本發(fā)明涉及一種色譜分析分離方法，尤其是一種分析分離對苯基苯甲?？屏?nèi)酯對映異構(gòu)體的高效液相色譜法。

技術(shù)背景

前列腺素(Prostaglandins，縮寫PGs)是一類重要的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)，在體內(nèi)各個組織中廣泛存在，是多種生理過程的重要介質(zhì)，對人體具有多種生理調(diào)節(jié)功能。對苯基苯甲?？屏?nèi)酯(Corey lactone phenylbenzoate)是合成前列腺素藥物的一種常用中間體和起始原料，分子式為C₂₁H₂₀O₅，化學名為：六氫-4-(羥甲基)-2-氧代-2H-環(huán)戊并[b]呋喃-5-基1,1'-聯(lián)苯-4-甲酸酯，通用名為：對苯基苯甲?？屏?nèi)酯，結(jié)構(gòu)式為：

該分子存在4個手性中心，理論上存在多個光學異構(gòu)體，但根據(jù)其反應機理及合成方法推斷，只存在一對對映異構(gòu)體，即(3aS,4R,5S,6aR)-(+)-六氫-4-(羥甲基)-2-氧代-2H-環(huán)戊并[b]呋喃-5-基1,1'-聯(lián)苯-4-甲酸酯((+)-對苯基苯甲?？屏?nèi)酯)和(3aR,4S,5R,6aS)-(-)-六氫-4-(羥甲基)-2-氧代-2H-環(huán)戊并[b]呋喃-5-基1,1'-聯(lián)苯-4-甲酸酯((-)-對苯基苯甲?？屏?nèi)酯)。二者互為對映異構(gòu)體雜質(zhì)在后續(xù)步驟中繼續(xù)參與反應，形成多種對應雜質(zhì)，進而影響前列腺素類藥物的質(zhì)量。因此，如何分析分離該對對映異構(gòu)體，提高前列腺素類藥物質(zhì)量，確保前列腺素類藥物的純度及安全性，是目前需要解決的技術(shù)問題。

目前，含有手性碳原子的對苯基苯甲?？屏?nèi)酯對映異構(gòu)體的分析與分離一直是前列腺素類藥物合成和質(zhì)量控制的關(guān)鍵問題。然而，關(guān)于對苯基苯甲?？屏?nèi)酯對映異構(gòu)體分析分離方法未見報道。

因此，有必要建立一種分析分離對苯基苯甲?？屏?nèi)酯對映異構(gòu)體的方法，能夠有效分析分離該對對映異構(gòu)體，控制雜質(zhì)含量，提高目標產(chǎn)物純度，進而提高前列腺素類藥物質(zhì)量。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種采用手性色譜柱以正向混合溶劑為流動相的HPLC方法，該方法能夠簡單、準確、高效分析分離對苯基苯甲?？屏?nèi)酯對映異 構(gòu)體，從而進行質(zhì)量控制，同時也可以用來制備高純度單一旋光性的對苯基苯甲酰科立內(nèi)酯

本發(fā)明提供了一種HPLC分析分離對苯基苯甲?？屏?nèi)酯對映異構(gòu)體的方法，其采用多糖衍生物正相涂敷型手性色譜柱，具體為硅膠表面涂覆有直鏈淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)手性色譜柱并使用正相色譜法分離測定。

進一步地，本發(fā)明所述的正相色譜法所使用的流動相為無水乙醇溶劑。

本發(fā)明所述的分析分離方法，可按照以下方法實現(xiàn)：

(1)(±)-對苯基苯甲?？屏?nèi)酯用流動相溶解，配制成1mL含(±)-對苯基苯甲?？屏?nèi)酯1～10μg的供試品溶液；進樣量為1～20μL，較優(yōu)選的是5～10μL；

(2)設(shè)置流動相流速為0.2～0.8mL/min，優(yōu)選為0.3～0.5mL/min；檢測波長為265～280nm，較優(yōu)選為275nm；柱溫為室溫；

