本發(fā)明涉及化學修飾改性和同位素標記輔助的蛋白質(zhì)氨基酸序列從頭測序方法，具體地說是一種通過對多肽的N端和C端分別進行穩(wěn)定同位素標記以鑒別碎片離子的蛋白質(zhì)氨基酸序列從頭測序方法。

背景技術(shù)：

蛋白質(zhì)是重要的生物大分子，在生命活動中發(fā)揮著重要作用。對蛋白質(zhì)進行測序?qū)τ诘鞍踪|(zhì)一級結(jié)構(gòu)的分析至關(guān)重要。盡管目前有些物種存在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，可以用搜庫的方法對蛋白質(zhì)氨基酸序列進行分析。但是，大多數(shù)物種仍然沒有可供檢索的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，并且對于已經(jīng)存在數(shù)據(jù)庫的物種，由于基因變異也會導(dǎo)致其蛋白質(zhì)氨基酸序列發(fā)生變化。因此，非常有必要發(fā)展不依賴于數(shù)據(jù)庫的蛋白質(zhì)氨基酸序列從頭測序方法。文獻報道中對蛋白質(zhì)氨基酸序列進行從頭測序的方法主要有以下幾種：(1)通過對多肽的N端，使用帶有酸性基團的試劑進行衍生，然后使用MALDI質(zhì)譜進行分析，使得多肽碎片片段基本不含有a、b離子，主要以y離子形式存在，從而可以對y離子進行鑒別，實現(xiàn)對多肽的從頭測序；(2)通過對多肽的N端，使用帶有堿性基團的試劑進行衍生，然后使用MALDI質(zhì)譜進行分析，使得多肽碎片片段基本不含有y離子，主要以a或者b離子形式存在，從而可以對其進行鑒別，實現(xiàn)對多肽的從頭測序。

多肽穩(wěn)定同位素標記方法是蛋白質(zhì)組學中一種常用的定量方法，通過對不同樣品多肽的N端和/或者C端分別進行輕、重穩(wěn)定同位素標記，在隨后的質(zhì)譜分析中通過比較多肽母離子的信號強度或者碎片離子的信號強度實現(xiàn)不同樣品中多肽和蛋白質(zhì)的定量(Koehler CJ，Arntzen MO，Treumann A，Thiede B，Anal.Bioanal.Chem.，2012，404(4)，1103-1114)。目前的蛋白質(zhì)氨基酸序列從頭測序方法，主要通過對一個樣品的多肽一端或者兩端進行衍生，使多肽在碎裂時主要產(chǎn)生一個系列的碎片離子，從而簡化離子碎片種類，進行從頭測序。但是，由于多肽的碎裂機理比較復(fù)雜，即使對多肽進行前述處理，多肽在碎裂時仍然會產(chǎn)生其它碎片離子，因此特異性不高，影響從頭測序的準確性；此外，隨著氨基酸序列長度的增加，較大的碎片離子其產(chǎn)生的幾率和強度都會降低，不利于從頭測序。為此，我們通過將同一個樣品分成兩份；將第一份樣品進一步分成兩份，分別對其中的多肽N端進行穩(wěn)定同位素標記，通過在質(zhì)譜分析時形成的成對碎片離子，準確辨別b離子；將第二份樣品也分成兩份，通過對多肽的C端進行輕重同位素標記，根據(jù)質(zhì)譜分析時形成的成對離子，準確辨別多肽y離子；利用b離子和y離子的互補性，實現(xiàn)對多肽的準確從頭測序。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

蛋白質(zhì)氨基酸序列從頭測序比較困難，由于多肽碎裂機理復(fù)雜，造成質(zhì)譜圖的復(fù)雜性和難以準確分辨碎片離子。同位素標記被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)定量，通過對不同樣品進行不同同位素標記，混合后樣品在一級譜或者二級譜存在質(zhì)量差異，從而可以被分辨，并利用一級譜或者二級譜的峰面積或者強度進行定量。本發(fā)明的目的是利用對多肽兩端分別進行同位素標記，實現(xiàn)對多肽b和y系列碎片離子的鑒別，利用兩者的互補性，提高從頭測序的準確度和速度。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

