D-二聚體質(zhì)控品的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測藥劑的制備方法，具體為D-二聚體質(zhì)控品的制備方法，利用人血漿為原料，與酶復(fù)合溶液混合后，溫育形成纖維蛋白凝塊，用緩沖液洗滌纖維蛋白凝塊，用緩沖溶液重懸纖維蛋白凝塊，溫育后，纖維蛋白凝塊溶解，形成D-二聚體母液，用緩沖液調(diào)整D-二聚體母液濃度，加入人正?；旌涎獫{，制成不同濃度水平的D-二聚體質(zhì)控品。該方法工藝簡便快捷、成本低。采用人血漿為主要原料，直接制備纖維蛋白，纖維蛋白溶解過程盡可能接近人體內(nèi)部自然的纖維蛋白溶解過程，從而獲得性質(zhì)結(jié)構(gòu)和人體內(nèi)部產(chǎn)物盡可能相似的產(chǎn)物，其性質(zhì)與正?；蚣膊顟B(tài)下，人體血液中的D-二聚體狀態(tài)性質(zhì)是一致的。
【專利說明】D-二聚體質(zhì)控品的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測藥劑的制備方法，具體為D-二聚體質(zhì)控品的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 目前臨床常通過D-二聚體或FDP檢測來發(fā)現(xiàn)血栓形成，從而幫助此類疾病的診 斷。D-二聚體/FDP檢測具有檢測費(fèi)用較低、結(jié)果返回時(shí)間短、特異性高、陰性預(yù)測值高的優(yōu) 點(diǎn)。
[0003] 在D-二聚體的檢測中，由于檢測標(biāo)本的基質(zhì)為人血漿，如果質(zhì)控品的基質(zhì)與人血 漿相同或相似，將會(huì)避免因?yàn)榛|(zhì)不同而對(duì)檢測結(jié)果的干擾，從而更好的監(jiān)測實(shí)驗(yàn)方法的 準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。通常用人血漿直接作為質(zhì)控品用于常規(guī)疾病標(biāo)志物的臨床檢測，但是由 于正常人血漿中D-二聚體含量極低，不能反映某些疾病D-二聚體的高值狀態(tài)，所以需要制 備特定D-二聚體濃度的質(zhì)控品。
[0004] 由希森美康株式會(huì)社申報(bào)的專利《D-二聚體測定用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)》申請(qǐng)?zhí)枺?20061009520. 4,提供一種D-二聚體制備分離純化方法，將纖維蛋白用分解纖維蛋白的酶 溶解，并將獲得的溶液用凝膠過濾層析，純化出含有D-二聚體的溶液。適用于制備D-二聚 體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，由于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的精密性和均勻性要求較高，使得制備技術(shù)復(fù)雜，需要復(fù)雜的純 化步驟。該方法使用的原料為市售商品或利用基因工程技術(shù)制備，成本高，過程復(fù)雜、耗時(shí)。 以上這些因素使得該技術(shù)成本較高，不適合用于質(zhì)控品的制備。
