本發(fā)明涉及一種沙丁胺醇的檢測(cè)方法，具體涉及一種飼料或肉類食品中沙丁胺醇的HPLC檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

沙丁胺醇是一種β受體激動(dòng)劑，可以作為藥物用于臨床醫(yī)學(xué)中呼吸道疾病的治療，也作為瘦肉精用于改變動(dòng)物體內(nèi)的肥瘦肉比例以提高飼料轉(zhuǎn)化率。在家畜的體內(nèi)，沙丁胺醇可以很大程度上使肥肉轉(zhuǎn)化為瘦肉，從而使家畜得到更大的經(jīng)濟(jì)利益。沙丁胺醇亦可用作運(yùn)動(dòng)員提高身體興奮度的興奮劑。在大多數(shù)國(guó)家和地區(qū)(例如中國(guó)和印度)，由于沙丁胺醇對(duì)于人體的危害巨大，沙丁胺醇的使用是明令禁止的，但在很多地方，由于使用沙丁胺醇造成的食物中毒事件仍在發(fā)生。因此，一種簡(jiǎn)單的、低成本的、快速的、靈敏度高的、特異性強(qiáng)的食品中沙丁胺醇的檢測(cè)方法是具有重要意義的。

當(dāng)前，用于沙丁胺醇的檢測(cè)方法有ELISA法、毛細(xì)管電泳法、高效液相色譜(HPLC)法、液相-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)法、氣相-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)法等。這些方法在沙丁胺醇的檢測(cè)中有各自的特點(diǎn)，在實(shí)際應(yīng)用中也有各自的不足。例如：在過(guò)去興起沿用至今的免疫分析法和酶聯(lián)免疫吸附法由于無(wú)法克服抗體的交叉反應(yīng)性，已經(jīng)證實(shí)是不適合沙丁胺醇的檢測(cè)的。又如，近幾年，氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法廣泛的用于沙丁胺醇的鑒定和檢測(cè)，但是由于沙丁胺醇的強(qiáng)極性和低揮發(fā)性，使得沙丁胺醇的檢測(cè)耗時(shí)多，操作過(guò)程繁瑣，成本高。再如，比起氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法更有效率的是液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，但由于需要同位素內(nèi)標(biāo)，使得液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法非常昂貴，在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室不能得到普及，近年來(lái)被廣泛地應(yīng)用于微量目標(biāo)化合物的測(cè)定。由于沙丁胺醇不具有熒光基團(tuán)，一般采用HPLC-DAD進(jìn)行檢測(cè)，但檢測(cè)靈敏度低且易受內(nèi)源物質(zhì)的干擾。因此，為了更靈敏檢測(cè)沙丁胺醇，一般需要用熒光試劑對(duì)其進(jìn)行衍生化處理，使沙丁胺醇具有熒光基團(tuán)，從而能順利的利用熒光檢測(cè)方法進(jìn)行選擇性檢測(cè)。目前，常用試劑有6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞胺基-氨基甲酸酯(AQC)，4-氯-7-硝基苯并-1,2,3-噁二唑(NBD-Cl)，1-二甲氨基萘-5-磺酰氯(DNS-Cl)等，這些試劑均存在諸多不足，如6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞胺基-氨基甲酸酯(AQC)已成為了一種廣泛使用的柱前熒光衍生試劑，但是其衍生物在水溶液中的熒光強(qiáng)度僅是純乙腈中的10％，造成早洗脫的氨基酸衍生物通常比晚洗脫的氨基酸衍生物檢測(cè)限高1～2數(shù)量級(jí)。4-氯-7-硝基苯并-1,2,3-噁二唑(NBD-Cl)試劑在水溶液中的穩(wěn)定性較差,見(jiàn)光容易分解,1-二甲氨基萘-5-磺酰氯(DNS-Cl)不僅穩(wěn)定性差，其衍生物還伴有熒光猝滅現(xiàn)象，造成檢測(cè)靈敏度下降。

此外，對(duì)肉類等食品進(jìn)行沙丁胺醇檢測(cè)時(shí)，需要對(duì)樣品進(jìn)行提取，以便后續(xù)的檢測(cè)。目前，常用于沙丁胺醇的樣品前處理方法有固相萃取(SPE)。SPE萃取的方式是利用固體吸附劑吸附目標(biāo)物，與樣品基體及干擾物分離，再經(jīng)洗脫而實(shí)現(xiàn)待測(cè)物的分離和富集，萃取方式提取時(shí)間長(zhǎng)、提取率低、樣本量大，有機(jī)溶劑消耗量也較大，檢測(cè)耗時(shí)多，使應(yīng)用受限。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明提供了一種飼料或肉類食品中沙丁胺醇的HPLC檢測(cè)方法，該方法操作簡(jiǎn)便、省時(shí)、省力，檢測(cè)靈敏度高，為沙丁胺醇的檢測(cè)提供了新的思路。

