本發(fā)明涉及體外診斷免疫檢測領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明提供了一種化學(xué)發(fā)光免疫檢測醛固酮試劑盒及其制備方法。

背景技術(shù)：

醛固酮(aldosterone，ALD) 是腎上腺皮質(zhì)激素的一種，具有代表性的強(qiáng)電解質(zhì)代謝作用的鹽皮質(zhì)類固醇。其作用是保鈉排鉀( 增加Na+和Cl -的回放，排出K +和H +)、維持電解質(zhì)平衡與體液容量恒定。ALD 是由腎上腺皮質(zhì)球狀帶生成，并受腎臟分泌的血管緊張肽原酶，即血管緊張素的調(diào)節(jié)。

目前臨床檢測醛固酮的常見方法有酶聯(lián)免疫吸附法、放射免疫分析法、酶促化學(xué)發(fā)光法，但這些方法都存在著一些不足之處。

一、酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA) 被廣泛應(yīng)用，但該方法也存在著下述的不足之處：

(1) 使用12×8型、6×8型、8×12型或整板型96 孔專用微孔板作為抗原包被用具和反應(yīng)容器，在使用時(shí)只能分成12 批次、6 批次、8 批次或整板一次使用，無法進(jìn)行獨(dú)立的、單人份的檢測；

(2) 定量測定所用的試劑種類較多，每一種檢測試劑都要用試劑瓶來盛裝，并且每使用一種試劑時(shí)都需要更換吸液嘴來分別加注到微孔板的微孔中，不但試劑瓶種類多，加注試劑的操作也極為繁瑣；

(3) 缺少對(duì)檢測信息的相應(yīng)標(biāo)注，只能通過查看試劑盒外包裝盒的標(biāo)識(shí)才能了解或知悉檢測試劑的生產(chǎn)批號(hào)及有效期信息，而且所知悉的信息在檢測過程中不受控，具有很大的隨意性；

(4) 檢測試劑在檢測過程中處于開放的空間，容易引起各種試劑之間的交叉污染而影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性；

(5) 檢測過程多采用手工操作，試劑或樣本的加量不很精確，操作過程極為繁瑣和復(fù)雜，容易發(fā)生操作差錯(cuò)，檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度較差；

(6) 在檢測項(xiàng)目成套試劑的數(shù)量配置及使用上均為項(xiàng)目數(shù)×48/96人份，如果需要檢測10 個(gè)項(xiàng)目，則試劑的配置及使用數(shù)須為10×48/96人份，如果只有一份樣本需要檢測10 個(gè)不同的項(xiàng)目，也需要配置10×48/96人份的試劑，存在著不夠經(jīng)濟(jì)合理的缺點(diǎn)。

二、放射免疫分析法

放射免疫分析方法放射性污染大、加樣步驟繁瑣、操作復(fù)雜、操作時(shí)間長、測定結(jié)果不穩(wěn)定、試劑保存時(shí)間短、試劑盒操作自動(dòng)化程度低、配套儀器價(jià)格昂貴等不足之處。

三、化學(xué)發(fā)光法

化學(xué)發(fā)光法按發(fā)光原理可分為直接化學(xué)發(fā)光和酶促化學(xué)發(fā)光。

酶促化學(xué)發(fā)光主要有辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶兩種，但都有一定的局限性，辣根過氧化物酶主要缺點(diǎn)為：魯米諾在沒有辣根過氧化物酶存在情況下，也會(huì)被H2O2氧化自身發(fā)光，本底相對(duì)較高，影響信噪比，反應(yīng)動(dòng)力學(xué)復(fù)雜，影響因素多，結(jié)果不夠穩(wěn)定，要得到靈敏度高且平臺(tái)期長的底物不容易。堿性磷酸酶主要缺點(diǎn)為：底物達(dá)到平臺(tái)期的時(shí)間長，底物成本高，導(dǎo)致檢測成本高，患者負(fù)擔(dān)重。