[0005] 由上海太陽生物技術(shù)有限公司提交的專利申請(qǐng)《D-二聚體質(zhì)控品及其制備方法》 申請(qǐng)?zhí)枺?01310090638. 4,技術(shù)方案為將牛血漿復(fù)鈣凝固后，加入可以降解纖維蛋白的酶使 纖維蛋白凝塊溶解，用蛋白酶抑制劑終止反應(yīng)，產(chǎn)生的D-二聚體母液，用凍干保護(hù)液稀釋， 冷凍干燥，即得。該技術(shù)采用的主要原材料為牛血漿，雖然節(jié)約了成本，但是獲得的D-二聚 體物質(zhì)畢竟是非人類的，異源性的，其基質(zhì)的不同也可能會(huì)干擾檢測結(jié)果，在一定程度上不 能代表人體內(nèi)部的真實(shí)狀況，從而獲得的檢測結(jié)果也可能有一定的誤差，影響臨床結(jié)果的 判斷。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種簡便、快捷的制備D-二聚體質(zhì)控品的方法。 本發(fā)明方法制備的D-二聚體質(zhì)控品為D-二聚體多個(gè)濃度，且其他血漿物質(zhì)含量與正常血 漿相似或接近；該產(chǎn)品均一性和穩(wěn)定性較好，滿足臨床對(duì)D-二聚體檢測的質(zhì)量控制要求， 可以更準(zhǔn)確地監(jiān)測臨床樣本檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
[0007] 具體的技術(shù)方案為：
[0008] D-二聚體質(zhì)控品的制備方法，包括以下步驟：
[0009] (1)制備酶復(fù)合液：將氯化鈣、凝血酶、纖維蛋白溶解酶激酶加入到緩沖液中，使 其濃度依次分別為〇. 01?〇. 〇5mol/L、l?5U/ml、5?20mU/ml，得到的酶復(fù)合液在37°C溫 育10?15分鐘；
[0010] ⑵制備纖維蛋白凝塊：將多人份混合血漿在37°c溫育5?10分鐘，與溫育的酶 復(fù)合液混合，顛倒混勻，37°C溫育，使其形成纖維蛋白凝塊；
[0011] (3)制備D-二聚體母液：用緩沖液洗滌纖維蛋白凝塊，并擠干纖維蛋白凝塊內(nèi)的 血漿，然后用緩沖液將纖維蛋白凝塊重懸，在37°C溫育0. 5?2小時(shí)，纖維蛋白凝塊溶解，加 入絲氨酸蛋白酶抑制劑，以l〇〇〇〇g，4°C離心15分鐘，收集上清，即得到D-二聚體母液；
[0012] (4)制備D-二聚體質(zhì)控品：用緩沖液調(diào)整D-二聚體母液濃度，添加到多人份混合 血漿中，并加入凍干保護(hù)劑，用免疫比濁法測定質(zhì)控品D-二聚體濃度，定值、分裝、冷凍干 燥，即得D-二聚體質(zhì)控品。
[0013] 其中，緩沖液為可選擇pH5?10、優(yōu)選pH6?9的緩沖液，緩沖液為磷酸緩沖液、氨 基酸緩沖液、咪唑緩沖液、GOOD緩沖液中的一種。
[0014] GOOD緩沖液為MES、Bis-Tris、ADA、PIPES、TES、HEPES、Tris-HCl、TAPS緩沖液中 一種。
[0015] 優(yōu)選的緩沖液為Tris-HCl，Tris0? 05 ?0? 15mol/L，氯化鈉 0? 05 ?0? 45mmol/L， pH7. 2 ?7. 8〇
[0016] 凍干保護(hù)液：5?30g/L鹿糖、10?50g/L甘氨酸，1?10g/L疊氮化鈉，5?25g/L4-羥乙基哌嗪乙磺酸，0. 01?1. 0g/L苯甲基磺酰氟。
[0017] 纖維蛋白溶解酶激酶為鏈激酶、組織型纖溶酶原激活物、尿纖溶酶原激活物中的 任意一種。
[0018] 多人份混合血漿，是指由體格檢查、血液生化檢查、傳染病檢查均合格的健康人群 血漿混合而成。
[0019] 絲氨酸蛋白酶抑制劑可以為苯甲基磺酰氟化物、苯甲脒、抑肽酶中任意一種，優(yōu)選 抑肽酶。抑肽酶濃度為1?l〇ug/ml。
