一種快速檢測單頭薊馬攜帶番茄斑萎病毒的血清學方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速檢測單頭薊馬攜帶番茄斑萎病毒的血清學方法及應用。利用能分泌抗番茄斑萎病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞株1A5，保藏號為CGMCC No.9343，建立檢測單頭薊馬攜帶番茄斑萎病毒的dot-ELISA方法，研發(fā)快速檢測試劑盒，快速檢測田間薊馬攜帶番茄斑萎病毒的帶毒率。利用該發(fā)明可對田間薊馬的帶毒率進行大規(guī)模快速調(diào)查，早期預測番茄斑萎病毒病的發(fā)生流行爆發(fā)趨勢。該檢測方法快速高效、靈敏特異、高通量又操作簡便，為番茄斑萎病毒病的快速診斷、預測預報及科學防控提供技術支撐。CGMCC No.934320140703
【專利說明】一種快速檢測單頭薊馬攜帶番茄斑萎病毒的血清學方法及其應用

【技術領域】
[0001]本發(fā)明所屬的領域為生物【技術領域】，尤其是涉及一種攜帶番茄斑萎病毒的薊馬的快速檢測方法及應用。

【背景技術】
[0002]1919年，番爺斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus, TSWV)首次在澳大利亞的番茄上發(fā)現(xiàn)，目前在全球熱帶、亞熱帶、溫帶地區(qū)均有發(fā)生，廣泛分布于歐洲、北美、南美、亞洲和大洋洲等多個國家。TSWV寄主范圍十分廣泛，可侵害160種雙子葉植物與10種單子葉植物，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴重的經(jīng)濟損失。TSWV導致感病植株葉片形成小黑斑，葉背面沿脈呈紫色、褐色壞死條斑，病株矮化或落葉呈萎蔫狀，未成熟果實上出現(xiàn)褪綠環(huán)斑、褐色壞死斑，成熟果實輪紋明顯、僵果。目前尚未育出抗TSWV的抗性品種，TSWV病害防治非常困難。TSWV是歐洲及地中海植物保護組織(EPPO) A2類檢疫性有害生物，也是我國進境植物檢疫性有害生物。
[0003]TSffV是一種RNA病毒，傳播途徑廣，病毒可汁液接觸傳播,種傳及介體薊馬傳毒。介體薊馬以持久性方式傳毒，是TSWV主要的傳毒方式,傳毒薊馬包括煙薊馬{Thripsia辦aci)、豆薊馬(71.?0仰5.)、薊馬{Frankliniella ScAwizei)、煙草褐薊馬、F.Fusca)及苜蓿薊馬iF.0ccidentatis)等。薊馬只能在幼蟲期獲得病毒，傳毒需要在體內(nèi)繁殖，煙薊馬最短獲毒期為15?30分鐘，豆薊馬需30分鐘，時間長傳毒效率升高，薊馬一旦帶毒，傳毒達20天，具終生傳毒能力。病毒接種多在番茄葉表細胞淺表皮吸食時獲取，一般經(jīng)4天潛育即發(fā)病。番茄、瓜葉菊等外種皮帶毒，不進入胚胎。帶毒薊馬蟲口密度是導致TSWV流行的主要原因。
[0004]以往對于TSWV的研究集中在感病的植物組織，很少研究傳毒介體薊馬。等人們在植物中觀察或檢測到TSWV時，往往TSWV已在田間流行起來，這時防控已晚。若在作物發(fā)病前，能有一種辦法快速檢測傳毒介體薊馬的帶毒量，從而準確預測作物上病害發(fā)生情況，為及時采取防控措施爭取最佳時間，是控制TSWV發(fā)生流行的最好途徑。全球鮮少有報道研究薊馬帶毒情況，其方法只能依賴RT-PCR，RT-PCR需要經(jīng)過基因組RNA提取——反轉(zhuǎn)錄——PCR擴增一電泳分析一基因組序列測定這些步驟，不僅實驗操作過程繁瑣、耗時長、試驗成本較高，不利于田間病毒樣本的大規(guī)模檢測，非專業(yè)人員也難以完成；而且薊馬非常小，體長約I毫米，要想單頭薊馬RT-PCR檢測非常困難。而血清學的方法適用于田間樣品批量檢測，非專業(yè)人員也能輕松掌握。但目前還沒有報道薊馬體內(nèi)檢測TSWV的血清學方法。