(3)取步驟(1)所制供試品溶液5～10μL注入手性色譜柱(250×4.6mm,5.0μm)，完成對苯基苯甲?？屏?nèi)酯對映異構(gòu)體的分析與分離。

本發(fā)明的創(chuàng)新點及有益效果是：

1.本發(fā)明采用直鏈淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)手性色譜柱；采用較優(yōu)選的流動相；選擇流動相溶解樣品，選用較優(yōu)的進樣量；選用較優(yōu)的波長；從而確保了樣品的穩(wěn)定性，提高了色譜峰的對稱性，并且有較好的分離效果。其中(+)-對苯基苯甲?？屏?nèi)酯和(-)-對苯基苯甲酰科立內(nèi)酯兩個對映異構(gòu)體先后出峰，分離度≥1.5，有效的分析分離對苯基苯甲?？屏?nèi)酯對映異構(gòu)體。

2.該分析分離方法簡單、快速、準確和高效，能夠確保對苯基苯甲酰科立內(nèi)酯對映異構(gòu)體的質(zhì)量可控性；本發(fā)明分析分離方法，也可以用來制備高純度單一旋光性的對苯基苯甲酰科立內(nèi)酯。

3.該技術(shù)克服了現(xiàn)有技術(shù)的不足，解決了對苯基苯甲?？屏?nèi)酯對映異構(gòu)體的分析分離問題，能夠有效控制對映異構(gòu)體雜質(zhì)含量，免除對映異構(gòu)體雜質(zhì)對后續(xù)合成反應的干擾，提高目標產(chǎn)物純度，提高前列腺素類藥物質(zhì)量，確保用藥安全。

由此可見，本發(fā)明開發(fā)一種分析分離對苯基苯甲?？屏?nèi)酯對映異構(gòu)體的HPLC方法是十分必要的

附圖說明

圖1：HPLC圖；色譜條件：色譜柱BC chiral AD-H(250×4.6mm,5.0μm)；流速0.4mL/min。

圖2：HPLC圖；色譜條件：色譜柱BC chiral AD-H(250×4.6mm,5.0μm)；流速0.8mL/min。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明一種分析分離對苯基苯甲?？屏?nèi)酯對映異構(gòu)體的HPLC方 法做進一步說明，但本發(fā)明的保護范圍并不限于實施例。

實施例1

儀器與條件

色譜柱：BC chiral AD-H(250×4.6mm,5.0μm)

流動相：無水乙醇

柱溫：室溫

流速：0.2mL/min

進樣體積：1μL

樣品濃度：10μg/mL

檢測波長：275nm

實驗步驟

精密量取(±)-對苯基苯甲?？屏?nèi)酯10mg，置于10mL容量瓶中，無水乙醇溶解并稀釋到刻度，搖勻，作為供試品母液。精密吸取供試品母液100μL，置于10mL容量瓶中，無水乙醇稀釋到刻度，配制成濃度為10μg/mL供試品溶液。取(±)-對苯基苯甲酰科立內(nèi)酯供試品溶液1μL進入液相色譜，記錄色譜圖。

實驗結(jié)果：(+)-對苯基苯甲?？屏?nèi)酯和(-)-對苯基苯甲?？屏?nèi)酯兩個對映異構(gòu)體的分離度為4.6，對苯基苯甲?？屏?nèi)酯對映異構(gòu)體能夠完全分離。

實施例2

儀器與條件

色譜柱：BC chiral AD-H(250×4.6mm,5.0μm)

流動相：無水乙醇

柱溫：室溫

流速：0.3mL/min

進樣體積：5μL

樣品濃度：5μg/mL

檢測波長：280nm

實驗步驟

精密量取(±)-對苯基苯甲?？屏?nèi)酯10mg，置于10mL容量瓶中，無水乙醇溶解并稀釋到刻度，搖勻，作為供試品母液。精密吸取供試品母液50μL，置于10mL容量瓶中，無水乙醇稀釋到刻度，配制成濃度為5μg/mL供試品溶液。取(±)-對苯基苯甲酰科立內(nèi)酯供試品溶液5μL進入液相色譜，記錄色譜圖。

實驗結(jié)果：(+)-對苯基苯甲?？屏?nèi)酯和(-)-對苯基苯甲?？屏?nèi)酯兩個對映異構(gòu)體的分離度為4.3，對苯基苯甲?？屏?nèi)酯對映異構(gòu)體能夠完全分離。

