本發(fā)明屬于食品及生物體系檢測技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種檢測食品及生物體系中谷胱甘肽的方法，具體涉及一種基于卟啉化合物開關(guān)型熒光檢測谷胱甘肽的方法。

背景技術(shù)：

隨著社會(huì)和經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，人類的生活變得豐富多彩，各種各樣舌尖上的美味食品應(yīng)運(yùn)而生，給我們的生活帶來了無限的樂趣。但凡事都有兩面性，隨著人類科技的發(fā)展，各種各樣的問題出現(xiàn)了，如食品質(zhì)量、能源危機(jī)和環(huán)境惡化以及人類最關(guān)心的健康問題等一系列問題已變?yōu)槿蚬餐P(guān)注的問題。

谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的，是大多數(shù)哺乳動(dòng)物組織中主要的非蛋白質(zhì)的低分子量的巰基化合物，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗氧化和細(xì)胞增殖等諸多生命過程中扮演著重要的角色。作為機(jī)體內(nèi)重要的生物活性巰基物質(zhì)，谷胱甘肽（GSH）對于維持生物體內(nèi)合適的氧化還原環(huán)境起著至關(guān)重要的作用。臨床上，GSH 可以迅速提高機(jī)體免疫力；在食品加工領(lǐng)域，GSH具有增強(qiáng)食品營養(yǎng)價(jià)值和強(qiáng)化食品風(fēng)味等功能。據(jù)醫(yī)學(xué)相關(guān)部門報(bào)到，GSH的含量與人類疾病息息相關(guān)，例如癌癥、肝臟損傷、艾滋病、衰老和糖尿病等。因此找到一種方便、高效的GSH檢測方法對于我們的生活來說意義重大。因此，尋求高效、環(huán)保、低成本的分析檢測GSH的方法已被成為研究者所追求的目標(biāo)。近年來研究者相繼報(bào)道了各種各樣的定量檢測谷胱甘肽的方法，如熒光光譜測定法、高效液相色譜法、電化學(xué)測試方法和紫外分光光度法等。與其它方法相比，具有操作簡單、成本低廉、無破壞性和靈敏度較高等特點(diǎn)的熒光分析法受到青睞。

卟啉是一種天然大分子化合物，具有16個(gè)原子18電子的共軛平面結(jié)構(gòu)，因此它具有優(yōu)越的光、電等理化特性。其中位和β位可以被不同的取代基取代而形成不同的卟啉化合物，因而它不僅在光電材料、分子識(shí)別、自組裝、熒光分析、藥物合成、天然產(chǎn)物模擬、電化學(xué)催化以及醫(yī)學(xué)顯影劑等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，而且存在于動(dòng)植物體中、 在生物氧化過程中起著氧的傳遞、儲(chǔ)存、活化及電子傳輸作用。

目前，很多分析檢測谷胱甘肽的方法在材料制備、分析檢測成本、設(shè)備需求以及檢測靈敏度方面都有不同程度的缺點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種成本低廉的基于卟啉化合物開關(guān)型熒光檢測谷胱甘肽的方法，降低檢測難度。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種基于卟啉化合物開關(guān)型熒光檢測谷胱甘肽的方法，具體按以下步驟進(jìn)行：

1）將250mL丙酸油浴加熱至微沸后，加入10mL苯甲醛，得原料液；

將7mL吡咯減壓蒸餾后，溶于30mL丙酸中，得滴加液；

2）將滴加液緩慢滴入原料液，邊滴加邊回流，滴加完畢后，繼續(xù)回流1h后停止加熱，冷卻至室溫，靜置；抽濾，用無水乙醇及二次水各洗滌2～3次，烘干，得紫色固體；拌樣，用柱層析法純化，洗脫劑為二氯甲烷和石油醚的混合物；旋蒸、烘干得四苯基卟啉；

