本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種淋巴細(xì)胞染色體g帶的制備方法。

背景技術(shù)：

染色體核型分析是指將待測(cè)細(xì)胞的染色體按照該生物固有的染色體形態(tài)特征和規(guī)定，進(jìn)行染色體數(shù)目、形態(tài)特征的分析，確定其是否與正常細(xì)胞核型完全一致的過(guò)程。染色體核型分析屬于形態(tài)學(xué)范疇，通過(guò)人工分析，找出染色體在宏觀的形態(tài)學(xué)上的異常，比如缺失、增加、倒位或易位，以此為臨床提供診斷依據(jù)。人們將用各種不同的方法，以及用不同的染料處理染色體標(biāo)本后，使每條染色體上出現(xiàn)明暗相間，或深淺不同帶紋的技術(shù)稱(chēng)為顯帶技術(shù)(bandingtechnique)。上世紀(jì)70年代以來(lái)，顯帶技術(shù)得到了很大發(fā)展，根據(jù)不同的制備流程，染色體顯帶方法分為q帶、g帶、r帶、c帶、t帶、n帶，其中較為常用的是g帶，因?yàn)樗饕潜籫iemsa染料染色后而顯帶，故稱(chēng)之為g顯帶技術(shù)，其所顯示的帶紋分布在整個(gè)染色體上，每條染色體都有較為恒定的帶紋特征，所以g顯帶后，可以較為準(zhǔn)確的識(shí)別每條染色體，并可發(fā)現(xiàn)染色體上較細(xì)微的結(jié)構(gòu)畸變。關(guān)于g顯帶的機(jī)理目前有多種說(shuō)法，例如，lee等(1973)認(rèn)為染色體上與dna結(jié)合疏松的組蛋白易被胰蛋白酶分解掉，染色后這些區(qū)段成為淺帶，而那些組蛋白和dna結(jié)合牢固的區(qū)段可被染成深帶。有人認(rèn)為，染色體顯帶現(xiàn)象是染色體本身存在著帶的結(jié)構(gòu)。比如用相差顯微鏡觀察未染色的染色體時(shí)，就能直接到觀察到帶的存在。用特殊方法處理后，再用染料染色，則帶更加清楚，隨顯帶方法不同，顯出來(lái)的帶特點(diǎn)也不一樣，說(shuō)明帶的出現(xiàn)又與染料特異結(jié)合有關(guān)。一般認(rèn)為，易著色的陽(yáng)性帶為含有at多的染色體節(jié)段，相反，含gc多的染色體段則不易著色。

目前染色體核型分析g顯帶制備常用的流程為：取適量外周血，根據(jù)不同的細(xì)胞濃度接種培養(yǎng)，放入溫箱68-74小時(shí)后收獲，先加秋水仙素，1.5小時(shí)后倒入離心管，離心去上清，加低滲液，溫箱低滲至少30分鐘，然后預(yù)固定，再離心再固定，反復(fù)兩次，細(xì)胞沉淀后吸取固定液，留取細(xì)胞懸液進(jìn)行滴片。傳統(tǒng)滴片方法為：將載玻片平放于桌面，手持滴管吸取細(xì)胞懸液，于40厘米高空處向載玻片頭體尾三處各滴一滴，然后載玻片在酒精燈上方過(guò)火，過(guò)火時(shí)盡量使玻載片上的固定液【由甲醇與乙酸(體積比)3：1構(gòu)成】燃燒，但同時(shí)不能使載玻片在火焰上方烘烤過(guò)熱，過(guò)火過(guò)度與不足都會(huì)導(dǎo)致效果不好。載玻片著火干燥后，放在室溫下過(guò)夜，隔天進(jìn)行顯帶。g顯帶液由ph值為5.8-6.0之間的磷酸鹽緩沖液和0.025％的胰蛋白酶構(gòu)成，顯帶液倒入染色缸，在水浴箱內(nèi)升溫至37度，放入載玻片，40-43秒取出，生理鹽水涮洗顯帶液，再進(jìn)行g(shù)ame染色4-6分鐘。傳統(tǒng)方法有四處不足，第一，低滲時(shí)間通常設(shè)定在30分鐘甚至更長(zhǎng)，操作者往往因一個(gè)上午無(wú)法完成滴片前的所有實(shí)驗(yàn)步驟而必須中午加班。第二，高位滴片不好把握，頭體尾三個(gè)位置不可能滴的非常準(zhǔn)確，可能有重疊部分，甚至?xí)蔚狡庠斐衫速M(fèi)，很難標(biāo)準(zhǔn)化。第三，因?yàn)檫^(guò)火導(dǎo)致片子老化程度不固定，過(guò)火的火候無(wú)法掌握，難以標(biāo)準(zhǔn)化。第四，片子放在室溫下過(guò)夜，會(huì)受季節(jié)氣候的影響，造成染色體老化程度不固定，導(dǎo)致分裂像質(zhì)量不穩(wěn)定。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種更省時(shí)、標(biāo)準(zhǔn)化、分散程度高、分裂相的質(zhì)量更好，帶紋更清晰易分析的淋巴細(xì)胞染色體g帶的制備方法，且實(shí)驗(yàn)流程標(biāo)準(zhǔn)化、操作簡(jiǎn)單，效果穩(wěn)定可控。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案如下：一種淋巴細(xì)胞染色體g帶的制備方法，包括如下步驟：