近幾年，超聲輔助分散液液微萃取(UA-DLLME)作為一個(gè)新興的前處理方法由于擁有操作簡(jiǎn)單、快速、省時(shí)顯著、節(jié)約化學(xué)試劑、良好的恢復(fù)和高富集系數(shù)、低功耗等優(yōu)點(diǎn)被廣泛的應(yīng)用。本發(fā)明中，我們首次使用BCEC-Cl作為熒光標(biāo)記試劑，結(jié)合超聲輔助分散液液微萃取(UA-DLLME)技術(shù)對(duì)飼料和肉類食品中的沙丁胺醇進(jìn)行檢測(cè)，先對(duì)樣品進(jìn)行熒光標(biāo)記(也稱為熒光衍生化處理)，再使用UA-DLLME技術(shù)進(jìn)行萃取，并且經(jīng)過(guò)研究得到了合適的熒光標(biāo)記條件和萃取條件，使沙丁胺醇的高效液相色譜熒光檢測(cè)法的檢測(cè)靈敏度大大提升。

本發(fā)明具體技術(shù)方案如下：

一種飼料或肉類食品中沙丁胺醇的HPLC檢測(cè)方法，該方法采用高效液相色譜熒光檢測(cè)法進(jìn)行檢測(cè)，所用的待測(cè)樣品溶液的制備包括以下步驟：

(1)沙丁胺醇的初步提取：將飼料或肉類食品用乙腈和水的混合溶液超聲萃取，離心所得萃取上清液在氣體保護(hù)下干燥，然后用水溶解、過(guò)膜除雜，得初步樣品溶液；

(2)用熒光試劑2-(11H-苯[a]咔唑)乙基氯甲酸酯對(duì)初步樣品溶液進(jìn)行熒光標(biāo)記；

(3)熒光標(biāo)記的初步樣品溶液的超聲輔助分散液液微萃?。簩⒙然c溶液和熒光標(biāo)記初步樣品溶液混合，然后與分散劑與萃取劑的混合液混合，所得混合液在超聲萃取后離心分離，取底層液體，用保護(hù)性氣體吹干，然后用甲醇復(fù)溶，過(guò)膜除雜，得待測(cè)樣品溶液。

本發(fā)明熒光標(biāo)記的步驟發(fā)生在初步樣品進(jìn)行超聲輔助分散液液微萃取前，即先用熒光試劑對(duì)初步樣品溶液中的沙丁胺醇進(jìn)行熒光標(biāo)記，再進(jìn)行超聲輔助分散液液微萃取。熒光標(biāo)記和超聲輔助分散液液微萃取彼此協(xié)同，提高了萃取率，通過(guò)熒光標(biāo)記既有利于樣品中沙丁胺醇的充分提取又提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏度。如果先進(jìn)行超聲輔助分散液液微萃取再進(jìn)行熒光標(biāo)記，樣品中沙丁胺醇的萃取率將大大降低，降低了后續(xù)的檢測(cè)效果。

所用熒光試劑也可以稱之為衍生化試劑。本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)，選擇2-(11H-苯[a]咔唑)乙基氯甲酸酯，簡(jiǎn)稱BCEC-Cl作為熒光試劑。與其他熒光試劑相比，本發(fā)明所用的BCEC-Cl穩(wěn)定性好、檢測(cè)靈敏度更高。該BCEC-Cl可以按照現(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)的方法制備，例如文獻(xiàn)：Wu H,Li G,Liu S,et al.Monitoring the contents of six steroidal and phenolic endocrine disrupting chemicals in chicken,fish and aquaculture pond water samples using pre-column derivatization and dispersive liquid–liquid microextraction with the aid ofexperimental design methodology[J].Food chemistry,2016,192:98-106.

進(jìn)一步的，飼料或肉類食品烘干后再進(jìn)行提取。

進(jìn)一步的，熒光標(biāo)記包括以下步驟：取4ml pH 7-10的緩沖溶液，加入40μL初步樣品溶液，然后加入熒光試劑乙腈溶液，震蕩后密封，在20-60℃反應(yīng)10-30min，即得熒光標(biāo)記的初步樣品溶液。

上述熒光標(biāo)記步驟中，熒光試劑的用量遠(yuǎn)大于其理論需求量。

上述熒光標(biāo)記步驟中，pH優(yōu)選為8.5-9.0。反應(yīng)溫度為優(yōu)選為40-50℃，反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為10-15min。

上述方法中，采用超聲輔助分散液液微萃取對(duì)待檢樣品進(jìn)行提取，操作簡(jiǎn)單、快速、省時(shí)，降低了有機(jī)溶劑的使用量，大大提高了檢測(cè)效率。本發(fā)明方法可以用于飼料或肉類食品中沙丁胺醇的檢測(cè)，所述的肉類食品包括雞肉、豬肉、魚肉等生肉或熟肉，還包括以這些肉類為原料進(jìn)行加工得到的半成品或成品。

上述步驟(1)中，乙腈和水的混合溶液中，乙腈的體積含量?jī)?yōu)選為80％。

上述步驟(1)中，飼料或肉類食品用乙腈和水的混合溶液進(jìn)行超聲萃取，混合溶液的量可以自行調(diào)整，超聲的時(shí)間一般為5min，快速、省時(shí)。

上述步驟(1)中，每1g飼料或肉類食品經(jīng)超聲萃取、干燥所得的提取物用1ml水溶解。用水溶解后的液體最好用0.22μm的膜過(guò)濾除雜。

上述步驟(3)中，所述分散劑為乙腈、丙酮、甲醇或乙醇，優(yōu)選為丙酮。

上述步驟(3)中，所述萃取劑為二氯甲烷、氯仿或四氯化碳，優(yōu)選為二氯甲烷。

上述步驟(3)中，分散劑、萃取劑和待測(cè)樣品溶液的體積比為500-1500μL：50-150μL：1.5-5.5ml，優(yōu)選為1400μL：145μL：4ml。

