3組培養(yǎng)基接入同等數(shù)量的步驟一中挑取的細(xì)菌熒光品系開(kāi)始進(jìn)行細(xì)菌的納米材料暴露過(guò)程；本步驟的培養(yǎng)過(guò)程在37攝氏度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行，以150-200rpm的速度進(jìn)行4_6小時(shí)的生長(zhǎng)和繁殖培養(yǎng)，具體在本實(shí)施例中，以180的速度進(jìn)行4小時(shí)的生長(zhǎng)和繁殖培養(yǎng)。其中，PBS緩沖液制備過(guò)程如下:準(zhǔn)確稱(chēng)量KC10.2g,KH2P04 0.2g, NaC18.0g, Na2HP04.2H201.56g,加蒸餾水定容至一升，并調(diào)節(jié) PH 值至 7.4，然后在121攝氏度高溫滅菌20分鐘。
[0043]步驟三、熒光蛋白的表達(dá)檢測(cè)
[0044]在載有綠色熒光蛋白-GFP的大腸桿菌品系Trans-1經(jīng)過(guò)上述步驟二納米材料處理之后，將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的菌株以1:20的比例稀釋到PBS緩沖液中，進(jìn)行共聚焦顯微鏡的鏡檢或者通過(guò)流式細(xì)胞儀觀(guān)測(cè)對(duì)比綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，綠色熒光蛋白的表達(dá)量即對(duì)應(yīng)的功能蛋白的表達(dá)量。采用共聚焦顯微鏡的鏡檢的方式，通過(guò)488nm激光器的熒光激發(fā)，觀(guān)測(cè)到的綠色熒光蛋白的表達(dá)情況結(jié)果如圖4所示，綠色熒光蛋白的表達(dá)效果為實(shí)驗(yàn)組A優(yōu)于實(shí)驗(yàn)組B，實(shí)驗(yàn)組B優(yōu)于對(duì)照組；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)到的綠色熒光蛋白的表達(dá)情況結(jié)果如圖2、圖3所示，實(shí)驗(yàn)組A的綠色熒光蛋白的表達(dá)優(yōu)于實(shí)驗(yàn)組B，實(shí)驗(yàn)組B優(yōu)于對(duì)照組，與共聚焦顯微鏡的鏡檢的方式檢測(cè)結(jié)果一致。
[0045]步驟四、細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖水平測(cè)定
[0046]通過(guò)共聚焦顯微鏡觀(guān)測(cè)熒光蛋白的表達(dá)可以反映功能蛋白的表達(dá)情況，但是并不能反映納米材料對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的影響。但是通過(guò)對(duì)細(xì)菌克隆形成數(shù)目的檢測(cè)，即可反映納米材料對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖水平的影響。將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)菌按同樣倍數(shù)稀釋后對(duì)涂到90_培養(yǎng)皿中，經(jīng)過(guò)37攝氏度培養(yǎng)8小時(shí)后對(duì)形成的克隆數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。使用克隆數(shù)目統(tǒng)計(jì)檢測(cè)到的細(xì)菌數(shù)目制成的直方圖如圖6所示，實(shí)驗(yàn)組A細(xì)菌數(shù)目多于對(duì)照組，對(duì)照組細(xì)菌數(shù)目多于實(shí)驗(yàn)組B ;對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖水平測(cè)定還可以采用測(cè)定600nm處吸光值的方法對(duì)細(xì)菌的數(shù)目進(jìn)行，使用分光光度計(jì)檢測(cè)細(xì)菌數(shù)目的結(jié)果制成的直方圖如圖5所示，實(shí)驗(yàn)組A細(xì)菌數(shù)目多于實(shí)驗(yàn)組B和對(duì)照組，除去誤差影響，實(shí)驗(yàn)組B和對(duì)照組大致相當(dāng)。
[0047]綜上所述，可以得出納米銀顆粒濃度在10mg/L時(shí)，對(duì)大腸桿菌的蛋白質(zhì)表達(dá)和細(xì)菌生長(zhǎng)影響都是有益的，納米銀顆粒濃度在50mg/L時(shí)，對(duì)大腸桿菌的蛋白質(zhì)表達(dá)也是有益的，但是效果不如納米銀顆粒濃度在10mg/L時(shí)明顯,納米銀顆粒濃度在50mg/L時(shí),對(duì)大腸桿菌的細(xì)菌生長(zhǎng)影響是有抑制作用的(如圖1所示)，10mg/L的納米銀顆粒沒(méi)有急性毒性和遺傳毒性，50mg/L的納米銀顆粒沒(méi)有急性毒性，但有一定的遺傳毒性。
[0048]實(shí)施例2
[0049]本實(shí)施例基本方法步驟同實(shí)施例1，不同之處在于步驟二中將納米銀顆粒改為納米氧化鐵顆粒(20-50nm)，本實(shí)施例中采用納米氧化鐵顆粒作為納米材料代表進(jìn)行研究，對(duì)照組與實(shí)施例1相同，本實(shí)施例中兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組A、B分別將納米氧化鐵顆粒以A:10mg/L、B:200mg/L分散在PBS緩沖液中，其余部分同實(shí)施例1，最后得出結(jié)果納米氧化鐵顆粒在1mg/L和200mg/L時(shí)對(duì)大腸桿菌的蛋白質(zhì)表達(dá)和細(xì)菌生長(zhǎng)均是有益的，10mg/L的納米氧化鐵顆粒和200mg/L的納米氧化鐵顆粒均沒(méi)有急性毒性和遺傳毒性。
[0050]實(shí)施例3
[0051]本實(shí)施例基本方法步驟同實(shí)施例1，不同之處在于步驟二中將納米銀顆粒改為納米氧化鋅顆粒(20-50nm),本實(shí)施例中檢測(cè)10mg/L的納米氧化鋅顆粒毒理作用，對(duì)照組與實(shí)施例1相同，本實(shí)施例中設(shè)置一個(gè)實(shí)驗(yàn)組A，將納米氧化鋅顆粒以A:10mg/L分散在PBS緩沖液中，其余部分同實(shí)施例1，最后得出納米氧化鋅顆粒在10mg/L時(shí)對(duì)大腸桿菌的蛋白質(zhì)表達(dá)和細(xì)菌生長(zhǎng)影響都有較大抑制作用，10mg/L的納米氧化鋅顆粒有顯著性毒性效應(yīng)。
