本發(fā)明涉及一種眼鏡蛇神經(jīng)毒素的毛細(xì)管電泳體內(nèi)檢測(cè)方法，具體來說涉及一種采用高選擇性、高敏感性的毛細(xì)管電泳結(jié)合激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器檢測(cè)眼鏡蛇神經(jīng)毒素的方法。

(二)

背景技術(shù)：

眼鏡蛇神經(jīng)毒素(Neurotoxin，NT)——-種從中華眼鏡蛇(Naja naja atra)毒液中分離得到的水溶性堿性多肽(C.M.Barber.Alpha neurotoxins[J].Toxicon,2013,66:47–58.)，主要通過與中樞中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)(Periaqueductal Gray，PAG)的膽堿能受體結(jié)合，發(fā)揮鎮(zhèn)痛療效，其效價(jià)強(qiáng)度比同等劑量的嗎啡高數(shù)十倍，而且無胃腸道不良反應(yīng)，無耐受性和成癮性，是一種新型的替代性鎮(zhèn)痛藥物，主要用于治療癌痛和各種慢性、頑固性疼痛等，現(xiàn)已有肌內(nèi)注射劑上市，商品名為科博肽注射液。

NT作為一種有毒藥物，為避免發(fā)生呼吸抑制等副作用，劑量需要嚴(yán)格控制，NT具有給藥量小，血藥濃度低和易受內(nèi)源性物質(zhì)干擾等特點(diǎn)，使其體內(nèi)動(dòng)力學(xué)的研究面臨很多挑戰(zhàn)：由于NT給藥量小，體內(nèi)血藥濃度很低，現(xiàn)有技術(shù)難以直接檢測(cè)出血樣中的NT濃度，或者即使檢測(cè)出來，檢測(cè)靈敏度也很低，難以進(jìn)行后續(xù)藥動(dòng)學(xué)研究。因此建立高效敏感的NT體內(nèi)檢測(cè)方法具有重要意義。目前，用于NT等蛋白多肽類藥物體內(nèi)檢測(cè)方法主要有免疫學(xué)分析法、同位素標(biāo)記示蹤法、LC-MS/MS，現(xiàn)有的NT檢測(cè)方法由于安全性、準(zhǔn)確性、前處理繁瑣等問題，一定程度上不能滿足NT體內(nèi)檢測(cè)等的需求，應(yīng)用受到限制(L.Bailly-Chouriberry.Identification ofα-Cobratoxin in Equine Plasma by LC-MS/MS for Doping Control[J].Anal.Chem.,2013,85:5219–5225)。由于毛細(xì)管電泳具有靈敏度高、特異性強(qiáng)和準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)，并且特別適合蛋白多肽類藥物的分析，另外，對(duì)NT進(jìn)行衍生化，采用激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器(LIF)進(jìn)行檢測(cè)，可以極大地提高靈敏度。本實(shí)驗(yàn)旨在建立一種高選擇性、高敏感性的神經(jīng)毒素毛細(xì)管電泳體內(nèi)檢測(cè)方法，并對(duì)其進(jìn)行了考察。

(三)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是克服上述現(xiàn)有方法存在的缺陷，為避免前處理、檢測(cè)靈敏度和實(shí)驗(yàn)人員安全性問題的影響，提供一種高選擇性、高敏感性的神經(jīng)毒素體內(nèi)毛細(xì)管電泳檢測(cè)方法，為神經(jīng)毒素體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究提供準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)支持。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種眼鏡蛇神經(jīng)毒素的毛細(xì)管電泳體內(nèi)分析方法，所述方法包括以下步驟：

(1)取含有FITC-NT的待測(cè)血漿樣品，進(jìn)樣進(jìn)行高效毛細(xì)管電泳，激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器檢測(cè)，獲得待測(cè)樣品的電泳圖譜；所述高效毛細(xì)管電泳的條件為：以CEofix^TM MEKC試劑盒為緩沖液，分離電壓為20kV，溫度為24℃，檢測(cè)波長為激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長520nm；

(2)建立FITC-NT的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，根據(jù)其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程以及步驟(1)所得的待測(cè)樣品的電泳圖譜中FITC-NT的峰面積，計(jì)算出待測(cè)樣品中FITC-NT的濃度。

