本發(fā)明涉及微電極生物傳感技術(shù)，具體地說，涉及一種活體在線檢測植物生長素的微電極生物傳感器。
背景技術(shù)：
：作為植物體內(nèi)的一種小分子有機物，生長素(IAA)主要參與植物的生長及發(fā)育過程。生長素對植物胚芽鞘尖端、幼嫩的芽、葉等的誘導(dǎo)通常具有正負兩重性，主要取決于其濃度和植物的生理狀況。通常情況下，過多的生長素會促進植物體內(nèi)乙烯的產(chǎn)生，打亂植物內(nèi)部的生理平衡，從而抑制植物的生長。另一方面，植物果實的發(fā)育離不開生長素。種子在發(fā)育過程中，產(chǎn)生的生長素能夠改變其營養(yǎng)物質(zhì)的分配，使子房發(fā)育為果實。目前，常用的生長素檢測方法主要有酶免疫(ELISA)檢測法、放射免疫分析(RIA)法、高效液相色譜(HPLC)法、氣相色譜(GC)法等。除此之外，近年來，光譜法、電化學(xué)法等也被應(yīng)用于生長素的檢測。但目前的檢測方法都是破壞植物樣本的離體檢測，僅能反應(yīng)某一時間點的靜態(tài)濃度或累積效應(yīng)。傳統(tǒng)檢測方法需對樣品取樣進行分離提純等預(yù)處理，不僅操作繁瑣、耗時成本高，對樣本的破壞性較大，而且只能離體取樣檢測，無法體現(xiàn)樣本內(nèi)IAA含量的實時動態(tài)變化。植物體內(nèi)的生長素的含量極少且生長素周圍共存基體成分非常復(fù)雜，其含量易受光照條件、水分以及溫度等外界條件的影響，因此，隨著研究的深入，研究者更希望獲得植物適應(yīng)外界環(huán)境時生長素的實時動態(tài)變化。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種活體在線檢測植物生長素的微電極生物傳感器及其應(yīng)用。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：第一方面，本發(fā)明提供了一種活體在線檢測植物生長素的微電極生物傳感器，所述微電極生物傳感器中工作電極的制備方法包括如下步驟：S1、將金工作電極或鉑工作電極浸入HAuCl4溶液中，在工作電極上經(jīng)電化學(xué)沉積得到AuNPs修飾的工作電極；S2、在S1所得的工作電極上滴涂巰基十一酸(MUA)，使MUA通過Au–S鍵組裝到S1所得的工作電極上；S3、在S2所得的工作電極上滴涂含有N羥基琥珀酸亞胺(NHS)和1-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)的混合溶液，激活MUA的羧基；S4、在S3所得的工作電極上滴涂AuNPs-抗IAA復(fù)合物，得到IAA抗體修飾的工作電極；S5、在S4所得的工作電極上滴涂K3Fe(CN)6媒介體。為了更好地實現(xiàn)工作電極對IAA檢測的靈敏度和特異性，本發(fā)明對工作電極的修飾條件進行進一步的優(yōu)化，具體如下：S1、將金工作電極或鉑工作電極浸入含0.5～1MKNO3的2-5mMHAuCl4溶液中，在工作電極上-0.4V電化學(xué)沉積200s得到AuNPs修飾的工作電極；S2、在S1所得的工作電極上滴涂1～5mM巰基十一酸(MUA)，孵育1～2h后用水沖去多余未反應(yīng)的MUA，使MUA通過Au–S鍵組裝到S1所得的工作電極上；S3、在S2所得的工作電極上滴涂含有50mMN羥基琥珀酸亞胺和1-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(200mM)的混合溶液，孵育1-2h后，激活MUA的羧基；所述N羥基琥珀酸亞胺和1-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的混合溶液中N羥基琥珀酸亞胺與1-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的摩爾濃度比為1:1～1:4；S4、在S3所得的工作電極上滴涂AuNPs-抗IAA復(fù)合物，孵育1～4h得到IAA抗體修飾的工作電極；S5、在S4所得的工作電極上滴涂5～10mMK3Fe(CN)6媒介體。