上述步驟(3)中，氯化鈉在混合液中的重量體積分?jǐn)?shù)為0-5％，不包括0％，優(yōu)選為1％。

上述步驟(3)中，超聲萃取時(shí)間為2-6min，優(yōu)選為2.5min。該萃取時(shí)間短、效率高，省時(shí)省力。

步驟(3)中，每4ml初步樣品溶液經(jīng)超聲輔助分散液液微萃取、保護(hù)性氣體吹干所得的產(chǎn)物用0.5ml甲醇復(fù)溶。

進(jìn)一步的，本發(fā)明檢測(cè)方法采用外標(biāo)法檢測(cè)飼料或肉類食品中的沙丁胺醇。同樣的，外標(biāo)法所用的沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品在進(jìn)入高效液相色譜儀前采用與初步樣品溶液同樣的熒光標(biāo)記方法進(jìn)行熒光標(biāo)記。步驟包括：取沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液，調(diào)整pH，然后加入熒光試劑乙腈溶液，震蕩后密封反應(yīng)，即得熒光標(biāo)記的沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

進(jìn)一步的，本發(fā)明高效液相色譜條件如下：色譜柱為Hypersil C18，流動(dòng)相A：體積分?jǐn)?shù)30％的甲醇水溶液；B:體積分?jǐn)?shù)70％的甲醇水溶液，梯度洗脫條件：0～5min(30-90％B),5～7min(90-100％B),8～10min(100-100％B)；流速為1.0mLmin^-1，柱溫＝30℃；熒光檢測(cè)時(shí)，λ_ex＝279nm，λ_em＝380nm。

本發(fā)明有益效果為：本發(fā)明提供了一種飼料或肉類食品中沙丁胺醇的檢測(cè)方法，該方法采用熒光衍生試劑BCEC-Cl作為熒光標(biāo)記試劑，通過(guò)衍生化反應(yīng)對(duì)沙丁胺醇進(jìn)行熒光標(biāo)記，結(jié)合超聲輔助分散液液微萃取技術(shù)對(duì)待檢樣品進(jìn)行處理，系統(tǒng)的優(yōu)化了熒光標(biāo)記和萃取條件，使萃取效率高、用時(shí)短、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)準(zhǔn)確度高。本發(fā)明能夠在較短時(shí)間內(nèi)完成沙丁胺醇的檢測(cè)，并且樣品使用量少、有機(jī)溶劑用量也較少，檢測(cè)效率高，成本低，沙丁胺醇的檢出限在1ng mL^-1以下，靈敏度大大提升，本發(fā)明方法能夠成功的應(yīng)用到飼料和豬肉、雞肉、魚肉等實(shí)際樣品的測(cè)定中，為沙丁胺醇的檢測(cè)提供了新的思路。

附圖說(shuō)明

圖1萃取劑的種類、分散劑的種類、pH值、鹽含量和樣品溶液的體積與峰面積的關(guān)系曲線。

圖2時(shí)間和萃取劑對(duì)響應(yīng)值的影響的響應(yīng)面圖。

圖3時(shí)間和分散劑對(duì)響應(yīng)值的影響的響應(yīng)面圖。

圖4萃取劑和分散劑對(duì)響應(yīng)值的影響的響應(yīng)面圖。

圖5沙丁胺醇的標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖(A)和市購(gòu)豬肉樣品(B)所得的HPLC色譜圖。

圖6市購(gòu)雞肉樣品(C)和魚肉樣品(D)所得的HPLC色譜圖。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明原理及優(yōu)勢(shì)進(jìn)行解釋和說(shuō)明，以便本領(lǐng)域技術(shù)人員更好的理解本發(fā)明。下述說(shuō)明僅是示例性的，并不對(duì)其內(nèi)容進(jìn)行限定。

實(shí)施例1超聲輔助分散液液微萃取條件的篩選與優(yōu)化

1、儀器與試劑

Agilent 1100HPLC–FLD(美國(guó)，Agilent公司)配四元梯度泵，在線真空脫氣機(jī)，自動(dòng)進(jìn)樣器；半制備高效液相色譜(Waters600E，美國(guó)，Waters公司)，Hypersil C18(4.6mm×200mm,5μm)色譜柱(Agilent公司)。

衍生試劑(即熒光試劑)2-(11H-苯[a]咔唑)乙基氯甲酸酯(BCEC-Cl，自制).

