本發(fā)明涉及一種合成抗原的分子量檢測(cè)方法及確定小分子化合物。

背景技術(shù)：

抗原(antigen)是一類能刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)，使之發(fā)生免疫應(yīng)答，產(chǎn)生抗體與致敏淋巴細(xì)胞等，并能與相應(yīng)抗體或致敏淋巴細(xì)胞在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的物質(zhì)?？乖隗w內(nèi)可以刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)生成特異性抗體，由于抗體與抗原是特異性結(jié)合，利用該原理開展的ELISA法或膠體金免疫層析法等檢測(cè)是目前臨床上常用的方法之一。

對(duì)于分子量小于1萬小分子化合物，往往不具有免疫原性，在體內(nèi)難以引起免疫反應(yīng)。為了獲得這類小分子化合物的抗體，因此要將小分子化合物合成具有免疫原性的大分子物質(zhì)。

抗原分子量測(cè)定是鑒定抗原(偶聯(lián)抗原)、抗體的一個(gè)主要監(jiān)控指標(biāo)?，F(xiàn)有的方法主要紫外分光光度法、SDS聚丙烯凝膠電泳、高效液相排阻色譜法(HPSEC)和液質(zhì)聯(lián)用法等。紫外分光光度法通過紫外吸收的大小進(jìn)行簡(jiǎn)單的加和估算偶聯(lián)的比例，其專屬性不強(qiáng)；SDS聚丙烯凝膠電泳通過mark的標(biāo)記可以粗略估算抗原合成的純度和分子量，但其準(zhǔn)確性較差；液質(zhì)聯(lián)用法能夠準(zhǔn)確的測(cè)定分子量及進(jìn)行純度確證，但其檢測(cè)成本高且需要對(duì)所測(cè)的譜圖進(jìn)行專業(yè)分析才能得到準(zhǔn)確的結(jié)果，該方法對(duì)儀器設(shè)備和技術(shù)人員的要求均較高，往往一般不易普及。目前可用于分子量的質(zhì)譜檢測(cè)方法有Q-TOF和MALDI-TOF，發(fā)明人曾采用Q-TOF對(duì)抗原分子量進(jìn)行檢測(cè)，數(shù)據(jù)分析表明：該方法對(duì)待測(cè)物質(zhì)的純度要求較高，如對(duì)BSA對(duì)照物質(zhì)能進(jìn)行準(zhǔn)確的測(cè)定，但對(duì)于本項(xiàng)目組制備的抗原樣品無法進(jìn)行解析。原因是本方法制備的抗原組分為非純化物質(zhì)，同時(shí)含有一系列類似的組分，無法得到Q-TOF圖譜典型的“五指峰”，因此該方法無法在本項(xiàng)目中應(yīng)用。

綜上所述，在合成抗原的研究和應(yīng)用中，缺少一種簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的合成抗原分子量檢測(cè)方法，本發(fā)明方法將彌足現(xiàn)有技術(shù)的缺憾，為抗原的研究和應(yīng)用提供技術(shù)參考。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種簡(jiǎn)便的合成抗原的分子量檢測(cè)方法。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

一種抗原分子量的檢測(cè)方法，包括如下步驟：

1)配置對(duì)照品溶液和待檢樣品溶液；

2)使用凝膠色譜法在相同的色譜條件下對(duì)對(duì)照品和待檢樣品進(jìn)行分析；

3)根據(jù)對(duì)照品的色譜結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

4)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待檢樣品的分子量。

作為上述檢測(cè)方法的進(jìn)一步改進(jìn)，對(duì)照品為IgG、BSA和馬心肌球蛋白。

作為上述檢測(cè)方法的進(jìn)一步改進(jìn)，對(duì)照品溶液為其水溶液。

作為上述檢測(cè)方法的進(jìn)一步改進(jìn)，對(duì)照品溶液的濃度為1mg/ml。

作為上述檢測(cè)方法的進(jìn)一步改進(jìn)，凝膠色譜法使用的色譜柱為Protein BEH SEC7.8mm×150mm。

作為上述檢測(cè)方法的進(jìn)一步改進(jìn)，凝膠色譜法中的流動(dòng)相為100mM磷酸鹽緩沖液，pH6.8。

作為上述檢測(cè)方法的進(jìn)一步改進(jìn)，凝膠色譜法中，色譜柱溫度為25℃。

作為上述檢測(cè)方法的進(jìn)一步改進(jìn)，凝膠色譜法中，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm。

作為上述檢測(cè)方法的進(jìn)一步改進(jìn)，凝膠色譜法中，進(jìn)樣量為5μL。

作為上述檢測(cè)方法的進(jìn)一步改進(jìn)，待檢品溶液的制備方法為：取待測(cè)樣品溶解于水中，濃度為1mg/ml，過0.45μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明提供的合成抗原分子量測(cè)定方法能夠應(yīng)用于合成抗原(抗原)、抗體及蛋白類大分子物質(zhì)的檢測(cè)，檢測(cè)的分子量范圍在16-150kDa之間。通過測(cè)定合成抗原分子量大小，再結(jié)合偶聯(lián)蛋白質(zhì)與小分子的分子量大小，就可以推算合成過程中，小分子與蛋白質(zhì)的偶聯(lián)比例。

與現(xiàn)有的檢測(cè)方法相比，本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單，數(shù)據(jù)處理難度極小，檢測(cè)結(jié)果可靠。