[0052]以上示意性的對(duì)本發(fā)明及其實(shí)施方式進(jìn)行了描述，該描述沒(méi)有限制性，只為說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此領(lǐng)域技術(shù)的人士能夠了解本
【發(fā)明內(nèi)容】
并加以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種快速檢測(cè)納米材料生物有效性的方法，其特征在于:其步驟包括細(xì)菌熒光品系構(gòu)建、納米材料的生物樣品暴露過(guò)程、熒光蛋白的表達(dá)檢測(cè)和細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖水平測(cè)定；其中，細(xì)菌熒光品系構(gòu)建步驟包括將載有熒光蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)菌體內(nèi)，獲取性狀穩(wěn)定的個(gè)體；納米材料的生物樣品暴露過(guò)程步驟包括將上述步驟中挑取的性狀穩(wěn)定的細(xì)菌個(gè)體在分散有一定濃度納米材料的緩沖液稀釋后的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；熒光蛋白的表達(dá)檢測(cè)步驟包括檢測(cè)出上述步驟中培養(yǎng)的細(xì)菌內(nèi)熒光蛋白的表達(dá)情況；細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖水平測(cè)定步驟包括對(duì)上述步驟中培養(yǎng)的細(xì)菌克隆形成數(shù)目的計(jì)數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測(cè)納米材料生物有效性的方法，其特征在于:其步驟具體如下: 步驟一、細(xì)菌熒光品系的構(gòu)建 使用綠色熒光蛋白-GFP作為功能蛋白表達(dá)量的標(biāo)記，將綠色熒光蛋白-GFP插入特異性功能蛋白的啟動(dòng)子序列，其中，綠色熒光蛋白-GFP所插入位點(diǎn)為保守持家基因的啟動(dòng)子；然后將載有綠色熒光蛋白-GFP的PUC19質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)菌體內(nèi)，將PUC19質(zhì)粒插入細(xì)菌持家基因的啟動(dòng)子序列之后，挑取性狀穩(wěn)定的個(gè)體以作后續(xù)研究； 步驟二、納米材料的生物樣品暴露過(guò)程 實(shí)驗(yàn)組將納米材料以一定濃度分散在PBS緩沖液中，以1:10的體積比將分散有納米材料的PBS緩沖液稀釋到LB培養(yǎng)基中，對(duì)照組加入同樣體積的PBS緩沖液但不含有納米材料，同樣以1:10的體積比將PBS緩沖液稀釋到LB培養(yǎng)基中，同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組接入同等數(shù)量的步驟一中挑取的細(xì)菌熒光品系開(kāi)始進(jìn)行細(xì)菌的納米材料暴露過(guò)程；本步驟的培養(yǎng)過(guò)程在37攝氏度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行，以150-200rpm的速度進(jìn)行4_6小時(shí)的生長(zhǎng)和繁殖培養(yǎng)； 步驟三、熒光蛋白的表達(dá)檢測(cè) 在載有綠色熒光蛋白-GFP的細(xì)菌熒光品系經(jīng)過(guò)上述步驟二納米材料處理之后，將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的菌株以1:20的比例稀釋到PBS緩沖液中，進(jìn)行共聚焦顯微鏡的鏡檢；通過(guò)激光器的熒光激發(fā)，觀(guān)測(cè)熒光強(qiáng)度與熒光的分布，對(duì)比綠色熒光蛋白的表達(dá)情況； 步驟四、細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖水平測(cè)定 將步驟二得到的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)菌按同樣倍數(shù)稀釋后對(duì)涂到90_培養(yǎng)皿中，經(jīng)過(guò)37攝氏度培養(yǎng)8小時(shí)后對(duì)形成的克隆數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種快速檢測(cè)納米材料生物有效性的方法，其特征在于:所述的細(xì)菌為大腸桿菌，所述的細(xì)菌熒光品系為將載有綠色熒光蛋白-GFP的TOC19質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌trans-Ι中獲得的性狀穩(wěn)定的個(gè)體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種快速檢測(cè)納米材料生物有效性的方法，其特征在于:步驟三中所述激光器的熒光為488nm。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種快速檢測(cè)納米材料生物有效性的方法，其特征在于:所述的熒光蛋白的表達(dá)檢測(cè)還可以采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種快速檢測(cè)納米材料生物有效性的方法，其特征在于:所述的細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖水平測(cè)定還可以采用測(cè)定600nm處吸光值的方法對(duì)細(xì)菌的數(shù)目進(jìn)行測(cè)定。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或5或6所述的一種快速檢測(cè)納米材料生物有效性的方法，其特征在于:PBS緩沖液制備過(guò)程如下:準(zhǔn)確稱(chēng)量KCl 0.2g, KH2PO40.2g, NaCl 8.0g,Na2HPO4.2Η201.56g，加蒸餾水定容至一升，并調(diào)節(jié)PH值至7.4，然后在121攝氏度高溫滅菌20分鐘。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK104237534SQ201410507868
【公開(kāi)日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月28日
【發(fā)明者】羅勛, 王云, 王順昌 申請(qǐng)人:淮南師范學(xué)院