吖啶酯作為標(biāo)記物的直接化學(xué)發(fā)光相比酶促化學(xué)發(fā)光具有明細(xì)優(yōu)勢，主要表現(xiàn)在：反應(yīng)不需要催化劑，只要堿性環(huán)境即可進(jìn)行，反應(yīng)迅速，背景發(fā)光低，信噪比高，干擾因素少，試劑穩(wěn)定性好，可以兩點(diǎn)定標(biāo)，體系簡單，激發(fā)液成本低，吖啶酯易與蛋白質(zhì)聯(lián)結(jié)，且聯(lián)結(jié)后光子產(chǎn)率不減少。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

目前醛固酮檢測技術(shù)存在以下缺點(diǎn)：檢測成本高、檢測靈敏度低、檢測線性范圍窄、重現(xiàn)性低、不能定量、操作復(fù)雜等。

本發(fā)明正是為了克服以上所述缺點(diǎn)，公開了一種檢測成本低、靈敏度高、檢測線性范圍廣、重現(xiàn)性高、可以定量、操作簡單的醛固酮試劑盒及其制備方法。本發(fā)明首先制備化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒，主要包括：醛固酮單克隆抗體包被的磁顆粒、吖啶酯標(biāo)記的醛固酮以及醛固酮定標(biāo)品；然后利用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀對(duì)定標(biāo)品進(jìn)行檢測，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，內(nèi)置于電腦軟件，測試實(shí)際樣本，根據(jù)樣本發(fā)光值計(jì)算樣本濃度；最后對(duì)醛固酮全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)進(jìn)行性能（靈敏度、線性、精密度、干擾性）的評(píng)價(jià)。

本發(fā)明與目前技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1、本發(fā)明選擇吖啶酯作為標(biāo)記材料，并應(yīng)用于化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)，該發(fā)光體系為直接化學(xué)發(fā)光，與傳統(tǒng)的酶促化學(xué)發(fā)光相比，該反應(yīng)不需要酶的參與，更加節(jié)約成本；

2、本發(fā)明選用的吖啶酯化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)檢測靈敏度高，能夠達(dá)到1ng/mL，相比其它的醛固酮檢測方法靈敏度至少提高了10倍；

3、本發(fā)明選用的吖啶酯化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)線性范圍寬，能達(dá)到3-500 ng/mL，其它的醛固酮化學(xué)發(fā)檢測方法的檢線性范圍為20-135 ng/mL；

4、本發(fā)明選用的吖啶酯化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)重復(fù)性高，批內(nèi)及批間差均在5%以內(nèi)，這是其它化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)難以達(dá)到的；

5、本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)已實(shí)現(xiàn)樣本的定量，通過內(nèi)置標(biāo)準(zhǔn)曲線到測試軟件，只需測試樣本就可直接得到樣本的濃度值；

6、本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)已實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化，試劑及樣本的添加全有儀器完成，操作更加簡便，減少了人為的誤差。

附圖說明

圖1為實(shí)施例3得到的醛固酮標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：醛固酮化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒制備方法

（1）醛固酮單克隆抗體包被的納米磁珠制備：

取50mg羧基化的磁微粒（粒徑為0.05-1um）懸浮液，磁分離去上清，用0.02 M，pH為5.5 MES緩沖液重懸，加入0.5-2mL新配置的10 mg/mL的EDC水溶液，活化磁珠表面羧基，加入3-5 mg 醛固酮單克隆抗體，室溫下混懸2-10 h，磁分離，去除上清，用含2% BSA 的0.1 M pH為8.0的Tris緩沖液重懸到1mg/mL，得到醛固酮單克隆抗體包被的磁顆粒，每瓶5mL分裝保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

（2）醛固酮衍生物標(biāo)記的吖啶酯的制備：

取50 uL 25mg/mL的醛固酮衍生物，加入150 uL 0.1-0.2 M pH 9.0-9.5的碳酸鹽緩沖液，混勻，然后加入1-2 uL 5 mg/mL的吖啶酯混勻，室溫下避光反應(yīng)，1-2 h后取出，用2 mL的zeba離心脫鹽柱脫鹽處理，脫鹽過程中首先分別用純凈水及TBS緩沖液進(jìn)行處理，最后加入得到的醛固酮衍生物標(biāo)記的吖啶酯溶液，收集離心管中的液體至保存管得到醛固酮衍生物標(biāo)記的吖啶酯，每瓶5 mL分裝保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