實施例3

儀器與條件

色譜柱：BC chiral AD-H(250×4.6mm,5.0μm)

流動相：無水乙醇

柱溫：室溫

流速：0.4mL/min

進樣體積：10μL

樣品濃度：1μg/mL

檢測波長：280nm

實驗步驟

精密量取(±)-對苯基苯甲?？屏?nèi)酯體10mg，置于10mL容量瓶中，無水乙醇溶解并稀釋到刻度，搖勻，作為供試品母液。精密吸取供試品母液10μL，置于10mL容量瓶中，無水乙醇稀釋到刻度，配制成濃度為1μg/mL供試品溶液。取(±)-對苯基苯甲?？屏?nèi)酯供試品溶液10μL進入液相色譜，記錄色譜圖。

實驗結(jié)果：見附圖1，(+)-對苯基苯甲?？屏?nèi)酯和(-)-對苯基苯甲?？屏?nèi)酯兩個對映異構(gòu)體的分離度為4.1，對苯基苯甲?？屏?nèi)酯對映異構(gòu)體能夠完全分離。

實施例4

儀器與條件

色譜柱：BC chiral AD-H(250×4.6mm,5.0μm)

流動相：無水乙醇

柱溫：室溫

流速：0.5mL/min

進樣體積：20μL

樣品濃度：1μg/mL

檢測波長：280nm

實驗步驟

精密量取(±)-對苯基苯甲酰科立內(nèi)酯10mg，置于10mL容量瓶中，無水乙醇溶解并稀釋到刻度，搖勻，作為供試品母液。精密吸取供試品母液10μL，置于10mL容量瓶中，無水乙醇稀釋到刻度，配制成濃度為1μg/mL供試品溶液。取(±)-對苯基苯甲?？屏?nèi)酯供試品溶液20μL進入液相色譜，記錄色譜圖。

實驗結(jié)果：(+)-對苯基苯甲?？屏?nèi)酯和(-)-對苯基苯甲?？屏?nèi)酯兩個對映異構(gòu)體的分離度為4.0，對苯基苯甲?？屏?nèi)酯對映異構(gòu)體能夠完全分離。

實施例5

儀器與條件

色譜柱：BC chiral AD-H(250×4.6mm,5.0μm)

流動相：無水乙醇

柱溫：室溫

流速：0.6mL/min

進樣體積：5μL

樣品濃度：5μg/mL

檢測波長：280nm

實驗步驟

精密量取(±)-對苯基苯甲酰科立內(nèi)酯10mg，置于10mL容量瓶中，無水乙醇溶解并稀釋到刻度，搖勻，作為供試品母液。精密吸取供試品母液50μL，置于10mL容量瓶中，無水乙醇稀釋到刻度，配制成濃度為5μg/mL供試品溶液。取(±)-對苯基苯甲?？屏?nèi)酯供試品溶液5μL進入液相色譜，記錄色譜圖。

實驗結(jié)果：(+)-對苯基苯甲酰科立內(nèi)酯和(-)-對苯基苯甲?？屏?nèi)酯兩個對映異構(gòu)體的分離度為3.8，對苯基苯甲?？屏?nèi)酯對映異構(gòu)體能夠完全分離。

實施例6

儀器與條件

色譜柱：BC chiral AD-H(250×4.6mm,5.0μm)

流動相：無水乙醇

柱溫：室溫

流速：0.8mL/min

進樣體積：10μL

樣品濃度：1μg/mL

檢測波長：280nm

實驗步驟

精密量取(±)-對苯基苯甲?？屏?nèi)酯10mg，置于10mL容量瓶中，無水乙醇溶解并稀釋到刻度，搖勻，作為供試品母液。精密吸取供試品母液10μL，置于10mL容量瓶中，無水乙醇稀釋到刻度，配制成濃度為1μg/mL供試品溶液。取(±)-對苯基苯甲?？屏?nèi)酯供試品溶液10μL進入液相色譜，記錄色譜圖。

實驗結(jié)果：見附圖2，(+)-對苯基苯甲?？屏?nèi)酯和(-)-對苯基苯甲?？屏?nèi)酯兩個對映異構(gòu)體的分離度為3.6，對苯基苯甲酰科立內(nèi)酯對映異構(gòu)體能夠完全分離。