[0020] 本發(fā)明提供的D-二聚體質(zhì)控品的制備方法，利用人血漿為原料，與酶復(fù)合溶液混 合后，溫育一段時(shí)間形成纖維蛋白凝塊，用緩沖液洗滌纖維蛋白凝塊后，用緩沖溶液重懸纖 維蛋白凝塊，溫育一段時(shí)間后，纖維蛋白凝塊溶解，形成D-二聚體母液。用緩沖液調(diào)整D-二 聚體母液濃度，加入多人份混合血漿與凍干保護(hù)劑，分裝，冷凍干燥，制成不同濃度水平的 D-二聚體質(zhì)控品。
[0021] 本發(fā)明提供的D-二聚體質(zhì)控品的制備方法，簡化了傳統(tǒng)方法的制備工藝，解決了 多種酶需要分步驟添加的問題；同時(shí)解決了傳統(tǒng)方法可選用酶較少、成本較高的問題，可以 采用多種激活纖維蛋白溶解酶的酶，工藝簡便快捷、成本低。采用人血漿為主要原料，直接 制備纖維蛋白，從而獲得D-二聚體溶液。纖維蛋白溶解過程盡可能接近人體內(nèi)部自然的纖 維蛋白溶解過程，從而獲得性質(zhì)結(jié)構(gòu)和人體內(nèi)部產(chǎn)物盡可能相似的產(chǎn)物。由于是利用人源 化的材料制備質(zhì)控品，其性質(zhì)與正常或疾病狀態(tài)下，人體血液中的D-二聚體狀態(tài)性質(zhì)是一 致的。制備得到D-二聚體母液后，用緩沖液液加以稀釋，加入到多人份混合血漿中，并添加 凍干保護(hù)液，分裝，冷凍干燥，從而制備得到D-二聚體質(zhì)控品。該質(zhì)控品除D-二聚體外，其 中的其他物質(zhì)的濃度水平與正常血漿相似或接近。

【具體實(shí)施方式】
[0022] 結(jié)合實(shí)施例說明本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】。
[0023] 實(shí)施例1
[0024] D-二聚體質(zhì)控品的制備方法，包括以下步驟：
[0025] (1)制備酶復(fù)合液：將氯化鈣、凝血酶、尿纖溶酶原激活物加入到緩沖液中，使其 濃度依次分別為〇. 〇3mol/L、5U/ml、20mU/ml，得到的酶復(fù)合液在37°C溫育10?15分鐘；
[0026] (2)制備纖維蛋白凝塊：將多人份的混合血漿在37°C溫育5?10分鐘，與溫育的 酶復(fù)合液混合，顛倒混勻，37°C溫育，使其形成纖維蛋白凝塊；
[0027] (3)制備D-二聚體母液：用緩沖液洗滌纖維蛋白凝塊，并擠干纖維蛋白凝塊內(nèi) 的血漿，然后用緩沖液將纖維蛋白凝塊重懸，在37°C溫育1小時(shí)，纖維蛋白凝塊溶解，加入 2ug/ml抑肽酶，以10000g，4°C離心15分鐘，收集上清，即得到D-二聚體母液；
[0028] (4)制備D-二聚體質(zhì)控品：用緩沖液調(diào)整D-二聚體母液濃度，添加到多人份混合 血漿中，用免疫比濁法測定質(zhì)控品D-二聚體濃度，定值，分裝、冷凍干燥，即得D-二聚體質(zhì) 控品。
[0029] 其中，緩沖液為Tris-HCl，Tris0? 05mol/L，氯化鈉 0? 07mmol/L，pH7. 2 ?7. 8。 [0030] 凍干保護(hù)液：20g/L蔗糖、lOg/L甘氨酸，5g/L疊氮化鈉，5g/L4-羥乙基哌嗪乙磺 酸，1.0g/L苯甲基磺酰氟。
[0031] 實(shí)施例2
[0032] D-二聚體質(zhì)控品的制備方法，包括以下步驟：
[0033] (1)制備酶復(fù)合液：將氯化鈣、凝血酶、組織型纖溶酶原激活物加入到緩沖液中， 使其濃度依次分別為〇. 01mol/L、3U/ml、10mU/ml，得到的酶復(fù)合液在37°C溫育10?15分 鐘；
[0034] (2)制備纖維蛋白凝塊：將多人份混合血漿在37°C溫育5?10分鐘，與溫育的酶 復(fù)合液混合，顛倒混勻，37°C溫育，使其形成纖維蛋白凝塊；
