一種定量檢測(cè)癌細(xì)胞呼出二氧化碳含量的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種定量檢測(cè)癌細(xì)胞呼出二氧化碳含量的方法，屬于熒光生物傳感器領(lǐng)域。首先，將TPP-DMAE溶解于DMSO中，加入高糖DMEM培養(yǎng)基，得到混合溶液；將癌細(xì)胞傳代至培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)，洗滌，加入混合溶液和高糖DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)，洗滌，加入固定劑，靜置，洗滌，加入緩沖液，得到待測(cè)樣品；檢測(cè)待測(cè)樣品的熒光強(qiáng)度，通過(guò)對(duì)比癌細(xì)胞自身新陳代謝產(chǎn)生CO2導(dǎo)致熒光強(qiáng)度-時(shí)間變化率與失活細(xì)胞通入氣體后的熒光強(qiáng)度-氣體體積變化率隨的數(shù)值，相同的熒光強(qiáng)度變化率對(duì)應(yīng)的時(shí)間以及通入氣體的體積即為癌細(xì)胞在不同時(shí)間內(nèi)自身新陳代謝產(chǎn)生的CO2體積。所述方法可定量檢測(cè)活性細(xì)胞新陳代謝所產(chǎn)生二氧化碳含量，并實(shí)現(xiàn)對(duì)癌細(xì)胞的類型進(jìn)行甄別。
【專利說(shuō)明】一種定量檢測(cè)癌細(xì)胞呼出二氧化碳含量的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種定量檢測(cè)癌細(xì)胞呼出二氧化碳含量的方法，屬于熒光生物傳感器 領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 新陳代謝是生物維持生命活動(dòng)的基本條件，生命過(guò)程中所表現(xiàn)出來(lái)的生長(zhǎng)、發(fā)育、 遺傳和變異等特征都是以新陳代謝為基礎(chǔ)的。機(jī)體生理功能和生化功能的正?；顒?dòng)完全依 賴于細(xì)胞的正常生理和新陳代謝，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)，人體便發(fā)生疾病，而新陳代謝一旦停 止，生命也將終結(jié)。因而，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞新陳代謝的記錄和監(jiān)控具有重大意義。其中，活性癌細(xì) 胞的特點(diǎn)是無(wú)限制、無(wú)止境地增生，使患者體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被大量消耗；癌細(xì)胞自身釋放出 多種毒素，使人體產(chǎn)生一系列癥狀；癌細(xì)胞還可轉(zhuǎn)移到全身各處生長(zhǎng)繁殖，導(dǎo)致人體消瘦、 無(wú)力、貧血、食欲不振、發(fā)熱以及嚴(yán)重的臟器功能受損等。若能實(shí)現(xiàn)對(duì)癌細(xì)胞代謝過(guò)程的定 量及可視化監(jiān)控，對(duì)于人類解決癌癥難題具有重大意義。癌細(xì)胞在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中，不斷地 與外界發(fā)生物質(zhì)和能量交換，如果通過(guò)二氧化碳含量變化監(jiān)測(cè)其代謝過(guò)程，對(duì)于癌細(xì)胞的 甄別，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)早期診斷具有重要意義。
[0003]因而，科研人員開(kāi)發(fā)了一系列熒光探針（如熒光蛋白、無(wú)機(jī)量子點(diǎn)等）用于細(xì)胞成 像。然而，熒光蛋白的摩爾吸光系數(shù)有限、光漂白現(xiàn)象嚴(yán)重以及光穩(wěn)定性差，無(wú)機(jī)量子點(diǎn)由 于重金屬離子的存在而具有高細(xì)胞毒性。這些大大限制了其實(shí)際應(yīng)用，因而開(kāi)發(fā)具有高生 物相容性、光穩(wěn)定性以及細(xì)胞成像有效發(fā)射的新型生物探針是至關(guān)重要的。