作為優(yōu)選，所述工作電極最佳的制備方法包括：S1、將金工作電極或鉑工作電極浸入含1MKNO3的3mMHAuCl4溶液中，在工作電極上-0.4V電化學(xué)沉積200s得到AuNPs修飾的工作電極；S2、在S1所得的工作電極上滴涂2mM巰基十一酸(MUA)，孵育1h后用水沖去多余未反應(yīng)的MUA，使MUA通過Au–S鍵組裝到S1所得的工作電極上；S3、在S2所得的工作電極上滴涂含有N羥基琥珀酸亞胺和1-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的混合溶液，孵育1-2h后，激活MUA的羧基；所述混合溶液中，N羥基琥珀酸亞胺的濃度為50mM，1-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的濃度為200mM；S4、在S3所得的工作電極上滴涂AuNPs-抗IAA復(fù)合物，孵育1h得到IAA抗體修飾的工作電極；S5、在S4所得的工作電極上滴涂5mMK3Fe(CN)6媒介體。本發(fā)明首先在金工作電極上沉積了金納米粒子，研究發(fā)現(xiàn)，電極上沉積金納米粒子后，可以顯著增加電極的表面積，從而大大提高檢測的靈敏度。其次，本發(fā)明對HAuCl4溶液的濃度進行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)HAuCl4濃度在2～5mM時效果較好，其中3mM的效果最好。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明對電化學(xué)沉積的條件進行了優(yōu)化，在-0.4V電化學(xué)沉積200s能夠使AuNPs沉積的更加均勻，從而提高檢測的靈敏度。而后，本發(fā)明在金納米粒子修飾的工作電極上滴涂了巰基十一酸(MUA)以提供羧基，并對其濃度進行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)1-5mM的MUA效果較好，濃度太低不足以覆蓋電極表面，太高則影響電極的導(dǎo)電性，進而降低檢測性能，其中2mM的效果最好。進一步在電極上滴涂NHS和EDC的混合溶液，以激活羧基。NHS和EDC的濃度比為1：1-1:4，其中1:4效果最好。然后將AuNPs-抗IAA復(fù)合物滴涂到工作電極上，孵育1-4h得到IAA抗體修飾的工作電極。利用IAA的抗體實現(xiàn)對IAA的特異性檢測，而AuNPs-抗IAA復(fù)合物則可進一步增強檢測信號，從而提高檢測的靈敏度。進一步地，S4中所述AuNPs-抗IAA復(fù)合物的制備方法為：通過檸檬酸鈉還原法制備金納米粒子，將金納米粒子溶液的pH調(diào)節(jié)至7.6，在400μL金納米粒子溶液中加入100μL抗IAA的抗體(1mg/ml)，震蕩5min后，于4℃孵育12h；然后將混合物在4℃、12000rpm離心30min，以除去未連接的抗體；之后將沉淀分散于1ml含1％BSA、pH7.4的PBS緩沖液中，形成AuNPs-抗IAA復(fù)合物。進一步地，所述微電極生物傳感器還包括Ag/AgCl參比電極和鉑對電極。進一步地，為了使所述微電極生物傳感器適用于植物活體的在線檢測，避免離體檢測對樣品的破壞和取樣過程中樣品的變化和損失，本發(fā)明采用針式微電極，微電極通過涂膜、蝕刻技術(shù)等微機電加工(MEMS)技術(shù)制作，在硅片基質(zhì)上制備上述工作電極、Ag/AgCl參比電極和鉑對電極，其外觀具有穿透植物組織的能力，長度約為30～50mm。第二方面，本發(fā)明提供了所述微電極生物傳感器在活體在線檢測植物生長素方面的應(yīng)用。所述植物包括林木、花卉、蔬菜、農(nóng)作物等，所述植物組織為植物的莖、葉、果實。