本發(fā)明涉及醫(yī)療器械生物實(shí)驗(yàn)方法的技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種交叉韌帶重建中移植肌腱的測試方法。

背景技術(shù)：

膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶(anterior cruciate ligament，ACL)是膝關(guān)節(jié)重要的靜力和動(dòng)力性穩(wěn)定結(jié)構(gòu)之一，可以防止脛骨前移、過伸和過度旋轉(zhuǎn)，防止膝關(guān)節(jié)失穩(wěn)后的相關(guān)并發(fā)癥。ACL損傷是常見病、多發(fā)病，主要困擾廣大青少年，是青少年人群中最常見的疾病之一。ACL損傷發(fā)病率很高，特別是16歲以上的人群，根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，ACL斷裂的發(fā)病率約為0.035％。近年來，隨著全民運(yùn)動(dòng)的普及以及越來越多的青少年參與體育活動(dòng)，此類疾病的發(fā)病率越來越高而且多集中在普通青壯年人群中。ACL損傷的治療帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，而我國有將近一億ACL損傷和ACL損傷所致骨性關(guān)節(jié)炎患者以及數(shù)百萬受困于ACL損傷的運(yùn)動(dòng)員和青壯年體育愛好者，治療此類疾病耗費(fèi)了十分巨大的人力、財(cái)力、物力。而這種花費(fèi)被不恰當(dāng)?shù)闹委熕糯蟆?/p>

ACL損傷后出現(xiàn)膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)，增加關(guān)節(jié)其他結(jié)構(gòu)損傷機(jī)率、加速半月板及關(guān)節(jié)軟骨的退變，導(dǎo)致嚴(yán)重的慢性疼痛和關(guān)節(jié)功能障礙，嚴(yán)重影響患者的日常活動(dòng)和生活質(zhì)量，給青少年患者帶來了巨大的痛苦和精神負(fù)擔(dān)。ACL重建術(shù)是利用移植肌腱固定于骨道內(nèi)，替代正常前交叉韌帶的功能，是治療ACL損傷最有效的方法。移植物的固定是ACL重建中最重要的環(huán)節(jié)，也是最薄弱的環(huán)節(jié)，國內(nèi)外學(xué)者們做過多種研究。良好的固定在近期可以滿足術(shù)后早期運(yùn)動(dòng)、肌肉鍛煉與負(fù)重的要求，在移植物獲得生物學(xué)愈合前維持膝關(guān)節(jié)穩(wěn)定性，遠(yuǎn)期則有助于促進(jìn)移植物與骨的愈合。移植物固定的優(yōu)劣取決于固定方法的選擇。

固定方法的選擇因移植物的選擇和手術(shù)技術(shù)的選擇的不同而不同。但終極目標(biāo)一直未曾改變，肌腱移植物的固定即要盡量恢復(fù)自體肌腱的力學(xué)特性，還要達(dá)到腱骨的生物愈合。所以ACL的固定需滿足以下條件：首先要有足夠的抗拔出力，其次需恢復(fù)并維持膝關(guān)節(jié)的穩(wěn)定性，最后還要有足夠的力量防止韌帶在關(guān)節(jié)內(nèi)滑動(dòng)。重建后的前交叉韌帶最主要的生物力學(xué)特性是強(qiáng)度和鋼度。強(qiáng)度是指使移植物產(chǎn)生永久性移位的負(fù)荷，鋼度指移植物在一定負(fù)荷下產(chǎn)生的張力或位移大小。

擠壓螺釘固定系統(tǒng)主要是通過螺釘擠壓肌腱與骨隧道產(chǎn)生的摩擦力來固定肌腱。此固定方式使移植物長度縮短，有更大的鋼度，提高了重建后膝關(guān)節(jié)的穩(wěn)定性，然而，較小的界面螺釘不能提供足夠的機(jī)械力量，而直徑較大的螺釘會(huì)切割縫線和移植物造成固定不穩(wěn)，因界面螺釘切割擠壓造成移植肌腱強(qiáng)度下降而出現(xiàn)肌腱斷裂失效。