[0035] (3)制備D-二聚體母液：用緩沖液洗滌纖維蛋白凝塊，并擠干纖維蛋白凝塊內(nèi)的 血漿，然后用緩沖液將纖維蛋白凝塊重懸，在37°C溫育0. 5小時(shí)，纖維蛋白凝塊溶解，加入 10ug/ml抑肽酶，以10000g，4°C離心15分鐘，收集上清，即得到D-二聚體母液；
[0036] (4)制備D-二聚體質(zhì)控品：用緩沖液調(diào)整D-二聚體母液濃度，添加到多人份混合 血漿中，并加入凍干保護(hù)劑，用免疫比濁法測定質(zhì)控品D-二聚體濃度，定值、分裝、冷凍干 燥，即得D-二聚體質(zhì)控品。
[0037] 其中，緩沖液為Tris-HCl，TrisO. 15mol/L，氯化鈉 0? 05mmol/L，pH7. 2 ?7. 8。
[0038] 凍干保護(hù)液：5g/L蔗糖、50g/L甘氨酸，lg/L疊氮化鈉，10g/L4_羥乙基哌嗪乙磺 酸，0.5g/L苯甲基磺酰氟。
[0039] 實(shí)施例3
[0040]D-二聚體質(zhì)控品的制備方法，包括以下步驟：
[0041] (1)制備酶復(fù)合液：將氯化鈣、凝血酶、鏈激酶加入到緩沖液中，使其濃度依次分 別為0. 05mol/L、1U/ml、5mU/ml，得到的酶復(fù)合液在37°C溫育10?15分鐘；
[0042] (2)制備纖維蛋白凝塊：將正常人的混合血漿在37°C溫育5?10分鐘，與溫育的 酶復(fù)合液混合，顛倒混勻，37°C溫育，使其形成纖維蛋白凝塊；
[0043] (3)制備D-二聚體母液：用緩沖液洗滌纖維蛋白凝塊，并擠干纖維蛋白凝塊內(nèi) 的血漿，然后用緩沖液將纖維蛋白凝塊重懸，在37°C溫育2小時(shí)，纖維蛋白凝塊溶解，加入 lOug/ml抑肽酶，以10000g，4°C離心15分鐘，收集上清，即得到D-二聚體母液；
[0044] (4)制備D-二聚體質(zhì)控品：用緩沖液液調(diào)整D-二聚體母液濃度，添加到多人份混 合血漿中，并加入凍干保護(hù)劑，用免疫比濁法測定質(zhì)控品D-二聚體濃度，定值、分裝、冷凍 干燥，即得D-二聚體質(zhì)控品。
[0045]其中，緩沖液為Tris-HCl，Tris0? 10mol/L，氯化鈉0?lmmol/L，pH7.2 ?7.8。
[0046] 凍干保護(hù)液：30g/L蔗糖、30g/L甘氨酸，lOg/L疊氮化鈉，13g/L4-羥乙基哌嗪乙磺 酸，0.lg/L苯甲基磺酰氟。
[0047] 對(duì)本實(shí)施例1到3制得的D-二聚體質(zhì)控品進(jìn)行性能測試。
[0048] (1)D-二聚體質(zhì)控品均一性測定
[0049] 在實(shí)施例制備的D-二聚體質(zhì)控品中分別隨機(jī)抽取10支，進(jìn)行準(zhǔn)確的復(fù)溶重建。
[0050] 使用希森美康CA-1500全自動(dòng)血凝儀及德國Siemens公司D-二聚體檢測試劑對(duì) 本方法制備的D-二聚體質(zhì)控品含量進(jìn)行檢測，計(jì)算測試結(jié)果的平均值（XI)依次為0.54、 2. 35 ;標(biāo)準(zhǔn)差（S1)依次為0. 02394、0. 03406,結(jié)果表1所示：
[0051] 表1D-二聚體含量測定結(jié)果（ug/ml)
[0052]

【權(quán)利要求】