進一步地，本發(fā)明提供一種活體在線檢測植物生長素的方法，所述方法包括：1)將所述微電極生物傳感器連接至電化學(xué)工作站，與IAA的標準溶液反應(yīng)，通過電化學(xué)循環(huán)伏安法確定反應(yīng)電壓為0.2V；然后將微電極與不同濃度的IAA的標準溶液反應(yīng)，在0.2V工作電壓下通過計時電流法進行連續(xù)檢測，將峰電流值與IAA的濃度值作圖，制備標準曲線；2)將微電極生物傳感器插入待測植物組織，連接電化學(xué)工作站，在0.2V工作電壓下，通過計時電流法檢測被測部位的電流I，通過與步驟1)所述的標準曲線的方程對比，計算得到待測組織的實時IAA濃度。在本發(fā)明的一個具體實施方式中，選擇黃豆幼苗的莖稈為材料，活體檢測IAA含量。將微電極生物傳感器插入黃豆幼苗的莖稈部位進行活體檢測，并與電化學(xué)工作站相連獲取由IAA與電極反應(yīng)引起的電流變化，利用該電流的變化計算出活體樣本汁液中IAA的含量。本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明通過在工作電極上修飾IAA的抗體實現(xiàn)對IAA的特異性識別，通過在電極上沉積金納米粒子及修飾IAA-金納米粒子復(fù)合物實現(xiàn)IAA的高靈敏檢測。本發(fā)明提供了一種基于微型生物傳感技術(shù)的植物體內(nèi)生長素的活體在線連續(xù)檢測方法，從而更準確、實時地了解植物體內(nèi)生長素的動態(tài)變化規(guī)律及作用機制。本發(fā)明通過對活體植物體內(nèi)IAA的在線檢測，原位實時的掌握植物體內(nèi)生長素的動態(tài)變化信息，了解IAA的代謝過程，為了解IAA參與植物生命體系的調(diào)控機理提供理論依據(jù)。應(yīng)用微型生物傳感器實現(xiàn)對植物活體內(nèi)IAA的在線檢測，對被檢測樣本不造成本質(zhì)傷害；得到的數(shù)據(jù)結(jié)果可實時動態(tài)的反映植物體內(nèi)IAA的含量變化，實際應(yīng)用操作簡便，易于掌握。附圖說明圖1為本發(fā)明所述工作電極的制備與檢測的簡易示意圖。圖2為本發(fā)明所述微電極生物傳感器檢測植物組織的示意圖。具體實施方式下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進行詳細說明。需要理解的是以下實施例的給出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對本發(fā)明的范圍進行限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對本發(fā)明進行各種修改和替換。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1工作電極的制備1)金納米粒子通過檸檬酸鈉還原法制備。將金納米粒子溶液的pH值調(diào)節(jié)至pH7.6，在400μL金納米粒子溶液中加入100抗IAA的抗體(1mg/ml)，震蕩5min后，于4℃孵育12h。然后將混合物在4℃、12000rpm離心30min，以除去未連接的抗體。之后將沉淀分散于1ml含1％BSA、pH7.4的PBS緩沖液中，形成AuNPs-抗IAA復(fù)合物。2)微電極清潔處理后，浸入含1MKNO3的3mMHAuCl4溶液中，在金工作電極上-0.4V電化學(xué)沉積200s得到AuNPs修飾的微電極。在修飾后的工作電極上滴涂2mM巰基十一酸(MUA)，孵育1h后用水沖去多余未反應(yīng)的MUA，使MUA通過Au–S鍵組裝到修飾后的金電極上。3)在工作電極上滴涂50mMN羥基琥珀酸亞胺(NHS)和200mM1-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)的混合溶液，孵育1h后，激活MUA上的羧基后將AuNPs-抗IAA復(fù)合物滴加至修飾的金電極表面，孵育1h得到IAA抗體修飾的微電極，進一步在工作電極上滴涂5mMK3Fe(CN)6媒介體。