步驟1：接種

1.1.取外周血，接種于3ml含小牛血清的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液中，于37℃恒溫培養(yǎng)68-74h；

1.2.于終止培養(yǎng)前1.5h，加入秋水仙素，得到血液和培養(yǎng)液的混合液；

步驟2：收獲細(xì)胞

2.1.將步驟1.2得到的血液和培養(yǎng)液的混合液，倒入離心管內(nèi)，1500r/min離心10-15min，取出，棄去上清；

2.2.低滲：加入已預(yù)溫至37℃的8ml的0.075mol/lkcl中，混勻，再于37℃恒溫孵育12min；

步驟3：細(xì)胞固定

3.1.加入固定液2ml，混勻，靜置2min，1500r/min離心10-15min；

3.2.取出，棄去上清，加入固定液8ml，混勻，靜置30min，1500r/min離心10-15min；

3.3.取出，棄去上清，加入固定液8ml，混勻，靜置2-3h，1500r/min離心10-15min；

3.4.取出，棄去上清，加入固定液，混勻，制成細(xì)胞懸液；

步驟4：制片

4.1.滴片：將步驟3.4制成的細(xì)胞懸液充分混勻，將細(xì)胞懸液滴于玻片左側(cè)1/3處，隨后將玻片向右下傾斜，待細(xì)胞懸液自然擴(kuò)散直至布滿(mǎn)整張玻片；

4.2.將玻片水平放置，于60-70℃干燥烘烤過(guò)夜或75-80℃烘烤3h，經(jīng)胰酶消化和吉姆薩染色，即得所述淋巴細(xì)胞染色體g帶。

本發(fā)明的方法，實(shí)驗(yàn)流程標(biāo)準(zhǔn)化、操作簡(jiǎn)單，效果穩(wěn)定可控。其中步驟(2)中，細(xì)胞收獲過(guò)程中，采用0.075mol/l的kcl，作用12分鐘實(shí)現(xiàn)了短時(shí)間高效率的低滲處理。低滲處理是利用滲透壓原理使已轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞充分膨脹，細(xì)胞膜破裂而保留完整的核膜，同時(shí)使全血標(biāo)本中的紅細(xì)胞破裂，以達(dá)到獲得更多中期分裂相的目的。此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，越長(zhǎng)的低滲時(shí)間對(duì)最終獲得中期分裂相的數(shù)目并沒(méi)有顯著影響，經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)探索，將低滲時(shí)間定為12分鐘一樣獲得理想的效果。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還可以做如下改進(jìn)。

進(jìn)一步，步驟1.1中，所述外周血為0.3-0.8ml。

進(jìn)一步，步驟4.1中，所述滴片的環(huán)境溫度為25℃，濕度為50-70％；所述細(xì)胞懸液滴于玻片前，與玻片的距離小于2cm；所述玻片為冰水混合物浸泡過(guò)的冰玻片。

