本發(fā)明涉及一種瑪咔芥子油苷分光光度計定量方法。

背景技術：

芥子油苷也簡稱為硫苷，雖已有多篇報道闡明芥子油苷(如芐基芥子油苷、間甲氧基芐基芥子油苷)及其降解產物異硫氰酸酯類(如烯丙基異硫氰酸酯、苯基異硫氰酸酯)具有一定的抗癌活性，并且新鮮瑪咔約含有1％的芥子油苷，是其他如西蘭花等十字花科植物所含的芥子油苷含量的100倍左右。但當瑪咔組織細胞受到破壞時，芥子油苷就會與植物內源的硫苷酶相遇而發(fā)生水解，因此如何準確定量分析瑪咔中的芥子油苷的含量顯得尤為重要。

雖有報道采用酶解芥子油苷法，利用檢測的葡萄糖含量來推測總芥子油苷含量；也有通過硫酸酯酶對芥子油苷脫硫酸根等樣品前處理操作，再利用HPLC檢測多種芥子油苷的含量。但第一種方法存在不能保證酶解是否完全以及很難排除自身葡萄糖的干擾的問題，而第二種方法中的脫硫酸根操作繁瑣復雜不宜于技術的推廣。而如果通過研究降解物的成分及其含量來推測芥子油苷的含量，則須考慮如何保證降解的完全度及降解物的穩(wěn)定性。因此進行以芥子油苷為檢測對象的定量方法的研究，則較為適宜。

技術實現要素：

本發(fā)明提供了一種瑪咔芥子油苷分光光度計定量方法。

本發(fā)明采用如下技術方案：

一種瑪咔芥子油苷分光光度計定量方法，包括以下步驟：

(1)取樣品稱定，之后加入乙醇于水浴條件下回流提取，減壓抽濾并測之體積；

(2)移取樣品溶液，并依次向其中加入CMC-Na溶液、PbCl₂顯色溶液，每加入一次試劑均搖勻后再加，搖勻后放置；

(3)在分光光度計檢測波長272nm處檢測各樣品吸光度知，并以提取溶劑、PbCl₂-CMC-Na為空白作對照。

優(yōu)選的，所述步驟(1)中乙醇的加入量為樣品質量的25倍，乙醇的體積分數為75％。

優(yōu)選的，所述步驟(1)中水浴溫度為75℃，回流提取時間為2.5小時。

優(yōu)選的，所述步驟(2)中CMC-Na溶液的質量分數為0.15％，PbCl₂顯色溶液濃度為0.8m mol/L，放置溫度為19～25℃，放置時間2小時。

優(yōu)選的，所述步驟(3)中空白為0.8m mol/L PbCl₂-0.15％CMC-Na。

本發(fā)明提供的瑪咔芥子油苷分光光度計定量方法通過對最佳檢測波長的選擇、不同濃度的乙醇的影響、不同提取方法的影響、CMC-Na的影響等條件的系統研究，以期確立簡單可靠專屬性強的、適合瑪咔中芥子油苷含量測定的方法，為今后的研究奠定基礎。

附圖說明

圖1是本發(fā)明PbCl₂顯色劑的波長掃描(800-200nm)結果；

圖2是本發(fā)明九個不同濃度的標準品溶液波長掃描(800-200nm)結果；

圖3是本發(fā)明樣品溶液波長掃描(800-200nm)結果；

圖4是本發(fā)明標準品波長掃描(800-200nm)結果；

圖5是本發(fā)明標準品溶液波長掃描(800-200nm)結果；

圖6是本發(fā)明標準品在272nm處的標準曲線；

圖7是本發(fā)明穩(wěn)定性試驗結果。

具體實施方式

下面的實施例是對本發(fā)明的進一步詳細描述。

一種瑪咔芥子油苷分光光度計定量方法，包括以下步驟：

(1)取樣品稱定，之后加入乙醇于水浴條件下回流提取，減壓抽濾并測之體積；

(2)移取樣品溶液，并依次向其中加入CMC-Na溶液、PbCl₂顯色溶液，每加入一次試劑均搖勻后再加，搖勻后放置；

(3)在分光光度計檢測波長272nm處檢測各樣品吸光度知，并以提取溶劑、PbCl₂-CMC-Na為空白作對照。

最佳檢測波長的選擇

全波長掃描試驗

1)空白參照溶液的全波長掃描試驗

以水為空白，按照3.2項下顯色方法顯色后在UV 2600分光光度計上進行波長掃描(800-200nm)以扣除背景。

2)0.8m mol/L PbCl₂顯色劑的全波長掃描試驗

取1mL0.8m mol/L PbCl₂顯色劑于比色皿中，以空白參照溶液為對照，按照相關操作，在UV 2600分光光度計上進行波長掃描(800-200nm)，以檢測0.8m mol/L PbCl₂顯色劑本身對試驗是否有影響。