間接固定是指固定物固定位置位于腱-骨交界之外的方法，但由于移植物與骨隧道之間有一定的空隙，故在膝關(guān)節(jié)屈伸運(yùn)動(dòng)時(shí)，移植物可發(fā)生垂直于隧道軸像雨刷一樣的擺動(dòng)，即“雨刷效應(yīng)”；或移植物在沿骨隧道發(fā)生軸方向的伸縮性移動(dòng)，即“蹦極效應(yīng)”。這兩種運(yùn)動(dòng)會(huì)破壞移植物在骨隧道內(nèi)的生物學(xué)愈合過程，同時(shí)也是引起骨隧道擴(kuò)大最常見的原因之一。

移植肌腱與骨隧道內(nèi)壁的愈合是腱骨界面間纖維組織形成連接、新骨形成、骨向肌腱內(nèi)長入、局部塑形改造的的過程。BMP-2具有使未分化的間充質(zhì)細(xì)胞定向分化為成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞，并誘導(dǎo)形成軟骨和骨組織。由于腱骨界面缺乏血管，如果不添加生長因子，即使很小的損傷也不能得到良好愈合。已有研究報(bào)道在體內(nèi)原位重建損傷ACL并不能達(dá)到良好的效。在ACL重建時(shí)使用金屬擠壓螺釘可以一定程度上提高修復(fù)效果，但由于現(xiàn)階段金屬螺釘植入后存在的各種缺陷，目前仍不能很好的應(yīng)用于臨床。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就在于：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種交叉韌帶重建中移植肌腱的測試方法，通過測試移植肌腱的力學(xué)性能，來確定移植肌腱的固定方式。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出的技術(shù)方案為：

一種交叉韌帶重建中移植肌腱的測試方法，包括以下步驟：

a.ACL生物模型構(gòu)建

(1)橫斷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物ACL，清理殘端，取出實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腘繩肌腱，將腘繩肌腱的兩端編織縫合，修整為兩條移植肌腱；

(2)選擇兩個(gè)膨脹螺釘；

(3)股骨隧道：膝關(guān)節(jié)屈曲120°，選擇右膝10點(diǎn)或左膝2點(diǎn)的方向，采用股骨定位器，距離股骨后髁軟骨壁6mm；在ACL原股骨止點(diǎn)中央處打入帶鼻孔導(dǎo)針，沿導(dǎo)針方向用空心鉆頭制成股骨骨道；

(4)脛骨隧道：屈膝90°，選擇外側(cè)半月板前角水平，后交叉韌帶前方，經(jīng)內(nèi)側(cè)膝眼切口脛骨定位器，套入帶鼻孔導(dǎo)針；沿導(dǎo)針方向使用與步驟(3)相同的空心鉆頭，制成脛骨骨道；

(5)將一條移植肌腱一端固定于步驟(3)的導(dǎo)針上，用于做實(shí)驗(yàn)，另一端進(jìn)入股骨隧道；

(6)用工具沿股骨骨道緊貼移植肌腱推入膨脹套至膨脹套的尾端進(jìn)入股骨骨道，將螺釘擰入膨脹套固定移植肌腱；

(7)將另一條移植肌腱一端固定于步驟(4)的導(dǎo)針上，用于做實(shí)驗(yàn)，另一端進(jìn)入脛骨隧道；

(8)用工具沿脛骨骨道緊貼移植肌腱推入膨脹套至膨脹套的尾端進(jìn)入脛骨骨道，將螺釘擰入膨脹套固定移植肌腱；

b.初始生物力學(xué)測定

1)取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的股骨側(cè)和脛骨側(cè)標(biāo)本，用夾具分別固定在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上；

2)先做多次預(yù)載荷，再改變頻率進(jìn)行多次循環(huán)載荷，應(yīng)力為50-200N，將其中一個(gè)標(biāo)本以5-15mm/min的加速度進(jìn)行拔出試驗(yàn)，觀察并記錄循環(huán)載荷后的位移、抗拉剛度、雙倍應(yīng)力位移、最大拔出載荷、失敗模式以及肌腱切割程度等數(shù)據(jù)；

3)用于步驟2)同樣方法測試另一個(gè)標(biāo)本；

4)上述生物模型的兩個(gè)移植肌腱也分別用夾具固定在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，從相應(yīng)隧道內(nèi)口到夾具之間的距離與人體ALC關(guān)節(jié)內(nèi)長度相同；

5)用于步驟2)同樣方法分別測試；

6)使用生物力學(xué)機(jī)分別對(duì)腱骨界面區(qū)域的骨密度、失效載荷、最大失效載荷、位移數(shù)據(jù)、抗拉剛度等進(jìn)行分析，得出愈合組織的生物力學(xué)特性。