[0005]本發(fā)明利用番茄斑萎病毒單克隆抗體，建立一種檢測單頭薊馬攜帶番茄斑萎病毒的斑點酶聯(lián)免疫吸附法(dot enzyme-linked immunosorbent assay, dot-ELISA),并研發(fā)快速檢測試劑盒。該發(fā)明專利可應用于田間薊馬的帶毒率大規(guī)?？焖僬{(diào)查，提前預測番茄斑萎病毒病的發(fā)生流行爆發(fā)趨勢。該檢測方法快速高效、靈敏特異、高通量又操作簡便，為番茄斑萎病毒病的快速診斷、早期預測預報及科學防控提供技術支撐。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種快速檢測單頭薊馬攜帶番茄斑萎病毒的血清學方法及其應用。
[0007]快速檢測單頭薊馬攜帶番茄斑萎病毒的血清學方法的步驟:
1)田間薊馬的采集、研磨；
2)吸取薊馬勻漿液2μ?,點樣于硝酸纖維素膜，靜置晾干10分鐘；
3)5%脫脂奶粉的PBST中37°C封閉30-60分鐘；
4)上述硝酸纖維素膜放入用5%的脫脂奶粉1:3000倍稀釋的保藏號為CGMCCN0.9343雜交瘤細胞分泌的抗番茄斑萎病毒的單克隆抗體中，37°C孵育1-2小時，雜交瘤細胞株于2014年7月3日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，分類命名為:分泌抗番茄斑萎病毒(TSMV)單抗雜交瘤細胞；
5)硝酸纖維素膜用PBST緩沖液搖動洗脫3次，每次3分鐘，棄洗脫液；
6)硝酸纖維素膜放入用5%的脫脂奶粉1:2000倍稀釋的Sigma公司貨號為A4416的辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG 二抗中，37°C孵育1-2小時；
7)硝酸纖維素膜用PBST緩沖液搖動洗脫5次，每次3-5分鐘，棄洗脫液；
8)硝酸纖維素膜晾干后，放入Promega公司貨號為W4121的TMB顯色液中，避光顯色5-15分鐘；
9)待陽性樣品呈現(xiàn)藍色而陰性對照未顯色時，記錄結(jié)果。
[0008]田間薊馬的采集、研磨的步驟:
O薊馬采集:從大田中采集薊馬密集的花、葉等植物組織；
2)薊馬研磨:用毛筆蘸取單頭薊馬，置于干凈的封口膜上，每頭薊馬滴加2 UL 0.05mol/L PBS緩沖液，用0.5 mL離心管底磨碎至肉眼不能看到明顯組織為止。
[0009]快速檢測薊馬攜帶番茄斑萎病毒的試劑盒，包括以下試劑、材料和操作步驟:
1)試劑盒中主要試劑與材料:
0.05 mol/L PBS10 ml
TSffV單克隆抗體0.1 ml
陽性對照0.1 ml
陰性對照0.1 ml
HRP標記羊抗鼠二抗0.1ml
TMB顯色底物液10 ml
1X濃縮封閉液10 ml
1X濃縮抗體稀釋液20 ml
20 X濃縮洗滌液60 ml
封閉劑15 g
硝酸纖維素膜5張
2)試劑盒操作步驟:
2.1)單頭薊馬置于封口膜上，加入2 ul 0.05 mol/L PBS，用0.5 ml離心管底磨碎；
2.2)取2 ul勻漿液點到硝酸纖維素膜即NC膜上，37°C干燥10分鐘； 2.3) NC膜浸入到含5%封閉劑的IX封閉液中室溫封閉30分鐘；
2.4) NC膜放入用I X抗體稀釋液1: 3000倍稀釋的單抗中37°C孵育30-60分鐘；
2.5)IX洗滌液洗膜3次，每次3分鐘；
2.6)NC膜放入用I X抗體稀釋液1:2000倍稀釋的HRP標記羊抗鼠IgG 二抗中37°C孵育30-60分鐘;