[0004]目前，大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的熒光探針可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞成像，但由于細(xì)胞毒性 問(wèn)題無(wú)法實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)監(jiān)測(cè)，并且這些熒光探針都對(duì)二氧化碳沒(méi)有響應(yīng)，無(wú) 法監(jiān)測(cè)細(xì)胞的新陳代謝過(guò)程。（Warburg, 0? ;Biochem.Z.，1924, 152, 319-344. Craig,F.N. ；Beecher,H.K. ；J.Gen.Physiol.,1943, 26, 473-478.Goldsmith,A. E.；Narvaez,R. ；0ncology, 1975, 32, 247-265.Wang,L.K. ；Tian,Y.P.； J.Phys.Chem.C, 2014, 1 18, 8531-8540.Zhang,X.Y. ；Wei,Y. ；Appl.Mater. Interfaces, 20 13, 5, 1943-1947.Bhunia,S.K. ；Jana,N.R. ；App1.Mater. Interfaces, 2014, 6, 7672-7679.Hong,Y.N. ；Tang,B.Z.；J.Am.Chem. Soc.，2013，135, 62-65.Miyake，T. ;McDermott，J.C. ;Gramolini，A. 0?PloS 0ne，2011，6，e28628.Neto，B.a.D. ;Carvalho，P.H.P.R. ;Silva，R.G.;RSC Adv.，2012, 2, 1524-1532.Ye，J.H. ;Chen，H.C. ;Bai，Y.;RSCAdv.，2014, 4, 6691-6695. Collado，D. ;Vida，Y. ;Najera，F(xiàn). ;RSCAdv.，2014, 4, 2306-2309.)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)目前對(duì)癌細(xì)胞代謝過(guò)程進(jìn)行檢測(cè)采用的熒光探針用于活細(xì)胞成像時(shí)，不具備 定量檢測(cè)細(xì)胞所產(chǎn)生二氧化碳，不能監(jiān)測(cè)癌細(xì)胞代謝過(guò)程的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供 一種定量檢測(cè)癌細(xì)胞呼出二氧化碳含量的方法，所述方法采用一種含有4, 4'，4" -(1H-吡 咯-1，2, 5-三基）三苯甲酸（2-二甲氨基）乙酯（TPP-DMAE)熒光探針對(duì)活細(xì)胞的新陳代 謝過(guò)程進(jìn)行檢測(cè)，所述熒光探針用于癌細(xì)胞熒光成像的同時(shí)可定量檢測(cè)癌細(xì)胞新陳代謝所 產(chǎn)生二氧化碳含量，并實(shí)現(xiàn)對(duì)癌細(xì)胞的類型進(jìn)行甄別。
[0006] 本發(fā)明的目的由以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0007] -種定量檢測(cè)癌細(xì)胞呼出二氧化碳含量的方法，所述方法具體步驟如下：
[0008] (1)將TPP-DMAE溶解于二甲基亞砜（DMS0)中，得到濃度為1X10_2mol/L的溶液 a;向溶液a中加入高糖DMEM培養(yǎng)基，得到濃度為1Xl(T5m〇l/L的溶液b;
[0009] (2)將癌細(xì)胞傳代至培養(yǎng)皿中；將裝有癌細(xì)胞的培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20? 24h，洗滌，向培養(yǎng)皿中依次加入相同體積的溶液b和高糖DMEM培養(yǎng)基，得到待測(cè)樣品1 ; 將待測(cè)樣品1置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5?lOmin，吸出液體，洗滌，向培養(yǎng)皿中加入固定劑，靜置 5?lOmin，洗滌，加入緩沖液，得到含有失活細(xì)胞的待測(cè)樣品2 ;
[0010] (3)首先觀察待測(cè)樣品1中癌細(xì)胞和待測(cè)樣品2中失活細(xì)胞和的成像情況；再測(cè) 試待測(cè)樣品1中癌細(xì)胞和待測(cè)樣品2中失活細(xì)胞的熒光強(qiáng)度；