3）用3～5mL氯仿溶解200mg四苯基卟啉，慢慢加入10mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥70%的H₂SO₄溶液，磁力攪拌下加熱到95℃，之后恒溫回流4h，得澄清液，冷卻至室溫，將該澄清液滴入200mL摩爾體積濃度為1mol/L的NaHCO₃溶液中，滴加的同時(shí)進(jìn)行攪拌，得到溶液，冰水浴冷卻后過濾，蒸干濾過液，用150mL甲醇溶解，過濾并收集濾液；重復(fù)上述操作2～3次，合并濾液，加入100mL異丙醇進(jìn)行重結(jié)晶，過濾，真空干燥得卟啉化合物；

4）將0.0001g卟啉化合物溶于25mL超純水中，配制成物質(zhì)的量濃度為1×10^-4mol/L的卟啉溶液；

5）移取500uL 步驟4中所配制的卟啉溶液于2mL，加入1mL摩爾體積濃度0.5mol/L的PBS緩沖溶液，加入38uL濃度為2.24mM的Hg²⁺溶液，靜置5min，制得TPPS₄-Hg²⁺熒光探針；

6）取1mL步驟5中得到的TPPS₄-Hg²⁺熒光探針，先加入0.5uL的谷胱甘肽儲(chǔ)備液，檢測熒光探針熒光強(qiáng)度的變化，然后再加入0.5uL谷胱甘肽儲(chǔ)備液，檢測熒光探針熒光強(qiáng)度的變化，重復(fù)此過程直到熒光探針的熒光強(qiáng)度不再變化為止，通過熒光光譜儀檢測熒光發(fā)射光譜。

本發(fā)明檢測方法采用熒光性能較好的卟啉化合物，不僅在制備方法上比較簡單，成本比較低廉，在一定程度上大大降低了檢測的難度，而且卟啉化合物本身是一種天然的有機(jī)色素分子，當(dāng)其遇到目標(biāo)檢測物谷胱甘肽時(shí)會(huì)發(fā)生瞬間的顏色變化，檢測限比較低，可以達(dá)到肉眼檢測的效果，這是現(xiàn)有的很多熒光檢測谷胱甘肽的分析方法所不必備的特點(diǎn)。本檢測方法還增加了理論計(jì)算的手段，結(jié)合實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象做出合理的解釋。即結(jié)合密度泛函理論（DFT）計(jì)算的方法，從分子結(jié)構(gòu)的變化的角度解釋熒光性質(zhì)的變化的根源。

附圖說明

圖 1 是本發(fā)明檢測方法中制備的最終化合物的紅外光譜圖。

圖2是本發(fā)明檢測方法中制備的卟啉化合物的紫外可見吸收光譜圖以及熒光發(fā)射光譜圖。

圖3是本發(fā)明檢測方法中制備的TPPS₄-Hg²⁺熒光探針的熒光關(guān)閉過程的熒光發(fā)射光譜圖。

圖4是用本發(fā)明檢測方法中制備的TPPS₄-Hg²⁺熒光探針檢測GSH的過程示意圖。

圖 5 是本發(fā)明檢測方法中基于密度泛函理論（DFT）計(jì)算實(shí)驗(yàn)所采用的卟啉化合物的最優(yōu)結(jié)構(gòu)（即能量最小的分子構(gòu)型）圖。

圖6是本發(fā)明檢測方法中基于密度泛函理論（DFT）計(jì)算實(shí)驗(yàn)所采用的卟啉化合物的前線分子軌道電子云密度分布圖。

具體實(shí)施方式

以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

本發(fā)明提供了一種檢測食品及生物體系中谷胱甘肽的方法，具體按以下步驟進(jìn)行：

1）在500mL三頸圓底燒瓶中加入250mL丙酸，油浴加熱至微沸，然后加入10mL苯甲醛，得原料液；

將7mL吡咯在90℃的溫度下減壓蒸餾（放置時(shí)間長會(huì)有聚合物生成），然后溶于30mL丙酸中，得滴加液；

2）將滴加液緩慢滴入原料液，邊滴加邊回流，待滴加完畢后，繼續(xù)回流1h后停止加熱，冷卻至室溫，置于溫度為4℃的環(huán)境中靜置12h；抽濾，用無水乙醇及二次水各洗滌2～3次，烘干，得紫色固體；拌樣，用柱層析法純化，洗脫劑為二氯甲烷和石油醚的混合物，洗脫劑體積比為：二氯甲烷︰石油醚=3︰1；旋蒸、烘干得四苯基卟啉（TPP）4g，產(chǎn)率為58%（產(chǎn)物的質(zhì)量與加入的反應(yīng)物的質(zhì)量之比）；