將多肽樣品分成兩份。其中第一份樣品分成兩份，使用含有不同輕重同位素的標記試劑對其N端氨基進行標記，使兩份樣品中多肽的分子量差異在2-8之間，并且其質(zhì)譜中b離子的質(zhì)量差異大于4Da；對標記后的肽段，混合后使用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用進行分析；分析時通過適當擴大碎裂窗口寬度，實現(xiàn)對不同標記肽段的同時碎裂；根據(jù)產(chǎn)生的碎片離子對質(zhì)量差來鑒別b離子。對第二份樣品，將其分成兩份后，使用含有不同輕重同位素的標記試劑對其C端羧基進行標記，使得兩份樣品中多肽的分子量差異在2-8之間，并且其質(zhì)譜中y離子的質(zhì)量差異大于4Da；對標記后的肽段，混合后使用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用進行分析；分析時通過適當擴大碎裂窗口寬度，實現(xiàn)對不同標記肽段的同時碎裂；根據(jù)產(chǎn)生的碎片離子對質(zhì)量差來鑒別y離子。利用N端和C端標記后的多肽分子質(zhì)量以及保留時間的相關(guān)性，將不同標記的相同多肽的二級質(zhì)譜圖進行關(guān)聯(lián)。利用鑒定到的b離子和y離子，實現(xiàn)對多肽的從頭測序。

所述蛋白質(zhì)氨基酸序列的從頭測序方法，具體步驟如下：

(1)多肽N端同位素標記：對多肽樣品，首先使用胍基化試劑封閉賴氨酸上的氨基，然后將其分成兩份，一份用含有輕同位素的標記試劑對多肽N端氨基進行衍生；對另一份樣品，用含有重同位素的標記試劑對多肽N端氨基進行衍生。在進行同位素標記時，多肽N端被元素相同但同位素不同標記試劑標記后的質(zhì)量差異大于或者等于4Da，以防止多肽碎裂形成碎片時同位素的干擾。

(2)多肽C端同位素標記：將多肽樣品分成兩份，一份用含有輕同位素的標記試劑對多肽C端羧基進行衍生；對另一份樣品，用含有重同位素的標記試劑對多肽C端羧基進行衍生。在進行同位素標記時，多肽C端被元素相同但同位素不同標記試劑標記后的質(zhì)量差異大于或者等于4Da，以防止多肽碎裂形成碎片時同位素的干擾。

(3)標記多肽的質(zhì)譜分析：將N端不同標記的多肽樣品按照1:1的比例混合后，使用反相高效液相色譜進行分離，電噴霧質(zhì)譜進行鑒定。將C端不同標記的多肽樣品按照1:1的比例混合后，使用反相高效液相色譜進行分離，電噴霧質(zhì)譜進行鑒定。為了保證不同標記的肽段同時碎裂，將碎裂 窗口寬度設(shè)為4Da。

(4)在對多肽的N端和C端標記時，使用相同的標記試劑(如精氨酸)，使得N端和C端標記的多肽具有類似的分子量和疏水性，從而在色譜上具有相近的保留時間；根據(jù)保留時間以及分子量，可以將兩種標記的多肽進行關(guān)聯(lián)；結(jié)合多肽的N端碎片離子和C端碎片離子，可以實現(xiàn)多肽的從頭測序。

發(fā)明的蛋白質(zhì)氨基酸序列從頭測序方法可以應(yīng)用于未知序列蛋白質(zhì)的準確和快速測序。

本發(fā)明具有如下優(yōu)點：

1.本發(fā)明通過將多肽樣品分成兩份，對其N端氨基進行不同同位素標記，通過擴大質(zhì)譜碎裂窗口，使得不同標記的同一多肽在質(zhì)譜中同時碎裂，形成的二級碎片離子其b離子以成對形式存在，易被分辨，提高了碎片離子鑒定的特異性，有利于提高從頭測序的準確性；

2.本發(fā)明通過將多肽樣品分成兩份，對其C端羧基進行不同同位素標記，通過擴大質(zhì)譜碎裂窗口，使得不同標記的同一多肽在質(zhì)譜中同時碎裂，形成的二級碎片離子其y離子以成對形式存在，易被分辨，提高了碎片離子鑒定的特異性，有利于提高從頭測序的準確性；

3.本發(fā)明通過對多肽N端和C端分別使用帶有正電荷的試劑進行標記，可以顯著增強多肽的質(zhì)譜響應(yīng)信號，并且有利于多肽的碎裂和碎片離子的形成，從而提高從頭測序的效率。

4.本發(fā)明通過對多肽樣品的b離子和y離子分別進行鑒定，利用兩端碎片離子的互補性，有利于提高從頭測序的準確性和效率。

附圖說明

圖1為蛋白質(zhì)多肽N端精氨酸標記實驗流程圖；

圖2為蛋白質(zhì)多肽C端精氨酸標記實驗流程圖；

圖3為使用液相色譜-質(zhì)譜對精氨酸標記的多肽進行分析獲得的二級質(zhì)譜圖；

圖4為使用液相色譜-質(zhì)譜對精氨酸標記的多肽進行分析獲得的二級質(zhì)譜圖。

具體實施方式

下面通過實施例對本發(fā)明提供的方法進行詳述，但不以任何形式限制本發(fā)明。

實施例1

1.基于精氨酸標記的多肽N端標記及C端標記

如圖1所示，按如下流程進行標記：

1)多肽賴氨酸氨基的胍基化：在1ml多肽溶液中加入40μL含有2M O-甲基異脲的100mM碳酸氫鈉溶液，用2M氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至11，在37℃下反應(yīng)2小時。然后通過加入10％的三氟乙酸終止反應(yīng)，并將溶液 pH調(diào)節(jié)到8.0。