3)標準品溶液的全波長掃描試驗

取黑芥子硫苷酸鉀水合物適量，精密稱定置10ml棕色量瓶中，加甲醇(HPLC級)溶解并定容至刻度，搖勻，制得0.389mg/mL的SH-標準品母液；分別精密移取0.389mg/mL的SH-標準品母液0.10mL、0.20mL、0.30mL、0.40mL、0.50mL、0.60mL、0.70mL、0.80mL、1.00mL置20mL具塞試管中，之后，依次精密移加水1.90mL、1.80mL、1.70mL、1.60mL、1.50mL、1.40mL、1.30mL、1.20mL、 1.00mL，搖勻，使之均為2.00mL，之后按照3.2項下顯色方法顯色，平行做兩份樣品；并以2.00mL水為空白制得空白參比溶液；

分別取參比溶液及對各個對照品溶液，在UV 2600分光光度計上進行波長掃描(800-200nm)以檢驗并確定最佳檢測波長。

4)樣品溶液的全波長掃描試驗

取樣品溶液按顯色反應顯色，并且每份樣品均平行做兩份；并以2.00mL提取溶劑為空白，制得空白參比溶液；分別取參比溶液及樣品溶液，在UV 2600分光光度計上進行波長掃描(800-200nm)以檢驗并確定最佳檢測波長。

在272nm與540nm處的檢測

將標準品溶液、樣品溶液顯色后，在UV 2600分光光度計272nm、540nm處分別檢測各吸光度值。

不同濃度的乙醇的影響

鑒于今后試驗將涉及不同濃度的乙醇，故有必要考察不同濃度的乙醇作為空白參照時對試驗的影響。本試驗以水為空白參照，考察了95％乙醇、70％乙醇、45％乙醇分別顯色后的紫外吸收情況，在最佳檢測波長處檢測比較各個樣品。

不同提取方法的影響

乙醇回流提取法

稱取Maca藥粉適量，精密稱定，加入25倍量70％乙醇于75℃水浴中回流提取2.5h，減壓抽濾，合并濾液，即得乙醇回流提取樣品溶液；

水煎煮法

稱取Maca藥粉適量，精密稱定，分別加入10倍量水于電熱套中加熱，進行回流提取5h后，趁熱減壓抽濾，即得水煎煮樣品溶液； 向藥渣中加入10倍量80％乙醇冷浸(室溫)一周后，減壓抽濾，濾液于-0.1MPa、39.9℃條件下減壓濃縮至無醇味，即得冷浸樣品溶液。常壓蒸餾法

稱取Maca藥粉適量，精密稱定，加入10倍量水進行常壓蒸餾，收集瓶置于冰塊附近，蒸餾6h；將接收的餾分用乙酸乙酯(AR級)萃取后，于-0.1MPa、39.9℃條件下減壓回收殘留的乙酸乙酯，即得常壓蒸餾餾分水層樣品溶液。

0.15％CMC-Na的影響

雖然文獻報道，在分光光度法測定油菜籽中硫代葡萄糖甙過程中，羧甲基纖維素鈉不參與顯色反應，只作為分散介質，但在檢測瑪咔中的硫代葡萄糖甙芥子油苷時，是否也需要CMC-Na作為分散介質，本試驗進行了考察。

0.15％CMC-Na對標準品溶液的影響

精密移取800μL 0.192mg/mL黑芥子硫苷酸鉀水合物，并精密移加水1.20mL補足至2mL于20mL具塞試管中，按3.2項下顯色反應顯色；同時，以同等體積的水代替0.15％CMC-Na平行制備對照品溶液兩份；并以水為空白，平行制備加0.15％CMC-Na以及不加0.15％CMC-Na的空白參比溶液各兩份；之后進行波長掃描(800-200nm)。