3）在100mL圓底燒瓶中，加入200mg四苯基卟啉，用3～5mL氯仿溶解，慢慢加入10mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥70%的H₂SO₄溶液，磁力攪拌下加熱到95℃，之后恒溫回流4h，得綠色澄清溶液，冷卻至室溫后，將該澄清液以10滴/min的滴速滴入200mL摩爾體積濃度為1mol/L的NaHCO₃溶液中，滴加的同時(shí)進(jìn)行攪拌混合，得到紫色溶液，冰水浴冷卻后過濾，除去Na₂SO₄晶體，蒸干濾過液，得固體產(chǎn)物，用150mL甲醇溶解該固體產(chǎn)物，過濾并收集濾液；重復(fù)上述操作2～3次，合并濾液，加入100mL異丙醇進(jìn)行重結(jié)晶，過濾得紫色固體，60℃真空干燥得最終化合物80mg，產(chǎn)率約40%；

上述步驟3）中真空干燥后得到的最終化合物的紅外光譜圖，見圖1，從圖1可看出在966 cm^-1處出現(xiàn)的吸收峰為卟啉環(huán)的 N-H彎曲振動(dòng)吸收峰，都是中強(qiáng)吸收帶，這是卟啉環(huán)的特征振動(dòng)。1483cm^-1為苯環(huán)及卟啉環(huán)骨架C=C雙鍵振動(dòng)吸收峰，1517cm^-1為苯環(huán)伸縮振動(dòng)吸收峰，1607cm^-1卟啉環(huán)的 N-C伸縮振動(dòng)吸收，1729cm^-1 C=C 伸縮振動(dòng)吸收峰，2580cm^-1-2940cm^-1C-H伸縮振動(dòng)吸收峰，1190 cm^-1左右處出現(xiàn)磺酸基的特征吸收峰，說明該最終化合物為卟啉化合物（TPPS₄）。圖2是該卟啉化合物的紫外可見吸收光譜圖（圖2中的曲線部分）和熒光發(fā)射光譜圖（圖2中的右邊部分），從吸收光譜圖可看出制得的卟啉化合物在波長410nm左右有一個(gè)很強(qiáng)的特征吸收峰，在波長500～650nm之間有四個(gè)較弱的Q吸收峰；從熒光發(fā)射光譜圖可以很明顯的看出，當(dāng)在515nm的激發(fā)波長下，TPPS₄在波長650nm和波長705nm處有很強(qiáng)的發(fā)射峰，根據(jù)圖2可知，TPPS₄具有很好的光學(xué)性質(zhì)。

4）將0.0001g卟啉化合物溶于25mL超純水中，配制成物質(zhì)的量濃度為1×10^-4mol/L的卟啉溶液（顏色為紫色）；

5）熒光探針的制備：準(zhǔn)確移取500uL 步驟4中所配制的卟啉溶液于2mL樣品管中，加入1mL（摩爾體積濃度0.5mol/L）的PBS緩沖溶液（pH=7），加入38uL（2.24mM）的Hg²⁺溶液，靜置5min，制得TPPS₄-Hg²⁺熒光探針；

制得的TPPS₄-Hg²⁺熒光探針的熒光關(guān)閉過程的熒光發(fā)射光譜圖，見圖3，從圖中可看出隨著Hg²⁺濃度的增大，TPPS₄溶液的熒光強(qiáng)度不斷降低，說明了TPPS₄和Hg²⁺之間發(fā)生作用，而使TPPS₄溶液的熒光強(qiáng)度降低。

