本發(fā)明涉及熒光傳感器制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及熒光生物傳感器，其制備方法及其用途。

背景技術(shù)：

在過去的幾十年，生物分子模板的熒光無機金屬納米顆粒具有獲得了大量的關(guān)注，在這些生物大分子中，DNA因其獨特的納米結(jié)構(gòu)，優(yōu)良的可編程特性，包括雜環(huán)氮原子的豐富功能基團，氨基組和磷酸基團，它可以與特定的金屬離子結(jié)合，并提供金屬納米粒子的成核位點，成為了最佳的候選者。在過去的十年中，DNA為模板不同的熒光金屬納米顆粒已經(jīng)得到了深入的關(guān)注，如金納米粒子和銀納米粒子。最近幾年，一種新的熒光納米材料–DNA模板的銅納米粒子類(DNA-Cu NPs)作為熒光光探針，因其具有良好的生物相容性、成本低，易于制備，毒性低，優(yōu)異的熒光性能等優(yōu)點，已經(jīng)逐漸的應(yīng)用在構(gòu)建熒光生物傳感上。

聚胸腺嘧啶單鏈(poly T)為模板的制備發(fā)熒光的Cu NPs最早由王課題組最早發(fā)現(xiàn)。隨后利用poly T為模板的作為發(fā)熒光的Cu NPs探針，運用在生物傳感器上檢測各種不同的生物物質(zhì)不斷被報道。與此同時增強Cu NPs的熒光效率成為關(guān)注的課題。盡管不久前，盧的小組設(shè)計了一種由多聚T環(huán)和一個隨機的雙鏈序列DNA序列為莖新型發(fā)夾DNA結(jié)構(gòu)，作為Cu NPs形成的模板，以此來提高其熒光效率。但是我們?nèi)匀徊恢朗裁礌顟B(tài)下的聚T構(gòu)象可以直接影響Cu NPs的熒光信號。因此，基于聚T單鏈DNA模板，設(shè)計可控和高效的熒光Cu NPs仍然是一個挑戰(zhàn)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對以上現(xiàn)有技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供一種基于poly T為基礎(chǔ)的新型的“糖果”(CS)構(gòu)型的DNA結(jié)構(gòu)，可以增強Cu NPs的熒光效率，并運用此構(gòu)造設(shè)計了一種無標記的熒光恢復(fù)的生物傳感器用于檢測特殊序列的DNA片段(目標DNA)。根據(jù)不同濃度的目標DNA，構(gòu)建線性關(guān)系，實現(xiàn)了對目標DNA基因靈敏性、特異性的檢測。具體技術(shù)方案如下：

熒光生物傳感器的制備方法，包括如下步驟：

(1)DNA用緩沖溶液稀釋到并儲存；

(2)發(fā)夾DNA包括HP1,HP2,HP3和HP4使用前加熱，冷卻到室溫，使之形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)；

(3)發(fā)夾HP1和目標DNA在緩沖溶液中混合，然后在反應(yīng)的溶液中加入exo III，溶液中的DNA位點被exo III切割完成后，使exo III失活；

(4)釋放出DNAzyme，釋放的DNAzyme與HP3和HP2雜交，加入Zn²⁺溶液，Zn²⁺切割發(fā)夾DNA上的rA位點。

進一步包括如下步驟：

(5)S1和S2被釋放與HP4雜交；

(6)點亮Cu NPs。

進一步地，步驟(1)中，所有的DNA全部用10mMMOPS(3-(N-嗎啉基)丙磺酸)PH＝7.6的緩沖溶液，稀釋到100μM，儲存在4℃中至少24小時后可用。

進一步地，步驟(2)中，HP1,HP2,HP3和HP4使用前加熱到90℃，10分鐘，避免聚集，然后保持恒定搖速2h，讓其慢慢冷卻到室溫，使之形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

進一步地，步驟(3)中，包括如下步驟：

(3-1)在切割酶(exo III)輔助的目標放大體系中：1μM的發(fā)夾HP1和目標DNA在緩沖溶液中，室溫下混合30分鐘；

(3-2)在反應(yīng)的溶液中加入12U exo III，加熱到37℃，35分鐘；

(3-3)溶液中的DNA位點被exo III切割完成；

(3-4)將反應(yīng)溶液加熱到85℃，時間為15分鐘，使exo III失活。

進一步地，步驟(4)中，釋放出DNAzyme(1)，釋放的DNAzyme會與HP3和HP2雜交，加入1nM的Zn²⁺溶液，Zn²⁺切割發(fā)夾DNA上的rA位點，時間40分鐘。