2.7)IX洗滌液洗膜5次，每次3分鐘；
2.8)用濾紙吸干膜后將TMB底物顯色液滴加到膜表面進行顯色反應，肉眼觀察結(jié)果，待陽性對照顯色明顯，而陰性沒有任何顯色時記錄檢測結(jié)果，顯色時間約5-15分鐘。
[0010]檢測單頭薊馬攜帶番茄斑萎病毒的血清學快速鑒定方法及其試劑盒的應用，在于利用該方法及其檢測試劑盒對田間薊馬的帶毒情況進行調(diào)查，精確計算薊馬帶毒率，為預測預報番茄斑萎病毒在田間的發(fā)生流行爆發(fā)趨勢及科學防控提供技術支撐。
[0011]本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有的有益效果:
1)本發(fā)明提供了一種專門針對傳毒介體薊馬，快速檢測其體內(nèi)攜帶TSWV病毒的血清學方法。該方法靈敏度高，特異性強，操作簡便，快速高效，檢測結(jié)果可靠；
2)本發(fā)明還提供了一種檢測薊馬攜帶番茄斑萎病毒的快速檢測試劑盒。該試劑盒不依賴儀器、成本小、操作簡便；可同時檢測幾百至幾千頭薊馬樣品，高通量又省時高效，適于非專業(yè)人員在田間大規(guī)模推廣應用；
3)本發(fā)明可實現(xiàn)對單頭薊馬攜帶TSWV的檢測，精確度高；
4)利用本發(fā)明可對田間薊馬的帶毒情況進行大規(guī)模調(diào)查，精確計算薊馬帶毒率，早期預測番茄斑萎病毒病在田間的流行爆發(fā)趨勢以便及時采取防治措施。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1部分實驗室飼養(yǎng)薊馬樣品帶毒率檢測結(jié)果；
圖2檢測薊馬攜帶番茄斑萎病毒的試劑盒；
圖3應用試劑盒檢測田間薊馬的帶毒情況。

【具體實施方式】
[0013]快速檢測單頭薊馬攜帶番茄斑萎病毒的血清學方法的步驟:
1)田間薊馬的采集、研磨；
2)吸取薊馬勻漿液2μ?,點樣于硝酸纖維素膜，靜置晾干10分鐘；
3)5%脫脂奶粉的PBST中37°C封閉30-60分鐘；
4)上述硝酸纖維素膜放入用5%的脫脂奶粉1:3000倍稀釋的保藏號為CGMCCN0.9343雜交瘤細胞分泌的抗番茄斑萎病毒的單克隆抗體中，37°C孵育1-2小時；
5)硝酸纖維素膜用PBST緩沖液搖動洗脫3次，每次3分鐘，棄洗脫液；
6)硝酸纖維素膜放入用5%的脫脂奶粉1:2000倍稀釋的Sigma公司貨號為A4416的辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG 二抗中，37°C孵育1-2小時；
7)硝酸纖維素膜用PBST緩沖液搖動洗脫5次，每次3-5分鐘，棄洗脫液；
8)硝酸纖維素膜晾干后，放入Promega公司貨號為W4121的TMB顯色液中，避光顯色5-15分鐘； 9)待陽性樣品呈現(xiàn)藍色而陰性對照未顯色時，記錄結(jié)果。
[0014]田間薊馬的采集、研磨的步驟:
O薊馬采集:從大田中采集薊馬密集的花、葉等植物組織；
2)薊馬研磨:用毛筆蘸取單頭薊馬，置于干凈的封口膜上，每頭薊馬滴加2 UL 0.05mol/L PBS緩沖液，用0.5 mL離心管底磨碎至肉眼不能看到明顯組織為止。
[0015]分泌抗番茄斑萎病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞株1A5，它能分泌抗番茄斑萎病毒的特異性單克隆抗體，雜交瘤細胞株1A5于2014年7月3日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，郵編:100101，保藏號為 CGMCC N0.9343 ；