上述方法中，優(yōu)選地，所述膨脹螺釘為可吸收膨脹螺釘，所述可吸收膨脹螺釘由BMP-2通過吸收法與納米羥基磷灰石載體結(jié)合并使用復(fù)乳法復(fù)合聚乙烯左旋丙交酯制備成的緩釋微球結(jié)合制成。

上述方法中，優(yōu)選地，所述力學(xué)測定的步驟6)中，調(diào)整實(shí)驗(yàn)條件，改變應(yīng)力大小和加速度，取得最佳愈合效果，確定可吸收膨脹螺釘?shù)膮?shù)。

上述方法中，優(yōu)選地，所述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為小型豬。

上述方法中，優(yōu)選地，術(shù)后不同時(shí)間分別檢測新生組織在愈合過程中的分化、發(fā)育、成熟過程。

本發(fā)明的交叉韌帶重建中移植肌腱的測試方法，使用BMP-2在體內(nèi)促進(jìn)腱骨愈合，從而具有避免愈合延遲、價(jià)格低廉等優(yōu)勢，臨床應(yīng)用前景高。本發(fā)明的交叉韌帶重建中移植肌腱的測試方法，構(gòu)建BMP-2/納米羥基磷灰石緩釋系統(tǒng)，通過實(shí)驗(yàn)，按時(shí)間梯度反復(fù)驗(yàn)證BMP-2緩釋濃度和持續(xù)時(shí)間，達(dá)到避免反復(fù)給藥、創(chuàng)傷小、操作簡單的目的。本發(fā)明的交叉韌帶重建中移植肌腱的測試方法，測試數(shù)據(jù)詳細(xì)，分析結(jié)果準(zhǔn)確，對(duì)臨床應(yīng)用提供了可行性。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的測試流程圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體實(shí)施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。

為了便于描述，在這里可以使用空間相對(duì)術(shù)語，如“在……之上”、“在……上方”、“在……上表面”、“上面的”等，用來描述如在圖中所示的一個(gè)器件或特征與其他器件或特征的空間位置關(guān)系。應(yīng)當(dāng)理解的是，空間相對(duì)術(shù)語旨在包含除了器件在圖中所描述的方位之外的在使用或操作中的不同方位。例如，如果附圖中的器件被倒置，則描述為“在其他器件或構(gòu)造上方”或“在其他器件或構(gòu)造之上”的器件之后將被定位為“在其他器件或構(gòu)造下方”或“在其他器件或構(gòu)造之下”。因而，示例性術(shù)語“在……上方”可以包括“在……上方”和“在……下方”兩種方位。該器件也可以其他不同方式定位(旋轉(zhuǎn)90度或處于其他方位)，并且對(duì)這里所使用的空間相對(duì)描述作出相應(yīng)解釋。

實(shí)施例1

本發(fā)明的交叉韌帶重建中移植肌腱的測試方法，以小型豬為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，具體包括以下步驟：

a.ACL生物模型構(gòu)建

(1)橫斷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物ACL，清理殘端，取出實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腘繩肌腱，將腘繩肌腱的兩端編織縫合，修整為兩條移植肌腱；

(2)選擇兩個(gè)可吸收膨脹螺釘；

(3)股骨隧道：膝關(guān)節(jié)屈曲120°，選擇右膝10點(diǎn)或左膝2點(diǎn)的方向，采用股骨定位器，距離股骨后髁軟骨壁6mm；在ACL原股骨止點(diǎn)中央處打入帶鼻孔導(dǎo)針，沿導(dǎo)針方向用空心鉆頭制成股骨骨道；

(4)脛骨隧道：屈膝90°，選擇外側(cè)半月板前角水平，后交叉韌帶前方7mm，經(jīng)內(nèi)側(cè)膝眼切口脛骨定位器，套入帶鼻孔導(dǎo)針；沿導(dǎo)針方向使用與步驟(3)相同的空心鉆頭，制成脛骨骨道；