6）熒光檢測谷胱甘肽：移取1mL步驟5中得到的TPPS₄-Hg²⁺熒光探針置于石英比色皿中，先加入0.5uL的谷胱甘肽儲(chǔ)備液，檢測熒光探針熒光強(qiáng)度的變化，然后再加入0.5uL谷胱甘肽儲(chǔ)備液，檢測熒光探針熒光強(qiáng)度的變化，這樣重復(fù)此過程直到熒光探針的熒光強(qiáng)度不再變化為止，通過熒光光譜儀檢測熒光發(fā)射光譜，激發(fā)波長為515nm，狹縫寬度為5nm×5nm；

用步驟5得到的熒光探針檢測谷胱甘肽時(shí)的熒光發(fā)射光譜圖，如圖4所示，從圖中可看出隨著谷胱甘肽的濃度不斷增加，TPPS₄-Hg²⁺熒光探針的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。說明GSH可以和Hg²⁺發(fā)生反應(yīng)，而使TPPS₄的熒光恢復(fù)。

7）采用TD-DFT/B3LYP/6-31G(d)及LANL2DZ基組計(jì)算TPPS₄與Hg²⁺發(fā)生發(fā)應(yīng)之后生成產(chǎn)物的激發(fā)態(tài)的一些性質(zhì)，采用DFT理論計(jì)算可以幫助我們解釋實(shí)驗(yàn)中所看到的現(xiàn)象，即當(dāng)向TPPS₄中加入Hg²⁺溶液時(shí)，為什么TPPS₄的熒光強(qiáng)度會(huì)降低；計(jì)算時(shí)采用Gaussian09 軟件包（Gaussian 09, Revision A.02, Gaussian, Inc）。

基于密度泛函（DFT）理論研究從根本上解釋了為什么將Hg²⁺溶液加入到TPPS₄溶液當(dāng)中，TPPS₄的熒光會(huì)降低。

本發(fā)明檢測方法中制得的TPPS₄溶液中加入Hg²⁺可以發(fā)生很明顯的顏色變化，并且在熒光發(fā)射光譜中可以看到熒光強(qiáng)度的降低，即熒光分子處于熒光關(guān)閉的狀態(tài)。然而，當(dāng)有GSH存在時(shí)，該熒光探針TPPS₄-Hg²⁺中的Hg²⁺會(huì)被谷胱甘肽特異性結(jié)合，進(jìn)而使TPPS₄溶液的熒光強(qiáng)度增加，即熒光恢復(fù)的過程發(fā)生。基于此過程，本發(fā)明建立了一種開關(guān)型熒光傳感器（首先加入含Hg²⁺的溶液使TPPS₄的熒光淬滅，即關(guān)閉過程；然后加入GSH又會(huì)使TPPS₄的熒光恢復(fù)，即打開過程；因此稱為開關(guān)型的熒光傳感器）用于GSH的檢測。

圖5為密度泛函理論（DFT）計(jì)算得到的TPPS₄和TPPS₄-Hg（TPPS₄與Hg²⁺相互作用的產(chǎn)物）的最優(yōu)結(jié)構(gòu)（找到能量最小的結(jié)構(gòu)）圖6為密度泛函理論（DFT）計(jì)算得到的TPPS₄和TPPS₄-Hg（TPPS₄與Hg²⁺相互作用的產(chǎn)物）的前線分子軌道電子云密度分布圖（HOMO指最高電子占有軌道，LUMO指最低空軌道）。從圖可知，TPPS₄的前線分子軌道能級(jí)差為2.778eV， 而TPPS₄-Hg的前線分子軌道能極差為2.701eV。說明TPPS₄-Hg中處于HOMO軌道的電子更容易躍遷。即其電子躍遷吸收的能量較少，進(jìn)而電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)所釋放出的能量就少，熒光強(qiáng)度降低。

最后應(yīng)說明的是 ：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。