一種快速檢測薊馬攜帶番茄斑萎病毒的試劑盒，包括以下試劑、材料和操作步驟:
1)試劑盒中主要試劑與材料:
0.05 mol/L PBS10 ml
TSffV單克隆抗體0.1 ml
陽性對照0.1 ml
陰性對照0.1 ml
HRP標記羊抗鼠二抗0.1ml
TMB顯色底物液10 ml
1X濃縮封閉液10 ml
1X濃縮抗體稀釋液20 ml
20 X濃縮洗滌液60 ml
封閉劑15 g
硝酸纖維素膜5張
2)試劑盒操作步驟:
2.1)單頭薊馬置于封口膜上，加入2 ul 0.05 mol/L PBS，用0.5 ml離心管底磨碎；
2.2)取2 ul勻漿液點到硝酸纖維素膜即NC膜上，37°C干燥10分鐘；
2.3) NC膜浸入到含5%封閉劑的IX封閉液中室溫封閉30分鐘；
2.4) NC膜放入用I X抗體稀釋液1: 3000倍稀釋的單抗中37°C孵育30-60分鐘；
2.5)IX洗滌液洗膜3次，每次3分鐘；
2.6)NC膜放入用I X抗體稀釋液1:2000倍稀釋的HRP標記羊抗鼠IgG 二抗中37°C孵育30-60分鐘;
2.7)IX洗滌液洗膜5次，每次3分鐘；
2.8)用濾紙吸干膜后將TMB底物顯色液滴加到膜表面進行顯色反應，肉眼觀察結(jié)果，待陽性對照顯色明顯，而陰性沒有任何顯色時記錄檢測結(jié)果，顯色時間約5-15分鐘。
[0016]檢測單頭薊馬攜帶番茄斑萎病毒的血清學快速鑒定方法及其試劑盒的應用，在于利用該方法及其檢測試劑盒對田間薊馬的帶毒情況進行調(diào)查，精確計算薊馬帶毒率，為預測預報番茄斑萎病毒在田間的發(fā)生流行爆發(fā)趨勢及科學防控提供技術支撐。
[0017]以下通過附圖和實施例對本發(fā)明作進一步的闡述。
[0018]實施例一:薊馬樣品帶毒率檢測
采集實驗室飼養(yǎng)薊馬160頭，用毛筆蘸取單頭薊馬，置于干凈的封口膜上，每頭滴加2ul 0.05 mol/L PBS，用0.5 ml離心管底磨碎。用移液槍吸取1-2 μ L薊馬勻漿液，點于硝酸纖維素膜中央，并設置陽性、陰性對照。將膜靜置晾干，加入10 ml左右5%的脫脂奶粉，37°C封閉30分鐘；棄脫脂奶粉，加入1: 3000倍稀釋的番茄斑萎病毒的單克隆抗體，37°C靜置孵育I小時；棄液體，用PBST(含0.05% Tween-20的0.01 mol/L PBS)搖動洗脫3次，每次3分鐘；棄洗脫液，加入1:2000倍稀釋的辣根過氧化酶(HRP)標記的二抗(A4416 Sigma)，37°C靜置孵育I小時；棄液體，用PBST于水平搖床上搖動洗脫5次，每次5分鐘；棄洗脫液，將膜用濾紙吸干后加入TMB顯色液(W4121 Promega)顯色，避光靜置5~15分鐘，待陽性呈現(xiàn)藍色而陰性未顯色時棄顯色液終止反應，拍照記錄結(jié)果；計算薊馬的帶毒率(帶毒率=陽性數(shù)/樣品總數(shù)X 100%)。檢測結(jié)果顯示160頭薊馬中有38頭呈陽性反應(圖1)，經(jīng)計算，薊馬對TSWV的帶毒率為23.75%，該薊馬可用于健康番茄的傳毒實驗。
[0019]實施例二:檢測薊馬攜帶番茄斑萎病毒dot-ELISA試劑盒的開發(fā)
1.檢測薊馬攜帶番茄斑萎病毒(TSWV)dot-ELISA試劑盒(圖2)包含以下材料與試劑:
1)試劑盒使用說明書I份
2)試劑與材料:
0.05 mol/L PBS10 ml
TSffV單克隆抗體0.1 ml
陽性對照(帶毒薊馬勻漿液)0.1 ml
陰性對照(非帶毒薊馬勻漿液)0.1 ml
HRP標記羊抗鼠二抗0.1ml
TMB顯色底物液10 ml
10X濃縮封閉液10 ml
10X濃縮抗體稀釋液20 ml
20 X濃縮洗滌液60 ml
封閉劑15 g
NC膜5張
2.試劑盒使用說明書包括:
2.1試劑盒原理:
dot-ELISA是以硝酸纖維素膜(NC膜)為固相載體的ELISA檢測方法，具有簡便、快速、特異、敏感、便于推廣、不需特殊儀器等優(yōu)點，應用前景廣。攜帶TSWV的薊馬樣品的勻漿液點到NC膜上，干燥形成固相抗原；加入抗TSWV的鼠單抗，則單抗與固相抗原TSWV形成抗原-抗體復合物；再加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗鼠IgG抗抗體(即二抗)，則抗抗體與上述抗原-抗體復合物結(jié)合形成抗原-抗體-酶標抗抗體復合物；加入顯色底物，復合物上的酶催化底物生成沉淀型有色產(chǎn)物而顯色。由于每步之間均有洗滌的步驟，若待測薊馬樣品中不含TSWV，則酶標抗體將被洗掉，底物不顯色而呈陰性反應。肉眼觀察斑點顏色有無及深淺來進行薊馬中TSWV的定性和半定量檢測。
[0020]2.2操作步驟:
O單頭薊馬置于封口膜上，加入2 ul 0.05 mol/L PBS，用0.5 ml離心管底磨碎；
2)取2ul勻漿液點到硝酸纖維素(NC)膜上，室溫干燥10 min;
3)NC膜浸入到含5%封閉劑的IX封閉液中室溫封閉30 min; 4)NC膜放入用I X抗體稀釋液1: 3000倍稀釋的單抗中室溫孵育30-60 min;
5)用IX洗滌液洗膜3-4次，每次3 min;
6)NC膜放入用IX抗體稀釋液1:2000倍稀釋的HRP標記羊抗鼠IgG 二抗中室溫孵育30-60 min;
7)用IX洗滌液洗膜5-6次，每次5 min;
8)用濾紙吸干膜后將TMB底物顯色液滴加到膜表面進行顯色反應，肉眼觀察結(jié)果，待陽性對照顯色明顯，而陰性沒有任何顯色時記錄檢測結(jié)果，顯色時間約5-15 min。
[0021]2.3緩沖液配方:
I)磷酸鹽緩沖液(PBS，0.05 mol/L, ρΗ7.4)。
[0022]2)含5%封閉劑的封閉液:用去離子水將1X濃縮封閉液按1:9體積比進行稀釋(I份1X濃縮封閉液+9份去離子水)，稀釋后按每20 ml稀釋封閉液加入Ig封閉劑配制成含5%封閉劑的封閉液，配制好的封閉液在4°C冰箱可保存一個月。
[0023]3)洗滌液:用去離子水將20X濃縮洗滌液按1:19體積比進行稀釋(或按需量稀釋)(I份20X濃縮洗滌液+19份去離子水)，稀釋后的洗滌液在4°C環(huán)境可保存一個月。
[0024]4)抗體稀釋液:用去離子水將1X抗體稀釋液按1:9體積比進行稀釋(I份1X抗體稀釋液+9份去離子水)，稀釋后按每20 ml稀釋液加入Ig封閉劑配制成抗體稀釋液。配制好的抗體稀釋液在4°C冰箱可保存一個月。
[0025]2.4注意事項:
1)硝酸纖維素膜位于2張保護紙中間，不要用手直接觸摸膜，用鑷子或戴一次性PE手套取膜；
2)NC膜上滴加檢測樣品的一面為正面，整個實驗過程中應朝上；
3)抗體在使用前10min之內(nèi)稀釋；
4)NC膜CK+處為陽性對照；NC膜CK-處為陰性對照(點健康的薊馬勻漿液)；
5)試劑盒反應溫度為4-38°C，最佳反應溫度為37°C；
6)試劑盒能檢測200頭薊馬。
[0026]2.5貯藏條件及保存期:
試劑盒于2-8°C避光保存，抗體_20°C冷凍保存更佳。該產(chǎn)品有效期為6個月。
[0027]實施例二:利用試劑盒檢測田間劁馬帶毒率
用該試劑盒檢測田間薊馬樣品的帶毒率，可同時檢測幾百頭薊馬，結(jié)果快速、可靠、高通量又操作簡便，為早期預測該病害的發(fā)生流行做技術支撐。圖3是利用該試劑盒檢測云南大田薊馬的部分結(jié)果。檢測結(jié)果顯示258頭薊馬中有26頭呈陽性反應(圖3)，經(jīng)計算，薊馬對TSWV的帶毒率為10.08%，預測該地將有TSWV發(fā)生流行趨勢，建議農(nóng)藥防治薊馬，預防TSffV的流行和爆發(fā)。