(5)將一條移植肌腱一端固定于步驟(3)的導(dǎo)針上，用于做實(shí)驗(yàn)，另一端進(jìn)入股骨隧道；

(6)用工具沿股骨骨道緊貼移植肌腱推入膨脹套至膨脹套的尾端進(jìn)入股骨骨道，將螺釘擰入膨脹套固定移植肌腱；

(7)將另一條移植肌腱一端固定于步驟(4)的導(dǎo)針上，用于做實(shí)驗(yàn)，另一端進(jìn)入脛骨隧道；

(8)用工具沿脛骨骨道緊貼移植肌腱推入膨脹套至膨脹套的尾端進(jìn)入脛骨骨道，將螺釘擰入膨脹套固定移植肌腱。

b.采用萬能材料疲勞試驗(yàn)機(jī)進(jìn)行初始生物力學(xué)測定

1)取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的股骨側(cè)和脛骨側(cè)標(biāo)本，用夾具分別固定在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上；

2)先做預(yù)載荷10，應(yīng)力為1-100N；再改變頻率進(jìn)行1000次循環(huán)載荷，應(yīng)力為50-200N，將其中一個(gè)標(biāo)本以10mm/min的加速度進(jìn)行拔出試驗(yàn)，觀察并記錄循環(huán)載荷后的位移、抗拉剛度、100N和400N載荷位移、最大拔出載荷、失敗模式以及肌腱切割程度等數(shù)據(jù)；

3)用于步驟2)同樣方法測試另一個(gè)標(biāo)本；

4)上述生物模型的兩個(gè)移植肌腱也分別用夾具固定在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，從相應(yīng)隧道內(nèi)口到夾具之間的距離與人體ALC關(guān)節(jié)內(nèi)長度相同，即32mm；

5)用于步驟2)同樣方法分別測試；

6)使用生物力學(xué)機(jī)分別對(duì)腱骨界面區(qū)域的骨密度、失效載荷、最大失效載荷、位移數(shù)據(jù)、抗拉剛度等進(jìn)行分析，得出愈合組織的生物力學(xué)特性。

上述的可吸收膨脹螺釘由BMP-2通過吸收法與納米羥基磷灰石載體結(jié)合并使用復(fù)乳法復(fù)合聚乙烯左旋丙交酯制備成的緩釋微球結(jié)合制成。

聚乙烯左旋丙交酯(Poly-L-lactide，PLLA)是一種新型的生物降解材料，可以從植物資源(如玉米)的淀粉中制成，在體內(nèi)最終降解成二氧化碳和水，這類材料無毒、無抗原性，具有良好的可降解性、吸收性、力學(xué)強(qiáng)度以及生物安全性，可以通過控制成份含量來調(diào)節(jié)材料的降解速度，使產(chǎn)品性質(zhì)的重復(fù)性和力學(xué)性能達(dá)到較高水平。納米羥基磷灰石(nano-Hydroxyapatite，簡稱nHA)是最常見的一種生物活性材料，它具有與人體骨組織相似的無機(jī)成分，是目前公認(rèn)的具有較好生物相容性和骨傳導(dǎo)性的生物活性材料。納米羥基磷灰石是骨的主要組成部分，因其植入體內(nèi)具有良好的生物相容性，無毒性、無炎癥反應(yīng)性，先已經(jīng)在藥物載體領(lǐng)域被大量研究，有很多研究表明納米羥基磷灰石復(fù)合PLLA微球緩釋系統(tǒng)和大幅度提高藥物及蛋白質(zhì)的包封效果，延長藥物的釋放時(shí)間，據(jù)報(bào)道其中納米羥基磷灰石對(duì)藥物的吸附作用起到了關(guān)鍵的作用。將Nano-HA與PLLA進(jìn)行復(fù)合，一方面能使大幅提高緩釋微球的包封效果、延長藥物的緩釋時(shí)間，盡量減少爆發(fā)性釋放和蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定，極大限度的提高微球蛋白質(zhì)的利用率，避免大量蛋白質(zhì)突釋產(chǎn)生的局部酸性濃度過高的現(xiàn)象，從而避免影響骨組織的生成。一方面能使聚乳酸的酸性降解產(chǎn)物可被HA緩沖，同時(shí)HA的骨傳導(dǎo)性可提供良好的骨細(xì)胞粘附生長環(huán)境，復(fù)合物的多孔結(jié)構(gòu)則為細(xì)胞生長、組織再生及粘附提供條件，符合骨組織工程的生物學(xué)要求。BMP-2是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一種可以作為誘導(dǎo)骨形成的充分條件的蛋白因子，即在只有單獨(dú)BMP-2存在的況下即可誘導(dǎo)軟骨和骨組織的形成，并且在成骨的各個(gè)階段都起著重要作用。另外，BMP-2能明顯誘導(dǎo)從骨髓中分離得到的多潛能干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞分化，合成骨鈣素等蛋白質(zhì)，發(fā)生軟骨內(nèi)成骨，骨細(xì)胞形成，骨鹽沉積形成新骨。但單純的BMP-2在體內(nèi)擴(kuò)散太快，也易被蛋白酸分解，易發(fā)生流失、降解和吸收，因而不能在有效時(shí)間內(nèi)作用于更多的靶細(xì)胞，因此基礎(chǔ)和臨床研究中主要用于與其它載體材料復(fù)合應(yīng)用于組織的修復(fù)。微球(microsphere)是指藥物溶解或者分散在高分子材料的基質(zhì)中形成的微小球狀實(shí)體,屬于基質(zhì)型骨架微粒。因其對(duì)特定器官和組織的靶向性及微粒中藥物釋放的緩釋性,已經(jīng)成為近年來緩控釋劑型研究的熱點(diǎn)。構(gòu)建BMP-2緩釋的可吸收膨脹螺栓固定系統(tǒng)，既具有骨傳導(dǎo)性又具有骨誘導(dǎo)性，同時(shí)可逐漸吸收降解。