本發(fā)明方法可以對(duì)分子量大小不同的物質(zhì)成分進(jìn)行分離并可計(jì)算分子量大小，特別適合混合大分子物質(zhì)的測(cè)定。

附圖說明

圖1是流速為1.0ml/min下的lgM-出峰時(shí)間校正曲線圖；

圖2是流速為0.8ml/min下的lgM-出峰時(shí)間校正曲線圖；

圖3是免疫球蛋白對(duì)照品的色譜圖；

圖4是BSA對(duì)照品的色譜圖；

圖5是肌球蛋白對(duì)照品的色譜圖；

圖6是酚酞抗原樣品的色譜圖；

圖7是他達(dá)拉非抗原樣品的色譜圖

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。

實(shí)施例1

測(cè)定酚酞抗原的分子量方法

一、儀器與材料

1.1儀器設(shè)備：Agilent 1100系列液相色譜儀；Mollipore純水系統(tǒng)；

色譜柱：Protein BEH SEC(7.8mm×150mm)。

1.2對(duì)照物質(zhì)：人血清IgG(≥95％，SDS-PAGE，SLBK8678V，SIGMA-ALDRICH)；馬心肌球蛋白(≥90％，SDS-PAGE，SLBK8678V，SIGMA-ALDRICH)；血清白蛋白(牛)(BSA，批號(hào)：140619-201421，中國(guó)食品藥品檢定研究院)。

1.3試藥：磷酸氫二鈉、磷酸均為分析純。

二、檢測(cè)方法

色譜條件與系統(tǒng)適用性：色譜柱為Protein BEH SEC(7.8mm×150mm)；流動(dòng)相為100mM的磷酸鹽緩沖液(用磷酸調(diào)pH6.8)；流速為0.8mL/min；柱溫25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)280nm。

對(duì)照品溶液的制備：分別精密量取免疫球蛋白(IgG，分子量約150KDa)、小牛血清蛋白(BSA，分子量約66.7KDa)和肌球蛋白(馬心肌球蛋白，分子量約16.7KDa)適量，加水制成每1ml分別含1mg的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，即得。

供試品溶液的制備取待測(cè)樣品適量，取約1mg，精密稱定，精密加水1ml，搖勻，過0.45μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

測(cè)定法：精密量取上述對(duì)照品溶液和供試品溶液各5μL，進(jìn)樣，記錄保留時(shí)間；根據(jù)對(duì)照品色譜圖中色譜峰的保留時(shí)間與對(duì)照品的分子量對(duì)數(shù)進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(相關(guān)系數(shù)r在0.99以上)。將供試品色譜圖中的色譜峰保留時(shí)間利用校正曲線進(jìn)行計(jì)算，測(cè)定供試品的分子量。

三、方法學(xué)驗(yàn)證

3.1校正曲線

按照擬定的方法進(jìn)樣測(cè)定，記錄各對(duì)照物質(zhì)的出峰時(shí)間(詳見表1)，以各對(duì)照物質(zhì)的對(duì)數(shù)與出峰時(shí)間進(jìn)行線性回歸，得到校正曲線(見圖1)。曲線方程為T＝-1.4929lgM+11.9768，r＝0.999。

表1各對(duì)照品分子量及出峰時(shí)間(1.0ml/min)

將流速由1.0ml/min調(diào)整到0.8ml/min，結(jié)果見表2、圖2。曲線方程為T＝-1.8690lgM+15.0281，r＝0.999。

表2各對(duì)照品分子量及出峰時(shí)間(0.8ml/min)

以上在兩個(gè)不同的流速下，對(duì)照物質(zhì)的出峰時(shí)間有所改變，但所得到的校正曲線的相關(guān)系數(shù)r均大于0.999，說明該方法對(duì)所測(cè)蛋白類成分的分子量與保留時(shí)間有較好的相關(guān)性。

3.2精密度試驗(yàn)

取對(duì)照物質(zhì)的混合溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，比較出峰時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，考察儀器的重復(fù)性，詳見表3。由表3可知：三種對(duì)照物質(zhì)的出峰時(shí)間RSD(％)均小于0.06，說明保留時(shí)間的重復(fù)性較強(qiáng)。

表3精密度試驗(yàn)結(jié)果

四、樣品測(cè)定

將制備得到的酚酞抗原和他達(dá)拉非抗原分別取1mg，加水1ml，溶解后進(jìn)樣測(cè)定，色譜圖見圖3～7，其中，圖3是免疫球蛋白對(duì)照品的色譜圖；圖4是BSA對(duì)照品的色譜圖；圖5是肌球蛋白對(duì)照品的色譜圖；圖6是酚酞抗原樣品的色譜圖；圖7是他達(dá)拉非抗原樣品的色譜圖。

五、分子量計(jì)算

由圖6圖可知，酚酞抗原的保留時(shí)間分別為6.011min，將以上保留時(shí)間分別代入公式計(jì)算，酚酞抗原的分子量約分別為66766。在結(jié)合酚酞分子量(318)，可以估算與BSA的結(jié)合比例。經(jīng)估算酚酞：BSA的比值為1:1。

由圖7可知，他達(dá)拉非抗原的保留時(shí)間分別為5.995min，將以上保留時(shí)間分別代入公式計(jì)算，他達(dá)拉非的抗原的分子量約分別為68095。在結(jié)合他達(dá)拉非的分子量(389)，可以估算與BSA的結(jié)合比例。經(jīng)估算他達(dá)拉非：BSA的比值為4:1。