實施例2微電極生物傳感器的應(yīng)用1)將制備好的微電極連接至電化學(xué)工作站，與IAA的標準溶液反應(yīng)，通過電化學(xué)循環(huán)伏安法確定反應(yīng)電壓為0.2V。微電極與不同濃度的IAA的標準溶液反應(yīng)，在0.2V工作電壓下通過計時電流法進行連續(xù)檢測。將峰電流值與IAA的濃度值作圖，制備標準曲線。2)選用培養(yǎng)至第7天黃豆幼苗做實驗材料，將微電極插入豆苗的嫩莖連接至電化學(xué)工作站，在線連續(xù)測定4天內(nèi)IAA的濃度變化。3)分別取培養(yǎng)至第7、8、9、10天的黃豆幼苗嫩莖，用傳統(tǒng)的液相色譜-質(zhì)譜連用方法對選取的樣本進行IAA的檢測。將液相色譜-質(zhì)譜連用(HPLC-MS)得到的結(jié)果與同一時期微電極在線檢測的結(jié)果進行對比。每組實驗重復(fù)三次計算其平均值，得到結(jié)果如表1：表1不同時期黃豆幼苗莖部IAA含量檢測結(jié)果樣本微電極(ng·g-1FW)HPLC-MS(ng·g-1FW)7thD16.2(±0.24)15.7(±0.33)8thD18.6(±0.17)18.3(±0.42)9thD19.3(±0.12)19.5(±0.39)10thD20.0(±0.04)19.8(±0.24)由上表看出，利用微電極在線檢測黃豆幼苗莖部IAA含量與傳統(tǒng)HPLC-MS方法測量結(jié)果數(shù)據(jù)基本吻合。該方法數(shù)據(jù)可靠、選擇性高，可實現(xiàn)對IAA高度靈敏、專一的識別，適用于植物的莖、葉、果實等不同組織部位，可實現(xiàn)植物體內(nèi)IAA的活體在線連續(xù)檢測，有助于了解IAA參與植物生命活動的調(diào)控規(guī)律及作用機制。實施例31)金工作電極清潔處理后，浸入含0.5MKNO3的1mMHAuCl4溶液中，在金工作電極上-0.4V電化學(xué)沉積200s得到AuNPs修飾的微電極。在其上滴涂巰基十一酸(MUA)，孵育1h后用水沖去多余未反應(yīng)的MUA，使MUA通過Au-S鍵組裝到修飾后的金電極上。2)在工作電極上滴涂50mMN羥基琥珀酸亞胺(NHS)和200mM1-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)的混合溶液，孵育1h后，將AuNPs-抗IAA復(fù)合物滴加至修飾的金電極表面，孵育1h得到IAA抗體修飾的微電極，進一步在工作電極上滴涂5mMK3Fe(CN)6媒介體。3)將該修飾的微電極連接至電化學(xué)工作站，然后將微電極與不同濃度的IAA的標準溶液反應(yīng)，在工作電壓下通過計時電流法進行連續(xù)檢測，將峰電流值與IAA的濃度值作圖，所制備的標準曲線與最優(yōu)條件下制備的含有電沉積金納米粒子步驟的工作電極相比，斜率稍偏小，表明傳感器的靈敏度降低。4)將微電極生物傳感器插入待測植物組織，連接電化學(xué)工作站，在工作電壓下，通過計時電流法檢測被測部位的電流I，通過與步驟3)所述的標準曲線的方程對比，計算得到待測組織的即時IAA濃度。其檢測值全部偏小，并與HPLC-MS法檢測到的數(shù)值偏差較大。實施例41)微電極清潔處理后，浸入含1MKNO3的3mMHAuCl4溶液中，在金工作電極上-0.4V電化學(xué)沉積200s得到AuNPs修飾的微電極。在修飾后的工作電極上滴涂2mM巰基十一酸(MUA)，孵育1h后用水沖去多余未反應(yīng)的MUA，使MUA通過Au–S鍵組裝到修飾后的金電極上。2)在工作電極上滴涂50mMN羥基琥珀酸亞胺(NHS)和500mM1-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)的混合溶液(將NHS和EDC的摩爾濃度比調(diào)整為1:10)，孵育1h后，激活MUA上的羧基后將AuNPs-抗IAA復(fù)合物滴加至修飾的金電極表面，孵育1h得到IAA抗體修飾的微電極，進一步在工作電極上滴涂5mMK3Fe(CN)6媒介體。