[0011] 其中，測(cè)試待測(cè)樣品1中癌細(xì)胞的熒光強(qiáng)度的測(cè)試方法為每間隔lh測(cè)試一次，共 測(cè)試6?10次；
[0012] 待測(cè)樣品2中失活細(xì)胞的熒光強(qiáng)度的測(cè)試方法為：首先，測(cè)試待測(cè)樣品2中失活細(xì) 胞的初始熒光強(qiáng)度；隨后向待測(cè)樣品2中通入氣體，測(cè)試通入氣體后待測(cè)樣品2中失活細(xì)胞 的熒光強(qiáng)度，共通入氣體20?40次，每次氣體的通入量相等；
[0013] (4)根據(jù)步驟（3)待測(cè)樣品1中癌細(xì)胞和待測(cè)樣品2中失活細(xì)胞的熒光強(qiáng)度的測(cè) 試結(jié)果計(jì)算癌細(xì)胞產(chǎn)生的co2含量，具體為：
[0014] 首先，根據(jù)測(cè)試結(jié)果繪制待測(cè)樣品1中癌細(xì)胞熒光強(qiáng)度變化率隨時(shí)間t的變化曲 線，得到曲線一；繪制待測(cè)樣品2中失活細(xì)胞通入氣體后的熒光強(qiáng)度變化率隨通入氣體體 積的變化曲線，得到曲線二；兩條曲線中的熒光變化率相同時(shí)，分別得到曲線一中對(duì)應(yīng)的時(shí) 間t和曲線二中對(duì)應(yīng)的通入氣體的體積v;所述體積v中含有二氧化碳?xì)怏w的體積即為癌 細(xì)胞在時(shí)間t內(nèi)自身新陳代謝產(chǎn)生的C02的體積；
[0015] 待測(cè)樣品1中癌細(xì)胞熒光強(qiáng)度變化率=(Ii-Ic))/%，L表示癌細(xì)胞的初始熒光強(qiáng) 度，Ii表示第i次檢測(cè)時(shí)癌細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，i為1?9的正整數(shù)；
[0016] 測(cè)樣品2中失活細(xì)胞熒光強(qiáng)度變化率=(rk-rj/r ^表示失活細(xì)胞的 初始熒光強(qiáng)度，rk表示第k次通入氣體后失活細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，k為1?40的正整數(shù)； [0017] 其中，步驟（1)所述了---0麻￡為4,4'，4"-(111-吡咯-1，2,5-三基）三苯甲酸 (2-二甲氨基）乙酯的簡(jiǎn)寫(xiě)，TPP-DMAE的結(jié)構(gòu)式如下：

【權(quán)利要求】
1. 一種定量檢測(cè)癌細(xì)胞呼出二氧化碳含量的方法，其特征在于：所述方法具體步驟如 下： (1) 將TPP-DMAE溶解于二甲基亞砜中，得到濃度為I X l(T2m〇l/L的溶液a ;向溶液a中 加入DMEM培養(yǎng)基，得到TPP-DME的濃度為I X 10_5mol/L的溶液b ; 其中，TPP-DMAE為4, 4'，4" -(IH-吡咯-1，2, 5-三基）三苯甲酸（2-二甲氨基）乙酯 的簡(jiǎn)寫(xiě)，TPP-DME的結(jié)構(gòu)式如下：
(2) 將癌細(xì)胞傳代至培養(yǎng)皿中；將裝有癌細(xì)胞的培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20?24h，洗 滌，向培養(yǎng)皿中依次加入相同體積的溶液b和DMEM培養(yǎng)基，得到待測(cè)樣品1 ;將待測(cè)樣品1 置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5?lOmin，吸出液體，洗滌，向培養(yǎng)皿中加入固定劑，靜置5?lOmin，洗 滌，加入緩沖液，得到含有失活細(xì)胞的待測(cè)樣品2 ; (3) 測(cè)試待測(cè)樣品1中癌細(xì)胞和待測(cè)樣品2中失活細(xì)胞的熒光強(qiáng)度； 其中，測(cè)試待測(cè)樣品1中癌細(xì)胞的熒光強(qiáng)度的測(cè)試方法為每間隔Ih測(cè)試一次，共測(cè)試 6?10次，其中，第一次的測(cè)試結(jié)果記為癌細(xì)胞的初始熒光強(qiáng)度； 待測(cè)樣品2中失活細(xì)胞的熒光強(qiáng)度的測(cè)試方法為：首先，測(cè)試待測(cè)樣品2中失活細(xì)胞的 初始熒光強(qiáng)度；隨后向待測(cè)樣品2中通入CO2氣體，或CO2與空氣體積比為1:1的混合氣體， 測(cè)試通入氣體后待測(cè)樣品2中失活細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，共通入氣體20?40次，每次氣體的通 