【權利要求】
1.一種快速檢測單頭薊馬攜帶番茄斑萎病毒的血清學方法，其特征在于包括如下步驟: 1)田間薊馬的采集、研磨； 2)吸取薊馬勻漿液2μ?,點樣于硝酸纖維素膜，靜置晾干10分鐘； 3)5%脫脂奶粉的PBST中37°C封閉30-60分鐘； 4)上述硝酸纖維素膜放入用5%的脫脂奶粉1:3000倍稀釋的保藏號為CGMCCN0.9343雜交瘤細胞分泌的抗番茄斑萎病毒的單克隆抗體中，37°C孵育1-2小時； 5)硝酸纖維素膜用PBST緩沖液搖動洗脫3次，每次3分鐘，棄洗脫液； 6)硝酸纖維素膜放入用5%的脫脂奶粉1:2000倍稀釋的Sigma公司貨號為A4416的辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG 二抗中，37°C孵育1-2小時； 7)硝酸纖維素膜用PBST緩沖液搖動洗脫5次，每次3-5分鐘，棄洗脫液； 8)硝酸纖維素膜晾干后，放入Promega公司貨號為W4121的TMB顯色液中，避光顯色5-15分鐘； 9)待陽性樣品呈現(xiàn)藍色而陰性對照未顯色時，記錄結(jié)果。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的田間薊馬的采集、研磨包括如下步驟: O薊馬采集:從大田中采集薊馬密集的花、葉等植物組織； 2)薊馬研磨:用毛筆蘸取單頭薊馬，置于干凈的封口膜上，每頭薊馬滴加2 UL 0.05mo I/L PBS緩沖液，用0.5 mL離心管底磨碎至肉眼不能看到明顯組織為止。
3.一種快速檢測薊馬攜帶番茄斑萎病毒的試劑盒，其特征在于包括以下試劑、材料和操作步驟: 1)試劑盒中主要試劑與材料: 0.05 mol/L PBS10 ml TSffV單克隆抗體0.1 ml陽性對照0.1 ml陰性對照0.1 ml HRP標記羊抗鼠二抗0.1ml TMB顯色底物液10 ml 1X濃縮封閉液10 ml 1X濃縮抗體稀釋液20 ml 20 X濃縮洗滌液60 ml封閉劑15 g硝酸纖維素膜5張 2)試劑盒操作步驟: 2.1)單頭薊馬置于封口膜上，加入2 ul 0.05 mol/L PBS，用0.5 ml離心管底磨碎； 2.2)取2 ul勻漿液點到硝酸纖維素膜即NC膜上，37°C干燥10分鐘； 2.3) NC膜浸入到含5%封閉劑的IX封閉液中室溫封閉30分鐘； 2.4) NC膜放入用I X抗體稀釋液1: 3000倍稀釋的單抗中37°C孵育30-60分鐘； 2.5) IX洗滌液洗膜3次，每次3分鐘； 2.6) NC膜放入用IX抗體稀釋液1:2000倍稀釋的HRP標記羊抗鼠二抗中37°C孵育30-60分鐘； 2.7) IX洗滌液洗膜5次，每次3分鐘； 2.8)用濾紙吸干膜后將TMB底物顯色液滴加到膜表面進行顯色反應，肉眼觀察結(jié)果，待陽性對照顯色明顯，而陰性沒有任何顯色時記錄檢測結(jié)果，顯色時間約5-15分鐘。
4.一種如權利要求1-3任一項所述的檢測單頭薊馬攜帶番茄斑萎病毒的血清學快速鑒定方法及其試劑盒的應用，其特征在于利用該方法及其檢測試劑盒對田間薊馬的帶毒情況進行調(diào)查，精確計算薊馬帶毒率，為預測預報番茄斑萎病毒在田間的發(fā)生流行爆發(fā)趨勢及科學防控提供技術支撐。
【文檔編號】G01N33/577GK104515853SQ201410627387
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2014年11月10日 優(yōu)先權日:2014年11月10日
【發(fā)明者】謝艷, 吳建祥, 周雪平, 劉雪建 申請人:浙江大學