所述FITC-NT代表熒光單標(biāo)記的眼鏡蛇神經(jīng)毒素，來自浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥制劑實(shí)驗(yàn)室，可根據(jù)專利申請(qǐng)?zhí)?01410566748.8公開的方法制備得到。FITC-NT為NT經(jīng)過熒光單標(biāo)記制得，1分子FITC-NT即對(duì)應(yīng)1分子NT，兩者的摩爾濃度一致，因此，可用FITC-NT代替NT作為目標(biāo)進(jìn)行體內(nèi)檢測(cè)，研究神經(jīng)毒素體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)。

進(jìn)一步，所述步驟(1)中，所述高效毛細(xì)管電泳中采用的毛細(xì)管柱為有效長度為55cm的非涂層毛細(xì)管柱，內(nèi)徑75um。

進(jìn)一步，所述步驟(1)中，所述高效毛細(xì)管電泳采用壓力進(jìn)樣，6.9kPa，10s。

所述步驟(1)中，進(jìn)樣量優(yōu)選20μL。

進(jìn)一步，所述步驟(1)中，所述高效毛細(xì)管電泳開機(jī)后用0.1mol·L^-1氫氧化鈉溶液沖洗5min，CEofix^TM MEKC試劑盒涂層沖洗5min，每次進(jìn)樣前用CEofix^TM MEKC緩沖液沖洗毛細(xì)管柱3min，每針運(yùn)行20min，每針檢測(cè)后用CEofix^TM MEKC試劑盒緩沖液沖洗5min，分析結(jié)束后用0.1mol·L^-1氫氧化鈉溶液和水各沖洗5min。

所述步驟(2)中，所述FITC-NT的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程可按以下方法獲得：取FITC-NT標(biāo)準(zhǔn)貯備液逐級(jí)稀釋，配制一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用SD大鼠空白血漿配制成不同F(xiàn)ITC-NT濃度的血漿標(biāo)準(zhǔn)添加樣品，按照步驟(1)的方法進(jìn)行檢測(cè)，獲得血漿標(biāo)準(zhǔn)添加樣品的電泳圖譜，以FITC-NT濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的電泳圖譜中的峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

本發(fā)明提供的眼鏡蛇神經(jīng)毒素的毛細(xì)管電泳體內(nèi)分析方法可用于進(jìn)行神經(jīng)毒素的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究，由于FITC-NT體內(nèi)檢測(cè)靈敏度高，檢測(cè)限很低，在血漿中可以準(zhǔn)確定量，且摩爾濃度和NT保持一致，因此可代替NT進(jìn)行體內(nèi)藥代學(xué)研究。具體的，可對(duì)大鼠進(jìn)行FITC-NT的尾靜脈和肌肉注射，測(cè)定給藥后大鼠血漿中FITC-NT的濃度，研究FITC-NT的藥代動(dòng)力學(xué)特征。

本發(fā)明還提供一種利用FITC-NT進(jìn)行神經(jīng)毒素的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)檢測(cè)的方法，所述方法包括以下步驟：

(A)對(duì)大鼠進(jìn)行FITC-NT的靜脈和/或肌肉注射，注射后在不同時(shí)間采血，離心出血漿，血漿樣品在-20℃冷凍保存直至測(cè)試；

(B)取給藥后不同時(shí)間的血漿樣品，作為待測(cè)樣品進(jìn)樣進(jìn)行高效毛細(xì)管電泳，激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器檢測(cè)，獲得待測(cè)樣品的電泳圖譜；所述高效毛細(xì)管電泳的條件為：以CEofix^TM MEKC試劑盒為緩沖液，分離電壓為20kV，溫度為24℃，檢測(cè)波長為激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長520nm；

(C)建立FITC-NT的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，根據(jù)其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程以及步驟(B)所得的待測(cè)樣品的電泳圖譜中FITC-NT的峰面積，計(jì)算出待測(cè)樣品中FITC-NT的濃度；

(D)以時(shí)間為橫坐標(biāo)，血漿樣品中的FITC-NT濃度為縱坐標(biāo)，繪制FITC-NT的血藥時(shí)間曲線，獲得體內(nèi)藥代學(xué)參數(shù)。

所述步驟(A)中，注射劑量不得超過半數(shù)致死量。

本發(fā)明以毛細(xì)管電泳結(jié)合激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器(CE-LIF)對(duì)熒光單標(biāo)記的神經(jīng)毒素(FITC-NT)進(jìn)行體內(nèi)分析方法的建立，從標(biāo)準(zhǔn)曲線、準(zhǔn)確度、日內(nèi)精密度、日間精密度、穩(wěn)定性、檢測(cè)限對(duì)所述體內(nèi)分析方法進(jìn)行方法學(xué)的考察，結(jié)果為：FITC-NT在0.010～1.0μg·mL^-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢測(cè)限為0.8nmol·L^-1(S/N＝3)，日內(nèi)精密度RSD≤2.2％，日間精密度RSD≤6.1％，準(zhǔn)確性RR在93.3％–106.1％之間，穩(wěn)定性良好，均符合方法學(xué)的要求。