0.15％CMC-Na對樣品溶液的影響

按照確定的提取方法提取瑪咔，其中提取溶劑包括：95％乙醇、85％乙醇、75％乙醇、65％乙醇、55％乙醇、45％乙醇、35％乙醇、25％乙醇、70％甲醇；

各個提取液按照3.2項下顯色方法顯色；并以等體積的水代替 0.15％CMC-Na平行制備樣品溶液兩份；并以各自溶劑為空白，平行制備加與不加0.15％CMC-Na的空白參比溶液各兩份；之后在最佳檢測波長處檢測各吸光度值A，以確定0.15％CMC-Na對樣品溶液吸光度值的影響。

標準曲線的制作

標準品溶液的制備

取黑芥子硫苷酸鉀水合物適量，精密稱定置10mL棕色量瓶中，加水(PH＝6.22)溶解并定容至刻度，搖勻，即得0.389mg/mL的SH-標準品母液；

分別精密移取0.389mg/mL的SH-標準品母液0.10mL、0.20mL、0.30mL、0.40mL、0.50mL、0.60mL置20mL具塞試管中，之后，依次精密移加水1.90mL、1.80mL、1.70mL、1.60mL、1.50mL、1.40mL，搖勻，使之均為2.00mL；依次顯色并依照Std-1至Std-6的順序依次標記，均平行做兩份；并以2.00mL水為空白制得空白參比溶液；

最佳檢測波長的驗證

分別取參比溶液及各個對照品溶液進行波長掃描(800-200nm)，以檢驗并確定最佳檢測波長；

標準曲線的繪制

在最佳檢測波長處檢測Std-1至Std-6各個標準品吸光度值A，并以各溶液的濃度(C)為橫坐標、吸光度(A)為縱坐標，進行回歸分析；

精密度試驗(日內與日間)

取Std-6、Std-4、Std-2標準品溶液，在最佳檢測波長處分別每天連續(xù)檢測6次、檢測3天，進行日內精密度試驗與日間精密度試驗。

重復性試驗

取同一批樣品2.0g各三份，共取6份，精密稱定，分別加入25倍量75％乙醇于75℃水浴條件下回流提取2.5h，均減壓抽濾，測得體積；顯色后于最佳檢測波長處分別檢測。

穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，分別于0min、30min、60min、90min、120min在最佳檢測波長處分別檢測其吸光度值。

加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的樣品1.0g，共6份，分別加入對照品11.4mg，按照3.2.7重復性試驗項下提取方法操作制得樣品溶液；顯色后，于最佳檢測波長處分別檢測各吸光度值后計算回收率。

含量測定

取不同批次的Maca粉2.0g各三份，共取6份，精密稱定，按照3.2項下確定的提取方法操作制得樣品溶液；顯色后于最佳檢測波長處分別檢測其各自的吸光度值。

實驗結果與討論

最佳檢測波長的選擇

全波長掃描試驗

1)空白參照溶液的全波長掃描試驗

以水為空白參照溶液的全波長掃描試驗結果表明在800-200nm 的波長掃描范圍內，空白參照溶液無紫外吸收；

2)0.8m mol/L PbCl₂顯色劑的全波長掃描試驗

由圖1可知，在800-200nm的波長掃描范圍內，0.8m mol/LPbCl₂顯色劑在298nm與418nm處有最大紫外吸收，顯色劑本身對試驗方法的最大紫外吸收波長540nm無影響。

3)標準品溶液的全波長掃描試驗

由圖2可知，九個不同濃度的標準品溶液在800-200nm的波長掃描范圍內，均在272nm處有最大紫外吸收；

4)樣品溶液的全波長掃描試驗

由圖3(左：樣品1，右：樣品2)可知，在800-200nm的波長范圍內，樣品溶液均在272nm處有最大紫外吸收；綜上，在800-200nm的波長掃描范圍內，不論是黑芥子硫苷酸鉀水合物標準品溶液還是樣品溶液，均在272nm處有最大紫外吸收。

在272nm與540nm處的檢測

顯色后的標準品溶液、樣品溶液分別在272nm、540nm處檢測的各吸光度值如表1所示；由此可知，在540nm處所測得的各個樣品含量均遠不如272nm處的結果高，故進一步驗證272nm為最佳檢測波長。