沙丁胺醇(美國(guó)sigma公司)，乙腈(光譜純，德國(guó)，Merck公司)，二氯甲烷(CH₂Cl₂,分析純，中國(guó)禹王試劑公司)，氯仿(CHCl₃,分析純，中國(guó)禹王試劑公司)，四氯化碳(CCl₄,分析純，中國(guó)禹王試劑公司)，丙酮(分析純，中國(guó)禹王試劑公司)，甲醇(光譜純，德國(guó)，Merck公司)，乙醇(光譜純，德國(guó)，Merck公司)，水由Milli-Q超純水系統(tǒng)制備。

2、色譜條件

高效液相色譜條件：色譜柱為Hypersil C18(4.6mm×200mm,5μm)。流動(dòng)相A：體積分?jǐn)?shù)30％甲醇水溶液；流動(dòng)相B:體積分?jǐn)?shù)70％甲醇水溶液。梯度洗脫條件：0～5min(30-90％B),5～7min(90-100％B),8～10min(100-100％B)；流速為1.0mLmin^-1,進(jìn)樣量＝10μL；柱溫＝30℃；熒光檢測(cè)的λ_ex＝279nm，λ_em＝380nm。

3、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

(1)沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確取一定量沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配成1.0×10^-3mol L^-1的溶液。

(2)衍生試劑溶液：用10mL乙腈溶解準(zhǔn)確稱取16.15mg的BCEC-Cl，其濃度為5.0×10^-3mol L^-1。

4、外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品和實(shí)際樣品處理

4.1因?qū)嶋H樣品中一般不含沙丁胺醇，所以采用在樣品中加入沙丁胺醇的方式模擬含有沙丁胺醇的樣品。取從當(dāng)?shù)爻?山東曲阜，中國(guó))購(gòu)買的豬肉、雞肉或魚肉，烘干后粉碎。精確稱取1g豬肉、雞肉或魚肉粉，按照5μg/kg的量加入沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品，攪拌混勻，作為待檢樣品，將待檢樣品用4mL的乙腈－水(80:20，v/v)萃取兩次，超聲5min，離心5min(5000rpm)。隨后，將收集的上清液在氮?dú)庀赂稍?，再?mL水溶解，然后通過(guò)0.22μm的尼龍過(guò)濾器過(guò)濾，得初步樣品溶液。

4.2衍生化

向10mL離心管中加入4mLpH＝8.5-9的硼酸鈉緩沖鹽，40μL沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液或初步樣品溶液，60μL衍生試劑溶液，將離心管震蕩10s后，密封，于40-50℃反應(yīng)10-15min，取出冷卻后備用。衍生反應(yīng)方程式如下：

4.3超聲輔助分散液液微萃取

將分散劑與萃取劑混合均勻后，用注射器打入到盛NaCl溶液和衍生化的初步樣品溶液的離心管中，超聲萃取，然后離心，取底層小液滴用氮?dú)獯蹈桑眉状紡?fù)溶，過(guò)0.22μm膜，得待測(cè)樣品溶液。

5、實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果

5.1將衍生化(即熒光標(biāo)記)的沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液用甲醇稀釋至不同濃度，然后按照上述色譜條件進(jìn)行高相液相色譜檢測(cè)，繪制峰面積對(duì)沙丁胺醇濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

5.2為了獲得更高的萃取效率，對(duì)影響超聲輔助分散液液微萃取的六個(gè)重要的參數(shù)(萃取劑的種類和分散劑的種類，pH值，鹽效應(yīng)和樣品溶液的體積)進(jìn)行了單因素優(yōu)化，各參數(shù)與峰面積的關(guān)系曲線見(jiàn)圖1。

5.2.1萃取劑的種類的影響

萃取劑可以顯著影響液液微萃取的提取效率。本發(fā)明選擇氯化溶劑(例如二氯甲烷，氯仿和四氯化碳)作為萃取劑，該類萃取劑具有水溶解度低，密度大于水，能溶解分析物等特點(diǎn)。結(jié)果表明，二氯甲烷，氯仿和四氯化碳都可以取得一定的提取效果，但二氯甲烷比其他的提取效果要好，更適合擁有羥基和叔胺官能團(tuán)的沙丁胺醇的萃取。因此，二氯甲烷為優(yōu)選的萃取劑。

5.2.2分散劑的種類的影響

分散劑的作用是使各成分充分混溶，本發(fā)明選取乙腈，丙酮，甲醇和乙醇作為分散劑。結(jié)果表明，丙酮比其他溶劑更適合作為沙丁胺醇的提取劑。因此，丙酮為優(yōu)選的分散劑。

5.2.3pH值的影響

待檢樣品溶液的pH可以顯著影響提取效率，尤其是當(dāng)目標(biāo)為堿性或酸性化合物時(shí)。本次對(duì)溶液的pH值(由4至10)進(jìn)行了的研究。結(jié)果表明，不同的pH值對(duì)提取結(jié)果無(wú)明顯影響，這主要是因?yàn)樵诔曒o助分散液液微萃取之前，沙丁胺醇的酚羥基和胺基已經(jīng)被衍生試劑的基團(tuán)取代，因此，選擇中性的pH。

5.2.4鹽效應(yīng)的影響

離子強(qiáng)度的增加會(huì)導(dǎo)致分析物在樣品溶液中的溶解度下降，從而可以提高提取效率。為調(diào)查離子強(qiáng)度對(duì)超聲輔助分散液液微萃取的提取效率的影響，本發(fā)明研究了在其他實(shí)驗(yàn)條件保持恒定的情況下，控制樣品溶液中NaCl的濃度(0～5％，重量/體積)對(duì)萃取效率的影響。結(jié)果表明，過(guò)多的增加離子強(qiáng)度不會(huì)顯著提高萃取效率；與此相反，在較高的離子強(qiáng)度不益于沙丁胺醇的衍生產(chǎn)物的超聲輔助分散液液微萃取。因此，氯化鈉濃度選擇(1％，重量/體積)。