1. D-二聚體質(zhì)控品的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 制備酶復(fù)合液：將氯化鈣、凝血酶、纖維蛋白溶解酶激酶加入到緩沖液中，使其濃 度依次分別為0. 01?0. 05mol/L、l?5U/ml、5?20mU/ml，得到的酶復(fù)合液在37°C溫育 10?15分鐘； (2) 制備纖維蛋白凝塊：將多人份混合血漿在37°C溫育5?10分鐘，與溫育的酶復(fù)合 液混合，顛倒混勻，37°C溫育，使其形成纖維蛋白凝塊； (3) 制備D-二聚體母液：用緩沖液洗滌纖維蛋白凝塊，并擠干纖維蛋白凝塊內(nèi)的血漿， 然后用緩沖液將纖維蛋白凝塊重懸，在37°C溫育0. 5?2小時(shí)，纖維蛋白凝塊溶解，加入絲 氨酸蛋白酶抑制劑，以l〇〇〇〇g，4°C離心15分鐘，收集上清，即得到D-二聚體母液； (4) 制備D-二聚體質(zhì)控品：用緩沖液調(diào)整D-二聚體母液濃度，添加到多人份混合血漿 中，并加入凍干保護(hù)劑，用免疫比濁法測定質(zhì)控品D-二聚體濃度，定值、分裝、冷凍干燥，即 得D-二聚體質(zhì)控品。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的D-二聚體質(zhì)控品的制備方法，其特征在于，所述的緩沖液為 pH5?10緩沖液，緩沖液為磷酸緩沖液、氨基酸緩沖液、咪唑緩沖液、GOOD緩沖液中的一種。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的D-二聚體質(zhì)控品的制備方法，其特征在于，所述的GOOD緩沖 液為 MES、Bis-Tris、ADA、PIPES、TES、HEPES、Tris-HCl、TAPS 緩沖液中的一種。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的D-二聚體質(zhì)控品的制備方法，其特征在于，所述的緩沖液為 Tris-HCl 緩沖液，Tris 0? 05 ?0? 15mol/L，氯化鈉 0? 05 ?0? 45mmol/L，pH7. 2 ?7. 8〇
5. 根據(jù)權(quán)利要求1到4任一項(xiàng)所述的D-二聚體質(zhì)控品的制備方法，其特征在于，所述 的凍干保護(hù)液由以下原料組成，5?30g/L鹿糖、10?50g/L甘氨酸，1?10g/L疊氮化鈉， 5?25g/L4_輕乙基哌嘆乙磺酸，0. 01?1. 0g/L苯甲基磺酰氟。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1到4任一項(xiàng)所述的D-二聚體質(zhì)控品的制備方法，其特征在于，所述 的纖維蛋白溶解酶激酶為鏈激酶、組織型纖溶酶原激活物、尿纖溶酶原激活物中的一種。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1到4任一項(xiàng)所述的D-二聚體質(zhì)控品的制備方法，其特征在于，所述 的絲氨酸蛋白酶抑制劑為苯甲基磺酰氟化物、苯甲脒、抑肽酶中的一種。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的D-二聚體質(zhì)控品的制備方法，其特征在于，所述的抑肽酶濃 度為1?10ug/ml。
【文檔編號(hào)】G01N33/53GK104459103SQ201410770542
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年12月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月15日
【發(fā)明者】蘇娜, 林方昭, 謝兆林, 喻洪躍, 高翠華 申請(qǐng)人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院輸血研究所, 成都協(xié)和生物技術(shù)有限責(zé)任公司