本發(fā)明涉及一種采用電化學(xué)實(shí)時(shí)監(jiān)測溶液中共價(jià)鍵形成的方法，屬于電化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

在過去的幾十年，有關(guān)單分子水平的研究已經(jīng)引起研究者的廣泛關(guān)注，因?yàn)閱畏肿友芯靠梢允谷藗儗Νh(huán)境對分子行為特性的影響有更深刻的認(rèn)識，而這些信息是不能通過傳統(tǒng)的分子整體研究得到的。研究者用原子力顯微鏡研究共價(jià)鍵結(jié)合力的大小。然而，對共價(jià)鍵的形成過程的實(shí)時(shí)監(jiān)測更有挑戰(zhàn)性。傳統(tǒng)的共價(jià)鍵的檢測方法主要有：高分辨電子能量損失能譜法(HREELS)、光電子能譜法(XPS)、熒光法和掃描隧道顯微法。Collins及合作者用點(diǎn)功能化的碳納米管器件來連續(xù)監(jiān)測單個(gè)羧基官能團(tuán)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的共價(jià)鍵形成，電流回路電導(dǎo)的不連續(xù)變化反映了實(shí)時(shí)化學(xué)反應(yīng)過程。雖然這些技術(shù)在監(jiān)測共價(jià)鍵的形成已經(jīng)取得巨大的進(jìn)展，然而制備單分子電子器件仍然有很大的挑戰(zhàn)性。因此，急需一種簡單且高靈敏的共價(jià)鍵監(jiān)測方法;

納米粒子-電極碰撞是一種高效低廉的電化學(xué)方法，常用來檢測不同類型的粒子，如金屬顆粒、氧有機(jī)納米化物顆粒、有機(jī)納米顆?；騿畏肿印Ｑ芯勘砻?，存在兩種類型的電流-時(shí)間曲線：逐步累積瀑布狀的電流階躍(樓梯狀)和瞬間衰減的電流跳躍（針尖狀）。樓梯狀電流是由納米粒子長時(shí)間吸附在電極上而產(chǎn)生的，而針狀電流是由于粒子和電極碰撞后瞬間離開。前期研究表明：電極表面的自組裝單層膜會(huì)阻礙電子從電極到電解液遷移的遂穿效應(yīng)。然而，如果在膜的表面有金屬納米顆粒，從電極到溶液的電子遷移會(huì)變得更加容易。這是由于電子從電極向金屬納米顆粒的隧穿電流比從電極向溶液中的分子更容易。具有這種效應(yīng)的納米顆粒包括金屬、半導(dǎo)體量子點(diǎn)、碳納米材料，如氧化石墨烯;

Crooks及合作者提出了一種電化學(xué)監(jiān)測互補(bǔ)DNA和它對應(yīng)的單鏈DNA結(jié)合時(shí)的催化電流的變化來實(shí)時(shí)監(jiān)測DNA的雜化過程。除了檢測與單個(gè)納米顆粒碰撞有關(guān)的催化電流外，Compton研究組報(bào)道了單個(gè)點(diǎn)活性粒子的直接電化學(xué)。他們用陽極粒子電流分析法通過測量陽極電流的變化來檢測銀納米粒子，瞬間還原感應(yīng)電流反映了納米粒子的大小和分布

最近，我們成功地采用電化學(xué)方法來檢修飾在石墨烯表面的蛋白質(zhì)單分子。用MP-11非共價(jià)鍵修飾的納米石墨烯提高了有點(diǎn)活性的表面積，當(dāng)石墨烯和電極碰撞時(shí)，MP-11產(chǎn)生放大的氧化還原電流?；谇捌诘难芯拷Y(jié)構(gòu)，我們發(fā)明了采用簡單的納米粒子-電極碰撞來實(shí)時(shí)監(jiān)測溶液中共價(jià)鍵的形成過程。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種采用電化學(xué)實(shí)時(shí)監(jiān)測溶液中共價(jià)鍵形成的方法，為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案包括以下步驟：

納米還原氧化石墨烯的制備：取2 g石墨納米纖維、10 mL濃硫酸和1 g P2O5，混合加熱至80 °C，使其預(yù)氧化30 min，然后在6 h內(nèi)冷卻到室溫，將混合物用蒸餾水稀釋、抽濾并洗至中性，預(yù)氧化后的石墨干燥后與50 mL濃硫酸混合，并緩慢加入6 g高錳酸鉀，攪拌，控制溫度低于20°C，然后將混合物放在 35 °C的油浴中攪拌 2 h, 然后加入280 mL水后終止反應(yīng)，向反應(yīng)結(jié)束后的混合物中加入5 mL 30 % 的過氧化氫，混合物變成明黃色，所得混合物用分散在水中，然后抽濾，抽濾后的濾餅用1:10 的稀鹽酸清洗，然后干燥，配制濃度為0.1mg/ mL的氧化石墨烯分散液50 mL，然后加入50 mg 維生素，在室溫下強(qiáng)力攪拌24小時(shí)，還原得到單層分布的納米還原氧化石墨烯;

蛋白質(zhì)分子（MP-11）和還原氧化石墨烯的自組裝: 將1 mL 濃度為0.186 mg/mL的 MP-11溶液加入1 mL濃度為0.05 mg/mL 的納米還原氧化石墨烯溶液， 攪拌12 h，得到MP-11非共價(jià)鍵修飾的納米還原氧化石墨烯，清洗MP-11/reduced grapheme oxide(rGO)溶液以出去多余的MP-11分子，最后稀釋到10 mL，用同樣的方法配制MP-11濃度為20、40 μM 的MP-11/rGO溶液；將直徑為12.5μm的金電極浸漬在濃度為5 mg/ mL的Lomant試劑的DMSO溶液中，保持6小時(shí)，得到Lomant單層修飾的金電極，命名為Lomant/Au電極；將另一根直徑為12.5μm的金電極浸漬在濃度為10 mM 的MPA的酒精溶液中，保持6 h，將此電極命名為MPA/Au電極;