5.2.5樣品溶液的體積的影響

超聲輔助分散液液微萃取的提取效率可以通過(guò)增加樣品的體積得以提高，因?yàn)樵黾拥臉颖倔w積可為目標(biāo)化合物從水相轉(zhuǎn)移到萃取劑的有機(jī)相提供一個(gè)正向的效應(yīng)。本發(fā)明考察了樣品體積從1.5mL到5.5mL對(duì)超聲輔助分散液液微萃取的影響。結(jié)果表明，樣品體積由1.5mL增加至4mL,峰面積的波動(dòng)較??；由4.5mL增加至5.5mL，峰面積反而有所降低。所以，優(yōu)選4mL為樣品體積。

5.3對(duì)提取時(shí)間(T)，萃取劑的體積(EV)和分散劑的體積(DV)采用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化。

根據(jù)BBD設(shè)計(jì)，優(yōu)化包括17組實(shí)驗(yàn)(見(jiàn)下表1)。基于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，獲得了可以預(yù)測(cè)的最佳點(diǎn)的回歸方程。預(yù)測(cè)的二階多項(xiàng)式模型如下：

Y＝12.60–0.40X₁+2.40X₂+2.80X₃–2.40X₁X₂+2.81X₁X₃–0.89X₂X₃–3.68X₁²–2.05X₂²–4.08X₃²

式中，Y是預(yù)測(cè)的平均峰面積；X₁，X₂和X₃分別為超聲時(shí)間(T)，萃取劑的體積(EV)和分散劑的體積(DV)。

表1響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

響應(yīng)面曲線可以反映出各變量之間的相互作用關(guān)系(見(jiàn)圖2-4)。圖2展示了在分散劑的體積固定時(shí)，超聲時(shí)間和萃取劑體積之間的相互作用關(guān)系，當(dāng)超聲時(shí)間由2min增加到6min時(shí)，峰面積先迅速增加，達(dá)到一個(gè)最大值，然后略有下降；萃取劑體積從50μL增加到150μL時(shí)，峰面積一直增加。圖3展現(xiàn)了當(dāng)萃取劑體積一定時(shí)超聲時(shí)間和分散劑的體積之間的相互作用關(guān)系，分散劑的體積由500μL增加到1500μL時(shí)，峰面積首先表現(xiàn)是增加的趨勢(shì)，在1300μL附近達(dá)到最高值，然后有少許下降；超聲時(shí)間的趨勢(shì)是與圖2基本一致。圖4描述的是萃取劑的體積和分散劑的體積之間的相互作用關(guān)系，峰面積隨著分散劑的體積的增加表現(xiàn)為顯著增加，達(dá)到峰值后有所下降；峰面積隨著萃取劑體積的增加而增加。

上述結(jié)果表明,該模型顯著(p<0.05)，且實(shí)驗(yàn)值與模型預(yù)測(cè)值之間有高度的相關(guān)性(R²＝0.9125)。通過(guò)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，軟件評(píng)估出的最佳超聲輔助分散液液微萃取條件分別為萃取劑體積為145μL，分散劑體積為1400μL和超聲時(shí)間為2.5min。在最佳的條件下，峰面積預(yù)測(cè)值為9.85，實(shí)際的測(cè)量值為9.98，兩者非常接近。預(yù)測(cè)值和測(cè)量值之間的良好的相關(guān)性驗(yàn)證了該響應(yīng)模型是適當(dāng)?shù)?，足以體現(xiàn)預(yù)期的優(yōu)化。

實(shí)施例2

根據(jù)實(shí)施例1的優(yōu)化，得到了本發(fā)明優(yōu)選的檢測(cè)方法，其具體如下：

1、色譜條件

高效液相色譜條件：色譜柱為Hypersil C18(4.6mm×200mm,5μm)。流動(dòng)相A：體積分?jǐn)?shù)30％甲醇水溶液；流動(dòng)相B:體積分?jǐn)?shù)70％甲醇水溶液。梯度洗脫條件：0～5min(30-90％B),5～7min(90-100％B),8～10min(100-100％B)；流速為1.0mL min^-1,進(jìn)樣量＝10μL；柱溫＝30℃；熒光檢測(cè)的λ_ex＝279nm，λ_em＝380nm。

2、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

(1)沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確取一定量沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配成1.0×10^-3mol L^-1的溶液，備用。

(2)衍生試劑溶液：用10mL乙腈溶解準(zhǔn)確稱取16.15mg的BCEC-Cl，其濃度為5.0×10^-3mol L^-1。

3、外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品和實(shí)際樣品處理

3.1精確稱取1g待飼料或測(cè)肉類食品，用4mL的乙腈－水(80:20，v/v)萃取兩次，超聲5min，離心5min(5000rpm)。隨后，將收集的上清液在氮?dú)庀赂稍?，再?mL水溶解，然后通過(guò)0.22μm的尼龍過(guò)濾器過(guò)濾，得初步樣品溶液。

3.2衍生化

向10mL離心管中加入4mLpH＝8.5-9的硼酸鈉緩沖鹽，40μL沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液或初步樣品溶液，60μL衍生試劑溶液，將離心管震蕩10s后，密封，于40-50℃反應(yīng)10-15min，得衍生化標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液或初步樣品溶液，取出冷卻后備用。