入量相等； (4) 根據(jù)步驟（3)待測(cè)樣品1中癌細(xì)胞和待測(cè)樣品2中失活細(xì)胞的熒光強(qiáng)度的測(cè)試結(jié) 果計(jì)算癌細(xì)胞產(chǎn)生的CO2含量，具體為： 首先，根據(jù)測(cè)試結(jié)果繪制待測(cè)樣品1中癌細(xì)胞熒光強(qiáng)度變化率隨時(shí)間t的變化曲線，得 到曲線一；繪制待測(cè)樣品2中失活細(xì)胞通入氣體后的熒光強(qiáng)度變化率隨通入氣體體積的變 化曲線，得到曲線二；兩條曲線中的熒光變化率相同時(shí)，分別得到曲線一中對(duì)應(yīng)的時(shí)間t和 曲線二中對(duì)應(yīng)的通入氣體的體積V ;所述體積V中含有二氧化碳?xì)怏w的體積即為癌細(xì)胞在 時(shí)間t內(nèi)自身新陳代謝產(chǎn)生的CO2的體積。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種定量檢測(cè)癌細(xì)胞呼出二氧化碳含量的方法，其特征在 于：步驟⑴所述DMEM培養(yǎng)基為高糖DMEM培養(yǎng)基。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種定量檢測(cè)癌細(xì)胞呼出二氧化碳含量的方法，其特征在 于：步驟（2)所述癌細(xì)胞為子宮頸癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞中的一種；所述培養(yǎng)皿為激光共聚焦 顯微鏡用培養(yǎng)皿；所述培養(yǎng)參數(shù)為溫度37 °C，CO2體積含量5%。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種定量檢測(cè)癌細(xì)胞呼出二氧化碳含量的方法，其特征在 于：步驟（2)所述洗滌采用pH = 7. 4的磷酸鹽緩沖液，洗滌次數(shù)為三次。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種定量檢測(cè)癌細(xì)胞呼出二氧化碳含量的方法，其特征在 于：步驟⑵所述溶液b的體積為0. 1-1. OmL;固定劑為質(zhì)量百分比為4%的多聚甲醛溶液， 固定劑的添加量為ImL ;緩沖液為pH = 7. 4的磷酸鹽緩沖液。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種定量檢測(cè)癌細(xì)胞呼出二氧化碳含量的方法，其特征在 于：步驟（3)所述成像情況和熒光強(qiáng)度均采用激光共聚焦顯微鏡。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種定量檢測(cè)癌細(xì)胞呼出二氧化碳含量的方法，其特征在 于：步驟（3)所述待測(cè)樣品2與每次通入的氣體的體積比為1000:1。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種定量檢測(cè)癌細(xì)胞呼出二氧化碳含量的方法，其特征在 于：步驟（4)所述待測(cè)樣品1中癌細(xì)胞熒光強(qiáng)度變化率=(Ii-Itl)/%，Itl表示癌細(xì)胞的初始 熒光強(qiáng)度，Ii表示第i次檢測(cè)時(shí)癌細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，i為1?9的正整數(shù)； 測(cè)樣品2中失活細(xì)胞熒光強(qiáng)度變化率=(r k-r j/r ^表示失活細(xì)胞的初 始熒光強(qiáng)度，r k表示第k次通入氣體后失活細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，k為1?40的正整數(shù)。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK104330390SQ201410589660
【公開(kāi)日】2015年2月4日 申請(qǐng)日期:2014年10月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月28日
【發(fā)明者】董宇平, 王煥, 陳笛笛, 張亞會(huì), 石建兵, 佟斌 申請(qǐng)人:北京理工大學(xué)