（3）醛固酮定標(biāo)品的制備：

用標(biāo)準(zhǔn)品緩沖液（40 mM Tris-HCl，0.5% BSA，1% NaCl，pH 8.0）將醛固酮配置成濃度為0 ng/mL、5 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、150 ng/mL、500 ng/mL，每瓶0.5 mL分裝凍干，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(4)化學(xué)發(fā)光預(yù)激發(fā)液的配制：

量取1.0升純化水，依次加入80uL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的雙氧水(H₂O₂)、1.0克疊氮化鈉、1.5克吐溫20，搖勻后避光存放。

(5)化學(xué)發(fā)光激發(fā)液的配制：

量取1.0升純化水，依次加入0.6克氫氧化鈉、0.5克PC300、0.5g疊氮化鈉、1.5克Triton 405，搖勻后避光存放。

實(shí)施例2：醛固酮化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法：

本發(fā)明以全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀為檢測工具，本發(fā)明的方法學(xué)模式為競爭法，即儀器依次加入20 uL的樣品、50 uL的醛固酮單克隆抗體包被的磁顆粒以及50 uL的醛固酮包被的吖啶酯，反應(yīng)10 min后，進(jìn)行磁分離，儀器將反應(yīng)混合物送入暗室，依次加入50uL化學(xué)發(fā)光預(yù)激發(fā)液、50uL化學(xué)發(fā)光激發(fā)液進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，最后記錄發(fā)光強(qiáng)度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出被測樣品的 醛固酮含量。

實(shí)施例3：醛固酮化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒性能評(píng)價(jià)

檢測曲線見附圖1。

靈敏度的檢測：

參照CLSI EP17-A 文件推薦實(shí)驗(yàn)方案，計(jì)算醛固酮化學(xué)發(fā)光免疫層析試劑盒的靈敏度，求得的靈敏度為1ng/ mL。

線性的檢測：

對(duì)濃度為5 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、150 ng/mL、500 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品做線性分析，計(jì)算線性相關(guān)系數(shù)，r=0.9996，另外，該試劑盒對(duì)醛固酮樣品檢測的線性范圍為3-500 ng/mL。

精密度測定：

取濃度為2 ng/mL及100ng/mL兩個(gè)醛固酮樣品，每個(gè)樣本每個(gè)濃度各做3個(gè)平行，用三批試劑盒進(jìn)行檢測，計(jì)算試劑盒批內(nèi)及批間差，結(jié)果表明該試劑盒批內(nèi)及批間差均小于5%。

干擾性實(shí)驗(yàn)：

取混合血清分別添加干擾物包括： 結(jié)合膽紅素、游離膽紅素、血紅蛋白、抗壞血酸、甘油酯，添加比例按照 1: 20 進(jìn)行，分別測定混合血清及添加了各種干擾物后混合血清的測值，計(jì)算二者之間的偏差，以 ±10%為可接受范圍。結(jié)果表明，干擾性均達(dá)到 NCCLS 的文件標(biāo)準(zhǔn)，可用于臨床實(shí)驗(yàn)室維生素 D 狀況的準(zhǔn)確評(píng)估。

實(shí)施例4:醛固酮化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒的靈敏度對(duì)比實(shí)驗(yàn)

分別用化學(xué)發(fā)光檢測方法和傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)濃度為0ng/mL的校準(zhǔn)品或樣本稀釋液為樣本進(jìn)行檢測，重復(fù)測定20次，得出20次測量結(jié)果的RLU值（相對(duì)發(fā)光值），計(jì)算其平均值（M）和標(biāo)準(zhǔn)差（SD），得出M-2SD，將該發(fā)光值代入校準(zhǔn)曲線計(jì)算得到相應(yīng)的濃度值。采用化學(xué)發(fā)光檢測方法得到的濃度值為1.0ng/ml，相對(duì)于傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附法最低檢測限10.4ng/ml，提高了約10倍。