進一步地，步驟(5)中，S1和S2將被釋放與HP4雜交，形成雙通“糖果”結(jié)構(gòu)形成；和/或，步驟(6)中，加入16μL，100mM的抗化學酸鈉和8μL，10mΜ的硫酸銅，點亮Cu NPs，終體積是260μL。

進一步地，步驟(1)之前還包括如下步驟：CS DNA Cu NPs和poly T Cu NPs的制備：

a.1DNA和2DNA用10mM MOPS緩沖溶液相互混合在離心管A里，各自的終濃度分別是500Nm；

b.將混合溶液放在室溫下，20分鐘；

c.DNA用10mM MOPS緩沖溶液稀釋在離心管B里，終濃度分別是1μM；

d.在離心管A和B中均加入16μL100mM的抗壞血酸和8μL 10mΜ的CuSO4，終體積均為260μL。

熒光生物傳感器，采用上述制備方法制備得到。

上述熒光生物傳感器的用途，作為熒光探針用于檢測目標DNA。

與目前現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種新型的“糖果”(CS)造型的DNA結(jié)構(gòu)，相較于傳統(tǒng)的聚胸腺嘧啶單鏈(poly T)為模板的制備發(fā)熒光的銅納米粒子(Cu NPs)，該方法增強了Cu NPs的熒光信號?；诖耸聦崳覀冊O(shè)計了一種新型的無標記的熒光恢復(fù)的生物傳感器，該傳感器利用了雙循環(huán)自動放大手段，能夠特異性的檢測一段特殊序列的DNA。

提供基于聚胸腺嘧啶單鏈(poly T)DNA為基礎(chǔ)的“糖果”(CS)DNA結(jié)構(gòu)，相較于傳統(tǒng)的poly T為模板的制備Cu NPs，CS DNA制備的Cu NPs的熒光信號明顯增強。可應(yīng)用于目標DNA的檢測。本發(fā)明公開了一種熒光生物傳感器的制備方法及其應(yīng)用，基于CS DNA結(jié)構(gòu)，我們設(shè)計了一種新型的無標記的熒光恢復(fù)的生物傳感器，該傳感器利用了外切酶(exo III)和金屬離子切割的雙循環(huán)自動放大手段，特異性的檢測特殊序列的DNA。該傳感器具有很好的靈敏度，而且具有高的選擇性，價格低廉和操作簡單的特點。

附圖說明

圖1A為實施例1制備CS DNA的Cu NPs與攜帶poly T為模板的Cu NPs的熒光對比示意圖；

圖1B為基于CS DNA可以增強Cu NPs的熒光的現(xiàn)象設(shè)計的檢測目標DNA的生物傳感器；

圖2A為CS DNA Cu NPs和poly T Cu NPs的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜圖；

圖2B1為CS DNA Cu NPs和poly T Cu NPs的高分辨透射電鏡；

圖2B2為各自的粒子大小分部統(tǒng)計數(shù)；

圖2C為CS DNA Cu NPs和poly T Cu NPs的紫外吸收光譜圖；

圖2D為CS DNA Cu NPs和poly T Cu NPs的圓二色譜圖；

圖2E為CS DNA Cu NPs和poly T Cu NPs的的凝膠電泳；

圖3A為對CS DNA Cu NPs頭尾DNA互補的堿基配對數(shù)對熒光強度的影響的研究；

圖3B對CS DNA Cu NPs和poly T Cu NPs在不同PH的緩沖溶液中熒光強度的研究；

圖3C對CS DNA Cu NPs和poly T Cu NPs在不同溫度培養(yǎng)下的熒光強度的研究；

圖4A為基于CS DNA Cu NPs設(shè)計的傳感器的可行性圖；

圖4B為該傳感器對目標DNA的檢測的線性原圖；

圖4C為該傳感器對目標DNA的檢測的線性方程圖；

圖5為熒光強度圖。

具體實施方式

下面根據(jù)附圖對本發(fā)明進行詳細描述，其為本發(fā)明多種實施方式中的一種優(yōu)選實施例。

在一個優(yōu)選實施例中，熒光生物傳感器的制備方法，包括以下步驟：

(1)、將1DNA溶液和2DNA溶液雜交形成CS DNA與3DNA(攜帶poly T)，分別加入硫酸銅和抗化學酸以此點亮Cu NPs，將兩者的熒光強度進行對比；

(2)、將步驟(1)制備的CS DNA用于熒光生物傳感器的設(shè)計中：發(fā)夾DNA(HP1)的尾端可以和目標DNA堿基互補配對，加入剪切酶exoIII可以特異性剪切互補配對的發(fā)夾DNA，從而釋放目標DNA和DNA模擬酶1，釋放的目標DNA可以不斷進行循環(huán)作用。在發(fā)夾DNA(HP2和HP3)的加入下，模擬酶的自由莖端可以和HP2和HP3配對形成結(jié)構(gòu)2，Zn2+的加入可以對存在HP2和HP3上的rA堿基進行切割，從而釋放出S2和S3。此體系引入發(fā)夾HP4DNA后，S2和S3的存在可以打開發(fā)夾HP4DNA，從而形成雙通的“糖果”DNA結(jié)構(gòu)，最終加入硫酸銅和抗化學酸可以點亮Cu NPs。Cu NPs作為熒光探針，可制備無標記的熒光生物傳感器用于檢測目標DNA。