3)將該修飾的微電極連接至電化學(xué)工作站，與IAA的標準溶液反應(yīng)，通過電化學(xué)循環(huán)伏安法確定反應(yīng)電壓。然后將微電極與不同濃度的IAA的標準溶液反應(yīng)，在工作電壓下通過計時電流法進行連續(xù)檢測，將峰電流值與IAA的濃度值作圖，所制備的標準曲線與本發(fā)明中制備的NHS和EDC的摩爾濃度比在1:1-1:4范圍內(nèi)的工作電極相比，斜率較小，表明傳感器的靈敏度較低。4)將微電極生物傳感器插入待測植物組織，連接電化學(xué)工作站，在工作電壓下，通過計時電流法檢測被測部位的電流I，通過與步驟3)所述的標準曲線的方程對比，計算得到待測組織的即時IAA濃度。其檢測值全部偏小，并與HPLC-MS法檢測到的數(shù)值偏差較大。對比例11)金工作電極清潔處理后，在其上滴涂巰基十一酸(MUA)，(不進行電沉積金納米粒子)，孵育1h后用水沖去多余未反應(yīng)的MUA，使MUA通過Au–S鍵組裝到修飾后的金電極上。2)在工作電極上滴涂50mMN羥基琥珀酸亞胺(NHS)和200mM1-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)的混合溶液，孵育1h后，將AuNPs-抗IAA復(fù)合物滴加至修飾的金電極表面，孵育1h得到IAA抗體修飾的微電極，進一步在工作電極上滴涂5mMK3Fe(CN)6媒介體。3)將該修飾的微電極連接至電化學(xué)工作站，與IAA的標準溶液反應(yīng)，通過電化學(xué)循環(huán)伏安法確定反應(yīng)電壓。然后將微電極與不同濃度的IAA的標準溶液反應(yīng)，在工作電壓下通過計時電流法進行連續(xù)檢測，將峰電流值與IAA的濃度值作圖，所制備的標準曲線與我們制備的含有電沉積金納米粒子步驟的工作電極相比，斜率較小，表明傳感器的靈敏度較低。4)將微電極生物傳感器插入待測植物組織，連接電化學(xué)工作站，在工作電壓下，通過計時電流法檢測被測部位的電流I，通過與步驟3)所述的標準曲線的方程對比，計算得到待測組織的即時IAA濃度。其檢測值全部偏小，并與HPLC-MS法檢測到的數(shù)值偏差較大。對比例21)金工作電極清潔處理后，在其上滴涂巰基十一酸(MUA)，(不進行電沉積金納米粒子)，孵育1h后用水沖去多余未反應(yīng)的MUA，使MUA通過Au–S鍵組裝到修飾后的金電極上。2)在工作電極上滴涂50mMN羥基琥珀酸亞胺(NHS)和200mM1-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)的混合溶液，孵育1h后，將IAA抗體滴加至修飾的金電極表面(不滴涂金納米粒子-抗IAA復(fù)合物)，孵育1h得到IAA抗體修飾的微電極，進一步在工作電極上滴涂5mMK3Fe(CN)6媒介體。3)將該修飾的微電極連接至電化學(xué)工作站，與IAA的標準溶液反應(yīng)，通過電化學(xué)循環(huán)伏安法確定反應(yīng)電壓。然后將微電極與不同濃度的IAA的標準溶液反應(yīng)，在工作電壓下通過計時電流法進行連續(xù)檢測，將峰電流值與IAA的濃度值作圖，所制備的標準曲線與我們制備的含有電沉積金納米粒子步驟的工作電極相比，斜率較小，表明傳感器的靈敏度較低。4)將微電極生物傳感器插入待測植物組織，連接電化學(xué)工作站，在工作電壓下，通過計時電流法檢測被測部位的電流I，通過與步驟3)所述的標準曲線的方程對比，計算得到待測組織的即時IAA濃度。結(jié)果只能檢測培養(yǎng)至第10天的黃豆幼苗的IAA，其它幾天的IAA含量檢測不到，數(shù)值偏小，并與HPLC-MS法檢測到的數(shù)值偏差較大。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。當前第1頁1 2 3