本發(fā)明提供的熒光單標(biāo)記的神經(jīng)毒素(FITC-NT)的體內(nèi)分析方法，準(zhǔn)確度高，精密度高、穩(wěn)定性好，對(duì)體內(nèi)血樣中的神經(jīng)毒素能夠快速準(zhǔn)確的檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度高，檢測(cè)限很低，能夠準(zhǔn)確定量檢測(cè)血樣中極其微量的FITC-NT成分，可用于神經(jīng)毒素的體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究，為其提供準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)支持。

附圖說明

圖1為FITC-NT血漿樣品專屬性電泳圖，圖1中，(a)曲線為空白血漿樣品，(b)曲線為加入FITC-NT的血漿樣品，(c)曲線為收集大鼠給藥1h之后的血漿樣品。

圖2為FITC-NT血漿樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

圖3為FITC-NT血漿樣品遷移時(shí)間重復(fù)性散點(diǎn)圖。

圖4為大鼠分別靜脈注射和肌肉注射FITC-NT之后的藥時(shí)曲線，圖中虛線曲線代表靜脈注射；實(shí)線曲線代表肌肉注射。圖中右上角小圖為大圖的虛線框中的放大圖。

(四)具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：

實(shí)施例1：各參數(shù)的優(yōu)化

1儀器與試藥

1.1儀器

BECKMAN P/ACE MDQ型高效毛細(xì)管電泳儀(美國Beckman公司)；

未涂層石英毛細(xì)管柱(75μm×50cm，河北永年銳灃色譜器件有限公司)；

Optima Max超速低溫離心機(jī)(美國Beckman公司)；

CP225D型電子分析天平(德國Sartorius公司)。

1.2試劑

熒光單標(biāo)記的眼鏡蛇神經(jīng)毒素(FITC-NT)(純度>99.29％)，浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥制劑實(shí)驗(yàn)室(專利申請(qǐng)?zhí)?0140566748.8)；

CEofix^TM MEKC試劑盒(北京博思雅生化技術(shù)研究院)(US Patent no.5,611,903)；

其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

2方法與結(jié)果

2.1對(duì)照品貯備液的配制

精密稱取FITC-NT對(duì)照品0.50mg，置10.0mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得FITC-NT對(duì)照品儲(chǔ)備液(質(zhì)量濃度為50μg·mL^-1)。2.2樣品預(yù)處理步驟

取靜脈血裝樣本，置于0.5mL離心管(加肝素抗凝)中，以轉(zhuǎn)速3500r/min離心l0min后，分離血漿。保存于-80℃冰箱。血漿樣本置于37℃水浴下解凍后，吸取90ul血漿，加入10ul配制好的FITC-NT溶液(50ug/mL)，禍旋混勻后取 20uL進(jìn)樣分析。

2.3電泳條件

緩沖液：CEofix^TM MEKC試劑盒；分離電壓：20kV；溫度：24℃；檢測(cè)波長：激發(fā)波長：488nm，發(fā)射波長520nm。進(jìn)樣條件：采用壓力進(jìn)樣，6.9kPa，10s。開機(jī)后用0.1mol·L^-1氫氧化鈉溶液沖洗5min，CEofix^TM MEKC試劑盒涂層沖洗5min，每次進(jìn)樣前用CEofix^TM MEKC緩沖液沖洗毛細(xì)管柱3min，每針運(yùn)行20min，進(jìn)樣檢測(cè)完成后用CEofix^TM MEKC試劑盒緩沖液沖洗5min，最后分析結(jié)束后用0.1mol·L^-1氫氧化鈉溶液和水各沖洗5min。

2.4專屬性的考察

圖1為FITC-NT血漿樣品專屬性電泳圖，圖1中，(a)曲線為空白血漿樣品，(b)曲線為加入FITC-NT的血漿樣品，(c)曲線為收集大鼠給藥1h之后的血漿樣品。比較空白血漿和FITC-NT血漿樣品電泳圖，證實(shí)了該體內(nèi)檢測(cè)方法的專屬性，在電泳圖中未檢測(cè)到其他內(nèi)源物質(zhì)或者是代謝物質(zhì)等干擾物質(zhì)。