溶液中共價(jià)鍵形成的實(shí)時(shí)監(jiān)測: 采用三電極電化學(xué)工作站測量計(jì)時(shí)電流曲線。工作電極為直徑12.5μm的Lomant/Au和MPA/Au電極，Ag/AgCl為參比電極，Pt絲為對電極。向pH=7，濃度為10 mM PBS溶液中加入MP-11/rGO，記錄電流和時(shí)間的關(guān)系曲線，工作電壓分別為-600 mV，數(shù)據(jù)采集時(shí)間間隔是50 ms。所有的實(shí)驗(yàn)都是在室溫下在法拉第屏蔽箱里完成，所有的電解質(zhì)溶液都用氮?dú)獬鋈タ諝?，且在?shí)驗(yàn)過程溶液保持通入氮?dú)?。MP-11/rGO在Lomant/Au電極表面和Lomant試劑產(chǎn)生共價(jià)鍵，得到的電流曲線是樓梯狀的持續(xù)增加的電流，而MPA/Au表面帶負(fù)電，當(dāng)MP-11/rGO布朗運(yùn)動(dòng)到電極表面時(shí)，和電極碰撞后在靜電斥力的作用下迅速移開。

有益效果

本發(fā)明采用簡單易行的電化學(xué)方法實(shí)時(shí)監(jiān)測溶液中共價(jià)鍵的形成，且有很高的靈敏度，在電化學(xué)領(lǐng)域和單分子領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1是實(shí)時(shí)監(jiān)測溶液中共價(jià)鍵形成的原理圖;

圖2是共價(jià)鍵形成的原理圖;

圖3是納米MP-11/rGO 在Lomant/Au 電極和Lomant/Au電極上的施加-0.4V電壓產(chǎn)生的瞬時(shí)電流

具體實(shí)施方式

下面通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明：

實(shí)施例1

（1） 納米還原氧化石墨烯的制備：取2 g石墨納米纖維、10 mL濃硫酸和1 g P2O5，混合加熱至80 °C，使其預(yù)氧化30 min，然后在6 h內(nèi)冷卻到室溫，將混合物用蒸餾水稀釋、抽濾并洗至中性，預(yù)氧化后的石墨干燥后與50 mL濃硫酸混合，并緩慢加入6 g高錳酸鉀，攪拌，控制溫度低于20°C，然后將混合物放在 35 °C的油浴中攪拌 2 h, 然后加入280 mL水后終止反應(yīng)，向反應(yīng)結(jié)束后的混合物中加入5 mL 30 % 的過氧化氫，混合物變成明黃色，所得混合物用分散在水中，然后抽濾，抽濾后的濾餅用1:10 的稀鹽酸清洗，然后干燥，配制濃度為0.1mg/ mL的氧化石墨烯分散液50 mL，然后加入50 mg 維生素，在室溫下強(qiáng)力攪拌24小時(shí)，還原得到單層分布的納米還原氧化石墨烯;

（2） 蛋白質(zhì)分子（MP-11）和還原氧化石墨烯的自組裝: 將1 mL 濃度為0.186 mg/mL的 MP-11溶液加入1 mL濃度為0.05 mg/mL 的納米還原氧化石墨烯溶液， 攪拌12 h，得到MP-11非共價(jià)鍵修飾的納米石墨烯，清洗MP-11/還原氧化石墨烯( rGO)除去多余的MP-11分子，最后稀釋到10 mL，用同樣的方法配制MP-11濃度為20、40 μM 的MP-11/graphene溶液；將直徑為12.5μm的金電極浸漬在濃度為5 mg/ mL的Lomant試劑的DMSO溶液中，保持6小時(shí)，得到Lomant單層修飾的金電極，命名為Lomant/Au電極；將另一根直徑為12.5μm的金電極浸漬在濃度為10 mM 的MPA的酒精溶液中，保持6 h，將此電極命名為MPA/Au電極;

（3） 溶液中共價(jià)鍵的電化學(xué)實(shí)時(shí)檢測: 采用三電極電化學(xué)工作站測量計(jì)時(shí)電流曲線。工作電極為直徑12.5μm的Lomant/Au電極，Ag/AgCl為參比電極，Pt絲為對電極。向pH=7，濃度為10 mM PBS溶液中加入MP-11/rGO，記錄電流和時(shí)間的關(guān)系曲線，工作電壓分別為-600 mV，數(shù)據(jù)采集時(shí)間間隔是50 ms。所有的實(shí)驗(yàn)都是在室溫下在法拉第屏蔽箱里完成，所有的電解質(zhì)溶液都用氮?dú)獬タ諝?，且在?shí)驗(yàn)過程溶液保持通入氮?dú)狻P-11/rGO在Lomant/Au電極表面和Lomant試劑產(chǎn)生共價(jià)鍵，得到的電流曲線是樓梯狀的持續(xù)增加的電流;

實(shí)施例2. 將實(shí)施例1中步驟（3）的工作電極改為MPA/Au電極，其他同實(shí)施例1。MPA/Au表面帶負(fù)電，當(dāng)MP-11/rGO布朗運(yùn)動(dòng)到電極表面時(shí)，和電極碰撞后在靜電斥力的作用下迅速移開，得到電流時(shí)間曲線是針尖狀的，且總的趨勢是電流降低的。