步驟(1)中CS DNA Cu NPs和poly T Cu NPs的制備：首先，1DNA和2DNA用10mM MOPS緩沖溶液相互混合在離心管A里，各自的終濃度分別是500nM，將混合溶液放在室溫下，20分鐘。3DNA用10mM MOPS緩沖溶液稀釋在離心管B里，終濃度分別是1μM。然后在離心管A和B中均加入16μL100mM的抗壞血酸和8μL 10mΜ的CuSO4，終體積均為260μL。

步驟(2)具體為：(1)所有的DNA全部用10mM MOPS(3-(N-嗎啉基)丙磺酸)PH＝7.6的緩沖溶液，稀釋到100μM，儲存在4℃中至少24小時后可用。實驗過程中所用的稀釋液都為MOPS緩沖溶液。(2)HP1,HP2,HP3和HP4使用前加熱到90℃，10分鐘，避免聚集。然后保持恒定搖速2h，讓其慢慢冷卻到室溫，使之形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。(3)在切割酶(exo III)輔助的目標放大體系中：1μM的發(fā)夾HP1和目標DNA在緩沖溶液中，室溫下混合30分鐘。然后在反應(yīng)的溶液中加入12U exo III，加熱到37℃，35分鐘。溶液中的DNA位點被exo III切割完成后，將反應(yīng)溶液加熱到85℃，時間為15分鐘，使exo III失活。(4)以上的步驟完成后，釋放出DNAzyme(1)，釋放的DNAzyme會與HP3和HP2雜交，加入1nM的Zn2+溶液，Zn2+切割發(fā)夾DNA上的rA位點，時間40分鐘。(5)以上的步驟完成后，S1和S2將被釋放與HP4雜交，形成雙通“糖果”結(jié)構(gòu)形成。(6)最后，加入16μL，100mM的抗化學酸鈉和8μL，10mΜ的硫酸銅，點亮Cu NPs，終體積是260μL。

檢測目標DNA的應(yīng)用，應(yīng)用方法具體為：發(fā)現(xiàn)一種改進傳統(tǒng)的poly T為模板的新型CS DNA為模板制備Cu NPs,并利用該信號為熒光探針制備的熒光生物傳感器，不同濃度的目標DNA的加入致使熒光信號強度不同，構(gòu)建線性關(guān)系，實現(xiàn)了對熒光生物傳感器靈敏性、特異性的檢測。

在另一個優(yōu)選實施例中，可以采用如下方案：熒光生物傳感器的制備方法，包括以下步驟：所有的DNA全部用10mMMOPS(3-(N-嗎啉基)丙磺酸)PH＝7.6的緩沖溶液，稀釋到100μM，儲存在4℃中至少24小時后可用。實驗過程中所用的稀釋液都為MOPS緩沖溶液。HP1,HP2,HP3和HP4使用前加熱到90℃，10分鐘，避免聚集。然后保持恒定搖速2h，讓其慢慢冷卻到室溫，使之形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在切割酶(exo III)輔助的目標放大體系中：1μM的發(fā)夾HP1和目標DNA在緩沖溶液中，室溫下混合30分鐘。然后在反應(yīng)的溶液中加入12U exo III，加熱到37℃，35分鐘。溶液中的DNA位點被exo III切割完成后，將反應(yīng)溶液加熱到85℃，時間為15分鐘，使exo III失活。以上的步驟完成后，釋放出DNAzyme(1)，釋放的DNAzyme會與HP3和HP2雜交，加入1nM的Zn²⁺溶液，Zn²⁺切割發(fā)夾DNA上的rA位點，時間40分鐘。以上的步驟完成后，S1和S2將被釋放與HP4雜交，形成雙通“糖果”結(jié)構(gòu)形成。最后，加入16μL，100mM的抗化學酸鈉和8μL，10mΜ的硫酸銅，點亮Cu NPs，終體積是260μL。

上面結(jié)合附圖對本發(fā)明進行了示例性描述，顯然本發(fā)明具體實現(xiàn)并不受上述方式的限制，只要采用了本發(fā)明的方法構(gòu)思和技術(shù)方案進行的各種改進，或未經(jīng)改進直接應(yīng)用于其它場合的，均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。