2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及檢測(cè)限

FITC-NT標(biāo)準(zhǔn)貯備液逐級(jí)稀釋配制一系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，精密量取適量，用SD大鼠空白血裝配制成FITC-NT的血漿標(biāo)準(zhǔn)添加樣品，按前述預(yù)處理方法處理后，進(jìn)行CE-LIF分析,以峰面積(y)對(duì)藥物濃度(x)進(jìn)行線性回歸，圖2為FITC-NT的血漿樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，得FITC-NT標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y＝2481x-0.4254，R²＝0.9981,FITC-NT在0.010～1.0μg·mL^-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢測(cè)限為0.8nmol·L^-1(S/N＝3)。

2.6穩(wěn)定性考察

穩(wěn)定性考察包括短期穩(wěn)定性和長期穩(wěn)定性的考察。其中短期穩(wěn)定性考察包括SD大鼠血裝標(biāo)準(zhǔn)添加樣品室溫放置穩(wěn)定性以及凍融循環(huán)穩(wěn)定性，長期穩(wěn)定性包括在-80℃保存25天的穩(wěn)定性。配制含F(xiàn)ITC-NT低、中、高三種不同濃度的血漿標(biāo)準(zhǔn)添加質(zhì)量控制樣品，每個(gè)濃度各6份，按照不同考察項(xiàng)目的要求操作，儀器分析后，計(jì)算各生物樣品的測(cè)定濃度，測(cè)得穩(wěn)定性符合方法學(xué)的要求。FITC-NT血漿樣品不同儲(chǔ)存條件下穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1FITC-NT血漿樣品不同儲(chǔ)存條件下穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)

2.7精密度和準(zhǔn)確度考察

配制含F(xiàn)ITC-NT低、中、高三種不同濃度的血漿標(biāo)準(zhǔn)添加生物樣品，每個(gè)濃度各6份，按前述樣品預(yù)處理步驟操作，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算各生物樣品的測(cè)定濃度。FITC-NT血漿樣品精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，統(tǒng)計(jì)得日內(nèi)精密度RSD≤2.2％、日間精密度RSD≤6.1％及準(zhǔn)確度RR在93.3％–106.1％之間。遷移時(shí)間和生物樣品的峰面積的重復(fù)性證實(shí)CEofix^TM MEKC涂層的使用優(yōu)化了毛細(xì)管電泳的沖洗過程和電流組成。圖3為FITC-NT血漿樣品遷移時(shí)間重復(fù)性散點(diǎn)圖，可見在不同進(jìn)樣次數(shù)下，檢測(cè)樣品的峰面積數(shù)據(jù)變化不大，表明檢測(cè)不受進(jìn)樣次數(shù)的干擾，精密度和準(zhǔn)確度好。

表2FITC-NT血漿樣品精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)

2.8檢測(cè)方法的藥代動(dòng)力學(xué)應(yīng)用

應(yīng)用上述研究中建立的毛細(xì)管電泳檢測(cè)方法分別對(duì)大鼠進(jìn)行FITC-NT的尾靜脈和肌肉注射，測(cè)定給藥后大鼠血漿中FITC-NT的濃度，研究FITC-NT的藥代動(dòng)力學(xué)特征。

12只SD雄性大鼠(200-250g)隨機(jī)分成兩組,實(shí)驗(yàn)之前至少禁食12h以上,但可以自由飲水。用pH 7.4的PBS緩沖液將FITC-NT溶液稀釋,6只SD大鼠尾靜脈注射注射劑量為0.06mg/kg。其余 6只SD大鼠肌肉注射注射劑量為0.12mg/kg，注射后第5min、10min、20min、30min、1h、2h、3h、6h、12h、24h從大鼠眼眶采血約0.5mL,置于含有少量肝素鈉溶液的離心管中,并立即離心出血漿.血漿樣品在-20℃冷凍保存直至測(cè)試。注射FITC-NT大鼠的血漿樣品,采用毛細(xì)管電泳法測(cè)定血漿樣品中FITC-NT的濃度，并繪制藥時(shí)曲線。圖4為大鼠分別靜脈注射和肌肉注射FITC-NT之后的藥時(shí)曲線，圖中虛線曲線代表靜脈注射；實(shí)線曲線代表肌肉注射。圖中右上角小圖為大圖的虛線框中的放大圖。大鼠進(jìn)行FITC-NT尾靜脈和肌肉注射后的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)如表3所示。

表3大鼠進(jìn)行FITC-NT尾靜脈和肌肉注射后的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(n＝6)