2)多肽N端精氨酸標記：將1)將精氨酸的氨基使用含有4％甲醛和60mM氰基硼氫化鈉的50mM磷酸鈉緩沖溶液(pH 7.5)進行封閉；使用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)對精氨酸的羧基進行活化；2)獲得的多肽樣品分成兩等份，第一份使用含有50mM羧基活化精氨酸的50mM磷酸鈉緩沖溶液(pH 7.5)對多肽N端進行標記。對于第二份樣品，使用同樣的方法進行標記。不同之處是使用含有50mM羧基活化的重同位素精氨酸(¹⁵N4)進行標記。標記時間為10分鐘。標記后的多肽使用80％乙腈溶液洗脫后，使用真空蒸干。

3)多肽C端精氨酸標記：將1)獲得的多肽樣品分成兩等份，分別使用混合酸酐和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)對多肽C端羧基進行活化?；罨蟮牡谝环輼悠肥褂煤?0mM精氨酸的50mM磷酸鈉緩沖溶液(pH 7.5)對多肽C端進行標記。對于第二份樣品，使用同樣的方法進行標記。不同之處是使用含有50mM重同位素精氨酸(¹⁵N4)的50mM磷酸鈉緩沖溶液(pH 7.5)進行標記。標記時間為10分鐘。標記后的多肽使用80％乙腈溶液洗脫后，使用真空蒸干。

4)標記多肽的質(zhì)譜分析：標記后的兩份樣品混合后，使用Triple-TOF5600plus質(zhì)譜(AB SCIEX,USA)和nano UPLC系統(tǒng)(Eskigent,USA)進行分離和分析。流動相A和B(V/V)分別為97.9％水/2％乙腈/0.1％甲酸及97.9％乙腈/2％水/0.1％甲酸。在流速為500nL/min的100％A流動相下，上樣到預(yù)柱(75μm i.d.×5cm)上，然后被洗脫到分析柱(75μm i.d.×20cm)上。流速設(shè)為300nL/min，流動相梯度為：在0到45分鐘內(nèi)從5％到22％B，在45-60分鐘內(nèi)從22％B到35％B，在60-65分鐘內(nèi)從35％B到80％B。在使用80％的流動相B沖洗柱子5分鐘后，使用98％的流動相A平衡15分鐘。

Triple-TOF 5600plus的噴霧電壓設(shè)為2.6kV。一級質(zhì)譜掃描范圍為350到1250Da(電荷數(shù)從+2到+5，cps>80，累積時間0.25s)，后面跟隨60個二級掃描(掃描范圍從100到1500Da，累積時間為0.04s)。分離窗口設(shè)為4Da。根據(jù)N端和C端分別被標記的多肽在分子質(zhì)量和保留時間上的相關(guān)性(質(zhì)量差異等于二甲基化精氨酸和乙?；彼嶂g的質(zhì)量差異且兩者色譜保留時間相近)，找到N端和C端分別被標記的相同多肽的二級質(zhì)譜圖。獲得的N端標記多肽二級質(zhì)譜圖如圖3所示。獲得的原始二級質(zhì)譜圖(圖3a)中含有很多碎片離子，難以分辨出b和y離子。根據(jù)多肽兩端標記形成的碎片離子對之間的質(zhì)量差異(b離子相差3.988Da),可以分辨出b離子(圖3b)；分辨出的b離子使得質(zhì)譜圖大大簡化，根據(jù)不同離子間的質(zhì)量差異可以推導(dǎo)出多肽的部分序列(如圖3b所示)。獲得的C端標記多肽二級質(zhì)譜圖如圖4所示。獲得的原始二級質(zhì)譜圖(圖4a)中含有很多碎片離子，難以分辨出b和y離子。根據(jù)多肽兩端標記形成的碎片離子對之間 的質(zhì)量差異(y離子相差3.988Da),可以分辨出y離子(圖4b)；分辨出的y離子使得質(zhì)譜圖大大簡化，根據(jù)不同離子間的質(zhì)量差異可以推導(dǎo)出多肽的部分序列(如圖4b所示)。

本發(fā)明通過標記形成成對存在的多肽碎片離子而加以分辨，可以有效降低干擾信號的影響，提高碎片離子選擇的特異性和多肽測序的準確度；同時通過標記在質(zhì)譜圖中形成成對的b，y碎片離子，有利于實現(xiàn)對b，y離子的分辨，簡化了蛋白質(zhì)氨基酸序列從頭測序算法，提高了從頭測序的速度。