將BMP-2通過吸收法與納米羥基磷灰石載體結(jié)合并使用復(fù)乳法復(fù)合PLLA制備成緩釋微球(BMP-2:HA:PLLA＝15mg:15mg:200mg)，通過工藝把緩釋微球相互結(jié)合制成螺栓，PLLA無毒，無組織學(xué)反應(yīng)，在緩慢降解的過程中緩釋BMP-2/納米羥基磷灰石微球，緩釋的BMP-2可以促進(jìn)腱骨交界處間充質(zhì)干細(xì)胞分化，并且可以促進(jìn)新生的軟骨組織向骨組織結(jié)構(gòu)重塑，從而重現(xiàn)原有腱骨界面生物學(xué)功能。

將BMP-2通過吸收法與納米羥基磷灰石載體結(jié)合并復(fù)合PLLA制備成緩釋微粒，然后制作成可吸收膨脹螺栓固定系統(tǒng)，螺栓降解過程中緩慢、持續(xù)、穩(wěn)定釋放BMP-2/羥基磷灰石微粒，在腱骨界面維持一定的BMP-2濃度，以促進(jìn)腱骨愈合，最終形成自然組織。

使用小型豬動(dòng)物模型設(shè)計(jì)不同時(shí)間梯度來研究新生腱骨界面間纖維組織形成連接、新骨形成、骨向肌腱內(nèi)長入、局部塑形改造的過程。分別于術(shù)后2周，4周，6周，8周，12周，6月，12月進(jìn)行HE染色，甲苯胺藍(lán)染色，番紅O染色；進(jìn)行I型膠原蛋白、II型膠原蛋白、X型膠原蛋白、osteocalcin、Lubricin免疫組織化學(xué)染色。以此來觀察腱骨界面新生組織在整個(gè)愈合過程中分化、發(fā)育、成熟的全過程，為BMP-2緩釋可吸收膨脹螺栓固定系統(tǒng)促進(jìn)腱骨愈合提供理論依據(jù)。

在小型豬股骨側(cè)及脛骨側(cè)行移植肌腱重建術(shù)，分別于術(shù)后三月、六月和十二月分析腱骨界面處修復(fù)組織的骨密度及生物力學(xué)特性。使用Micro-CT及Instron E10000生物力學(xué)機(jī)分別對(duì)腱骨界面區(qū)域的骨密度、失效載荷、最大失效載荷、位移數(shù)據(jù)、抗拉剛度等進(jìn)行分析，以檢測愈合組織的生物力學(xué)特性。在測試過程中不斷優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，以調(diào)整愈合效果最佳，確立BMP-2緩釋可吸收膨脹螺栓的參數(shù)。

經(jīng)過測試實(shí)驗(yàn)，通過舒加法測定BMP-2緩釋濃度，BMP-2局部濃度維持在0.01mg/mL左右的范圍內(nèi)波動(dòng)。

上述只是本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制。雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例揭露如上，然而并非用以限定本發(fā)明。因此，凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所做的任何簡單修改、等同變化及修飾，均應(yīng)落在本發(fā)明技術(shù)方案保護(hù)的范圍內(nèi)。