3.3超聲輔助分散液液微萃取

取4ml衍生化初步樣品溶液，加入氯化鈉溶液至氯化鈉濃度為1％，然后加入145μL二氯甲烷(萃取劑)和1400μL丙酮(分散劑)的混合溶液，超聲2.5min，離心分5min(5000r min^-1)，兩相分離，取底層小液滴用氮?dú)獯蹈桑?.5mL甲醇復(fù)溶，過(guò)0.22μm膜，得待測(cè)樣品溶液。

4、檢測(cè)方法

采用外標(biāo)法，將衍生化的儲(chǔ)備液用甲醇稀釋，得到一系列不同濃度的衍生化沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用上述色譜條件對(duì)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行高相液相色譜-熒光檢測(cè)，繪制濃度對(duì)峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取衍生化的待測(cè)樣品溶液，按照相同的色譜條件進(jìn)行高相液相色譜-熒光檢測(cè)，得到峰面積，根據(jù)峰面積計(jì)算沙丁胺醇的含量。

5、為了檢測(cè)該方法的可行性，根據(jù)USP指導(dǎo)對(duì)該方法進(jìn)行驗(yàn)證。方法驗(yàn)證具體如下：

5.1標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍和檢出限、定量限

步驟：用沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液制成0-1000ngmL^-1的一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制沙丁胺醇濃度對(duì)峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線。以3倍基線噪聲所對(duì)應(yīng)的沙丁胺醇的濃度為其檢測(cè)限，以10倍基線噪聲所對(duì)應(yīng)的沙丁胺醇的濃度為其定量限。

結(jié)果：本方法在0-1000ng mL^-1濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，所得線性回歸方程見(jiàn)表2，其相關(guān)性系數(shù)為0.9998。經(jīng)驗(yàn)證，其LOD(S/N＝3：1)和LOQ(S/N＝10：1)分別為0.2ng mL^-1和1.1ng mL^-1，這表明，該方法具有良好的靈敏度。

表2線性回歸方程，R，檢出限，定量限，重現(xiàn)性和精度

將本發(fā)明方法和現(xiàn)有技術(shù)中報(bào)道的其他樣品處理方法和分析方法所得的沙丁胺醇的檢測(cè)限和定量限進(jìn)行比較，結(jié)果如下表3所示。從表中可以看出，在樣品處理方面，相比SPE，本發(fā)明UA-DLLME可以克服SPE操作繁瑣的缺點(diǎn)，展現(xiàn)出包括操作簡(jiǎn)單，省時(shí)顯著，節(jié)約化學(xué)試劑和具有良好的高富集系數(shù)低等優(yōu)勢(shì)。在靈敏度方面，本發(fā)明所建立的方法具有其他方法更低LOD和LOQ。MS雖然能提供較低的檢測(cè)極限，但其需要同位素內(nèi)標(biāo)，設(shè)備是昂貴的，且并沒(méi)有達(dá)到普及的水平，而與MS相比，本發(fā)明具有高效率和靈敏度的HPLC-FLD方法能被廣泛地應(yīng)用于常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)室中。此外，本發(fā)明熒光標(biāo)記和隨后的UA-DLLME的超聲時(shí)間分別為10min和2.5min，時(shí)間短，省時(shí)高效。

表3方法比較

文獻(xiàn)1：Tyagi A,Sharma N,Mittal K,et al.HPTLC-Densitometric and RP-HPLC Method Development and Validation for Determination ofSalbutamol Sulphate,Bromhexine Hydrochloride and Etofylline in Tablet Dosage Forms[J].PharmaceuticaAnalyticaActa,2015:1-5

文獻(xiàn)2：Rosales‐Conrado N,Dell'Aica M,León‐González M E,et al.Determination of salbutamol by direct chiral reversed‐phase HPLC using teicoplanin as stationary phase and its application to natural water analysis[J].Biomedical Chromatography,2013,27(11):1413-1422.

文獻(xiàn)3：Zhang D,Teng Y,Chen K,et al.Determination of salbutamol in human plasma and urine using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry and its pharmacokinetic study[J].Biomedical Chromatography,2012,26(10):1176-1182.

文獻(xiàn)4：Wu Y Y,Shi W X,Chen S Q.Determination of beta-estradiol,bisphenol A,diethylstilbestrol and salbutamol in human urine by GC/MS[J].Medical sciences,2009,38(3):235-241.

5.2重復(fù)性和精確度

在相同的最佳色譜條件下平行檢測(cè)6次，得到的保留時(shí)間和峰面積的RSD分別為0.03％和0.51％,重復(fù)性良好。連續(xù)3天內(nèi)對(duì)沙丁胺醇的衍生物平行分析6次，測(cè)得的日內(nèi)平均和日間平均的精密度分別為0.4％和1.2％，見(jiàn)表2。

5.3準(zhǔn)確度

按照表4的數(shù)據(jù)向?qū)嶋H樣品中添加已知的三個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品(1μg/kg，5μg/kg和10μg/kg)并測(cè)其回收率，測(cè)得的回收率結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，回收率在95.0-101.4％的范圍內(nèi)，且RSD小于3.1％。

表4實(shí)際樣品的回收率(n＝6)