表1 272nm與540nm檢測結果(n＝3)

不同濃度的乙醇的影響

表2 272nm檢測樣品結果

在最佳檢測波長272nm處檢測各顯色后的乙醇溶劑的結果(如表2)表明，在波長272nm處，不同濃度的乙醇對吸光度值是有影響的，不同濃度的乙醇的紫外吸收情況是不同的，隨著乙醇濃度的增加，其紫外吸光度值越大；并說明試驗涉及到不同濃度的乙醇提取溶劑時須以各自溶劑做空白參比溶液。

不同提取方法的影響

表3不同提取方法所得樣品在272nm處檢測結果(n＝3)

在UV 2600分光光度計272nm處檢測各個樣品，由表3結果表明，不同的處理方法所得芥子油苷的含量亦不同，其中，乙醇回流提取法所得的樣品中芥子油苷平均含量最高(達到1.25％)，水煎煮法次之，常壓蒸餾法最差；由于芥子油苷具有遇熱不穩(wěn)定、遇水會降解的性質，為減免芥子油苷長時間處于高溫狀態(tài)，故確定選擇乙醇回流法為樣品的提取方法。

0.15％CMC-Na的影響

0.15％CMC-Na對標準品溶液的影響

由圖4(左：無CMC-Na；右：有CMC-Na)可知，在800-200nm波長掃描范圍，加不加0.15％CMC-Na標準品溶液檢測結果均有一最大吸收波長272nm，但二者對比，很明顯加0.15％CMC-Na時的圖 譜較好，故對標準品溶液確定顯色方法選用加0.15％CMC-Na的操作。

0.15％CMC-Na對樣品溶液的影響

表4 272nm處樣品的檢測結果(n＝3)

采用不同濃度的乙醇(甲醇)為提取溶劑，并依據乙醇回流法制得樣品后顯色檢測；由表4結果表明，雖然與在顯色反應過程中加0.15％CMC-Na時相比，各個樣品溶液的吸光度值在不加0.15％CMC-Na時較大，但就穩(wěn)定性而言，試驗過程中，不加0.15％CMC-Na的樣品溶液20min左右就會有黑色顆粒狀物析出，并對其檢測發(fā)現其吸光度值驟降，故綜合考慮方法須穩(wěn)定準確可重復的因素，認為在顯色反應時須加入0.15％CMC-Na作為分散介質。同時縱觀表4試驗結果知，采用70％甲醇作提取溶劑時獲得的瑪咔芥子油苷平均含量最高(1.5％左右)，但考慮到甲醇較乙醇對人體造成的毒性較大且不宜于后期的工藝技術路線的生產放大等問題，故選擇乙醇作為提取溶劑；并由表4結果知在不同濃度的乙醇中尤以75％較佳。

綜上可知，確定的供試品的提取方法為：取樣品2.0g，精密稱定，之后加入25倍量75％乙醇于75℃水浴條件下回流提取2.5h，減 壓抽濾并測之體積。顯色方法為：精密移取樣品溶液2.00mL，并依次向其中加入4mL 0.15％CMC-Na溶液、2mL 0.8m mol/L的PbCl₂顯色溶液，每加入一次試劑均搖勻后再加，搖勻后在22±3℃放置2h。檢測方法為：在最佳檢測波長272nm處檢測各樣品吸光度知，并以提取溶劑、0.8m mol/L PbCl₂-0.15％CMC-Na為空白作對照。

標準曲線的制作

最佳檢測波長的確定

分別取參比溶液及各個對照品溶液進行波長掃描(800-200nm)，結果由圖2-5知標準品Std-4、Std-5、Std-9的最佳檢測波長均為272nm；進一步驗證了最佳檢測波長為272nm。

圖5為標準品溶液波長掃描(800-200nm)結果(從左至右為標準品Std-4、Std-5、Std-9)

標準曲線的制作

在最佳檢測波長272nm處檢測Std-1至Std-6各個標準品吸光度值A，以各溶液的濃度(C)為橫坐標、以吸光度值(A)為縱坐標，進行回歸分析，得回歸方程y＝0.0049x+0.0486(R²＝0.9995)，表明在19.45-116.70μg/ml范圍內線性關系良好，如圖6所示。

標準品的溶劑問題

本試驗曾以甲醇作為標準品的溶劑，但反復多次試驗，在272nm處所得的標準曲線的線性關系均不符合要求(R²<0.999)，推測：當甲醇作為溶解標準品的溶劑時，由于不同濃度的標準品溶液在顯色反應前均以水補足至2.00mL，并且以2.00mL水作空白，當標準品加入的量多時(如0.80mL)甲醇的含量比例較多，故以水為空白扣除背景時會造成很大誤差，致使多次試驗的標準曲線的線性關系均不符 合要求(R²<0.999)，故改用水為溶解溶劑。

顯色劑的用量問題

本試驗曾考察了9個不同濃度的標準品溶液(濃度范圍為19.45-175.05μg/mL)的線性關系，結果從Std-7至Std-9(即濃度范圍為136.15-175.05μg/mL)無法與之前的6個標準品達到很好的線性關系(R²<0.998，即r<0.999)，并且Std-7至Std-9三者的檢測結果明顯趨于一定值；推測出現這種情況的原因為由于加入的顯色劑的質量是一定的，在一定范圍內，增加標準品的含量，所檢測到的吸光度值A也呈一定的趨勢增加；但當超出此范圍后，由于所加顯色劑是一定的，故過多的標準品將無法全部顯色，進而導致檢測的吸光度值A不呈現規(guī)律的增加趨勢而是趨于某一值。另外，考慮到紫外分光光度法檢測樣品時，吸光度值的最佳范圍為0.2-0.8，故確定以濃度19.45-116.70μg/ml為線性考察范圍。

精密度試驗(日內與日間)

表5日內與日間精密度結果

由表5結果表明，不論是日內精密度還是日間精密度，RSD值均小于3％，表明儀器精密度較好。

重復性試驗

由表6結果可知芥子油苷平均含量為1.1486％，RSD＝2.87％，表明該方法重復性良好。

穩(wěn)定性試驗

結果RSD＝2.53％≤3％，表明供試品在30min內基本穩(wěn)定，在顯色后的30min內檢測結果可信。

表6重復性試驗結果(n＝3)

加樣回收率試驗

回收率＝(實測量－樣品含量)/加入對照品量×100％

表7芥子油苷回收率試驗結果(n＝3)

由表7結果可知芥子油苷平均回收率為99.55％，且結果穩(wěn)定，回收率變化范圍為95％-103％，RSD＝2.73％≤3％，表明該方法準確可靠。

含量測定

表8瑪咔芥子油苷含量測定結果(n＝3)

由表8結果表明芥子油苷平均含量均約為1.10％，符合文獻報道的瑪咔中有1％左右的芥子油苷含量，并且RSD≤3％，表明確立的瑪咔芥子油苷紫外分光光度計定量檢測方法重復性良好，可供今后分析檢測瑪咔芥子油苷的含量。

本發(fā)明通過方法學考察，確立了瑪咔芥子油苷紫外分光光度計定量檢測的方法。其中，供試品的提取方法為：取樣品，精密稱定，之后加入25倍量75％乙醇于75℃水浴條件下回流提取2.5h，減壓抽濾并測之體積。顯色方法為：精密移取樣品溶液2.00mL，并依次向其中加入4mL 0.15％CMC-Na溶液、2mL 0.8m mol/L的PbCl₂顯色溶液，每加入一次試劑均搖勻后再加，搖勻后在22±3℃放置2h。檢測方法為：在最佳檢測波長272nm處檢測各樣品吸光度知，并以提取溶劑、0.8m mol/L PbCl₂-0.15％CMC-Na為空白作對照。瑪咔芥子油苷的含量測定

采用本試驗所建立的瑪咔芥子油苷紫外分光光度計定量檢測方 法，檢測不同批次的瑪咔，結果芥子油苷平均含量均約為1.10％，RSD≤3％，符合文獻報道的瑪咔中有1％左右的芥子油苷含量，表明確立的瑪咔芥子油苷紫外分光光度計定量檢測方法，準確可信重復性好，可供今后分析檢測瑪咔芥子油苷的含量。

盡管已經示出和描述了本發(fā)明的實施例，對于本領域的普通技術人員而言，可以理解在不脫離本發(fā)明的原理和精神的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由所附權利要求及其等同物限定。