5.4魯棒性

魯棒性是考察對(duì)分離的色譜條件進(jìn)行較小的改變對(duì)分離結(jié)果的影響。對(duì)流速和柱溫分別進(jìn)行1±0.2mg·mLmin^-1和30±1℃的改變，得到了觀察微不足道的變化，表明魯棒性良好。

綜上所述，該方法具有良好的線性，滿意的重復(fù)性，可接受的魯棒性，良好的精密度和準(zhǔn)確度，具有可應(yīng)用性。

實(shí)施例3

以豬肉為樣品，對(duì)衍生化條件進(jìn)行篩選和優(yōu)化，方法如下：

1、色譜條件

同實(shí)施例2。

2、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

同實(shí)施例2。

3、外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品和實(shí)際樣品處理

3.1取從當(dāng)?shù)爻匈?gòu)買的豬肉，烘干后粉碎。精確稱取1g豬肉粉，按照2μg/kg的量加入沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品，攪拌混勻，作為待檢樣品，用4mL的乙腈－水(80:20，v/v)萃取兩次，超聲5min，離心5min(5000rpm)。隨后，將收集的上清液在氮?dú)庀赂稍?，再?mL水溶解，然后通過(guò)0.22μm的尼龍過(guò)濾器過(guò)濾，得初步樣品溶液。

3.2衍生化

按照下述四種方法進(jìn)行衍生化處理：

方法一：向10mL離心管中加入4mLpH＝8.5-9.0的硼酸鈉緩沖鹽，40μL沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液或初步樣品溶液，60μL衍生試劑溶液，將離心管震蕩10s后，密封，于40-50℃反應(yīng)10-15min，取出冷卻后備用。

方法二：向10mL離心管中加入4mLpH＝7-8的硼酸鈉緩沖鹽，60μL沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液或初步樣品溶液，90μL衍生試劑溶液，將離心管震蕩10s后，密封，于20-25℃反應(yīng)30min，取出冷卻后備用。

方法三：向10mL離心管中加入4mLpH＝9.5-10的硼砂氫氧化鈉緩沖液，40μL沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液或初步樣品溶液，60μL衍生試劑溶液，將離心管震蕩10s后，密封，于55-60℃反應(yīng)10min，取出冷卻后備用。

方法四：向10mL離心管中加入4mLpH＝5-6的磷酸鹽緩沖液，60μL沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液或初步樣品溶液，60μL衍生試劑溶液，將離心管震蕩10s后，密封，于80℃反應(yīng)10min，取出冷卻后備用。

3.3超聲輔助分散液液微萃取

將上述四種方法得到的衍生化初步樣品溶液分別按照實(shí)施例23.3的超聲輔助分散液液微萃取方法進(jìn)行萃取，得到待測(cè)樣品溶液1、2、3、4。

4、檢測(cè)方法

采用外標(biāo)法，對(duì)衍生化的待測(cè)樣品溶液進(jìn)行檢測(cè)，各樣品中沙丁胺醇的峰面積和含量如下表5所示。

表5

從以上結(jié)果可以看出，衍生化時(shí)pH、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果均有影響，衍生化條件為：pH8.5-9.0，反應(yīng)溫度40-50℃、反應(yīng)時(shí)間10-15min時(shí)效果最佳。

實(shí)施例4

采用本發(fā)明方法對(duì)本地豬肉、雞肉和魚肉中沙丁胺醇的含量進(jìn)行檢測(cè)，方法如下：

1、色譜條件

同實(shí)施例2。

2、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

同實(shí)施例2。

3、外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品和實(shí)際樣品處理

3.1取從當(dāng)?shù)爻匈?gòu)買豬肉、雞肉和魚肉，烘干后粉碎。分別精確稱取1g豬肉、雞肉和魚肉粉，用4mL的乙腈－水(80:20，v/v)萃取兩次，超聲5min，離心5min(5000rpm)。隨后，將收集的上清液在氮?dú)庀赂稍?，再?mL水溶解，然后通過(guò)0.22μm的尼龍過(guò)濾器過(guò)濾，得初步樣品溶液。

3.2衍生化

同實(shí)施例2。

3.3超聲輔助分散液液微萃取

同實(shí)施例2。

4、檢測(cè)方法

采用外標(biāo)法，對(duì)衍生化的待測(cè)樣品溶液進(jìn)行檢測(cè)，各樣品所得的色譜圖如圖5和6所示。從圖中可以看出，豬肉、魚肉和雞肉中均未檢測(cè)到沙丁胺醇，由此可知，該地區(qū)對(duì)沙丁胺醇的控制還是十分有效的。

對(duì)比例1

以豬肉和魚肉作為待檢樣品，按照實(shí)施例2的方法制備待測(cè)樣品溶液和對(duì)待測(cè)樣品溶液進(jìn)行檢測(cè)，不同的是：初步樣品溶液先進(jìn)行分散液液微萃取，再進(jìn)行熒光標(biāo)記，步驟如下：

取從當(dāng)?shù)爻?山東曲阜，中國(guó))購(gòu)買的豬肉或魚肉，烘干后粉碎。精確稱取1g豬肉或魚肉粉，按照10μg/kg的量加入沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品，攪拌混勻，作為待檢樣品，將待檢樣品用4mL的乙腈－水(80:20，v/v)萃取兩次，超聲5min，離心5min(5000rpm)。隨后，將收集的上清液在氮?dú)庀赂稍?，再?mL水溶解，然后通過(guò)0.22μm的尼龍過(guò)濾器過(guò)濾，得初步樣品溶液。

取4ml初步樣品溶液，加入氯化鈉溶液至氯化鈉濃度為1％，然后加入145μL二氯甲烷(萃取劑)和1400μL丙酮(分散劑)的混合溶液，超聲2.5min，離心分5min(5000r min^-1)，兩相分離，取底層小液滴用氮?dú)獯蹈桑?.5mL甲醇復(fù)溶，過(guò)0.22μm膜，備用。

向10mL離心管中加入4mLpH＝9的硼酸鈉緩沖鹽，40μL沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液或液液微萃取后的初步樣品溶液，60μL衍生試劑溶液，將離心管震蕩10s后，密封，于50℃反應(yīng)10min，取出冷卻，得待測(cè)樣品溶液。

采用外標(biāo)法，待測(cè)樣品溶液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如下表6所示。

表6

對(duì)比例2

1、色譜條件

同實(shí)施例2。

2、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

同實(shí)施例2。

3、外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品和實(shí)際樣品處理

3.1取從當(dāng)?shù)爻匈?gòu)買豬肉和魚肉，烘干后粉碎。精確稱取1g豬肉和魚肉粉，按照10μg/kg的量加入沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品，用4mL的乙腈－水(80:20，v/v)萃取兩次，超聲5min，離心5min(5000rpm)。隨后，將收集的上清液在氮?dú)庀赂稍?，再?mL水溶解，然后通過(guò)0.22μm的尼龍過(guò)濾器過(guò)濾，得初步樣品溶液。

3.2衍生化

同實(shí)施例2。

3.3超聲輔助分散液液微萃取

取4ml初步樣品溶液，加入氯化鈉溶液至氯化鈉濃度為6％，然后加入36μL二氯甲烷(萃取劑)和1645μL丙酮(分散劑)的混合溶液，超聲2.5min，離心分5min(5000r min^-1)，兩相分離，取底層小液滴用氮?dú)獯蹈桑?.5mL甲醇復(fù)溶，過(guò)0.22μm膜，備用。

4、檢測(cè)方法

采用外標(biāo)法，對(duì)衍生化的待測(cè)樣品溶液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)下表7。

表7

對(duì)比例3

采用實(shí)施例2的方法檢測(cè)食品中萊克多巴胺的含量，步驟如下：

1、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

(1)萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液：準(zhǔn)確取一定量萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配成1.0×10^-3mol L^-1的溶液。

(2)衍生試劑溶液：用10mL乙腈溶解準(zhǔn)確稱取16.15mg的BCEC-Cl，其濃度為5.0×10^-3mol L^-1。

2、樣品溶液配制

因?qū)嶋H樣品中一般不含萊克多巴胺，所以采用在樣品中加入萊克多巴胺的方式模擬含有萊克多巴胺的樣品。精確稱取1g豬肉，干燥后粉碎，按照10μg/kg的量加入萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品，攪拌混勻，作為待檢樣品，將待檢樣品用4mL的乙腈－水(80:20，v/v)萃取兩次，超聲5min，離心5min(5000rpm)。隨后，將收集的上清液在氮?dú)庀赂稍?，再?mL水溶解，然后通過(guò)0.22μm的尼龍過(guò)濾器過(guò)濾，得初步樣品溶液。

3、衍生化處理

3.1、向10mL離心管中加入4mLpH＝8.5-9的硼酸鈉緩沖鹽，40μL萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液或初步樣品溶液，60μL衍生試劑溶液，將離心管震蕩10s后，密封，于40-50℃反應(yīng)10-15min，取出冷卻后備用。

3.2、取4ml衍生化初步樣品溶液，加入氯化鈉溶液至氯化鈉濃度為1％，然后加入145μL二氯甲烷(萃取劑)和1400μL丙酮(分散劑)的混合溶液，超聲2.5min，離心分5min(5000r min^-1)，兩相分離，取底層小液滴用氮?dú)獯蹈?，?.5mL甲醇復(fù)溶，過(guò)0.22μm膜，得待測(cè)樣品溶液。

4、HPLC-FLD檢測(cè)

4.1采用外標(biāo)法，將衍生化的儲(chǔ)備液用甲醇稀釋，得到一系列不同濃度的衍生化萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用下述色譜條件對(duì)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行高相液相色譜-熒光檢測(cè)，繪制濃度對(duì)峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線。色譜條件：色譜柱為Hypersil C18(4.6mm×200mm,5μm)。流動(dòng)相A：體積分?jǐn)?shù)30％甲醇水溶液；流動(dòng)相B:體積分?jǐn)?shù)70％甲醇水溶液。梯度洗脫條件：0～5min(30-90％B),5～7min(90-100％B),8～10min(100-100％B)；流速為1.0mL min^-1,進(jìn)樣量＝10μL；柱溫＝30℃；熒光檢測(cè)的λ_ex＝279nm，λ_em＝380nm。

4.2取衍生化的待測(cè)樣品溶液，按照相同的色譜條件進(jìn)行高相液相色譜-熒光檢測(cè)，結(jié)果如表8所示。

表8