采用上述進(jìn)一步的有益效果是：上述方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)中高位滴片造成的細(xì)胞浪費(fèi)、滴片位置不準(zhǔn)、細(xì)胞疊加分散不良等種種弊端，提高了細(xì)胞懸液利用率，更容易操作；適宜的滴片環(huán)境溫濕度以及濕潤(rùn)的冰玻片更有利于細(xì)胞懸液的擴(kuò)散，使細(xì)胞分散更好。其中，冰水混合物浸泡過(guò)的冰玻片指的是，將玻片浸泡在冰和水按體積比1:1混合后的混合物中0.5h以上。

進(jìn)一步，步驟4.2中，所述玻片水平放置的工具為烤片架，所述干燥過(guò)夜的溫度為65℃。

采用上述進(jìn)一步的有益效果是：恒溫烤片大大減小了過(guò)火處理導(dǎo)致片子老化程度的不固定性，減小因更換操作者對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，更容易實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作。

本發(fā)明的有益效果是：

1.本發(fā)明的整個(gè)流程不僅標(biāo)準(zhǔn)化，效果穩(wěn)定可控，在保證分裂相質(zhì)量的前提下，更短的細(xì)胞低滲時(shí)間使制片前的所有實(shí)驗(yàn)步驟可以在一個(gè)上午或下午完成，避免了工作人員加班。

2.本發(fā)明的細(xì)胞懸液低位滴于冰玻片的方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)中高位滴片造成的細(xì)胞浪費(fèi)、滴片位置不準(zhǔn)、細(xì)胞疊加分散不良等種種弊端，提高了細(xì)胞懸液利用率，更容易操作。

3.本發(fā)明用恒溫烤片大大減小了過(guò)火處理導(dǎo)致片子老化程度的不固定性，減小因更換操作者對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，更容易實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作。

4.本發(fā)明的制備方法簡(jiǎn)單，市場(chǎng)前景廣闊，適合規(guī)?；a(chǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)組1-1的淋巴細(xì)胞染色體g帶的鏡下g帶圖譜。

圖2為本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)組1-2的淋巴細(xì)胞染色體g帶的鏡下g帶圖譜。

圖3為本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)組1-3的淋巴細(xì)胞染色體g帶的鏡下g帶圖譜。

圖4為本發(fā)明的對(duì)照組1的淋巴細(xì)胞染色體g帶的鏡下g帶圖譜。

圖5為本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)組2-1的淋巴細(xì)胞染色體g帶的鏡下g帶圖譜。

圖6為本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)組2-2的淋巴細(xì)胞染色體g帶的鏡下g帶圖譜。

圖7為本發(fā)明的對(duì)照組2的淋巴細(xì)胞染色體g帶的鏡下g帶圖譜。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1

本實(shí)施例的淋巴細(xì)胞染色體g帶的制備方法，包括如下步驟：

步驟1：接種

1.1.取0.3ml外周血，接種于3ml含小牛血清的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液中，于37℃恒溫培養(yǎng)68h；

1.2.于終止培養(yǎng)前1.5h，加入秋水仙素，得到血液和培養(yǎng)液的混合液；

步驟2：收獲細(xì)胞

2.1.將步驟1.2得到的血液和培養(yǎng)液的混合液，倒入離心管內(nèi)，1500r/min離心10min，取出，棄去上清；

2.2.低滲：加入已預(yù)溫至37℃的8ml的0.075mol/lkcl中，混勻，再于37℃恒溫孵育12min；

步驟3：細(xì)胞固定

3.1.加入固定液2ml，混勻，靜置2min，1500r/min離心10min；

3.2.取出，棄去上清，加入固定液8ml，混勻，靜置30min，1500r/min離心10min；

3.3.取出，棄去上清，加入固定液8ml，混勻，靜置2-3h，1500r/min離心10min；

3.4.取出，棄去上清，加入固定液，混勻，制成細(xì)胞懸液；

步驟4：制片

4.1.滴片：環(huán)境溫度為25℃，濕度為50％，將步驟3.4制成的細(xì)胞懸液充分混勻，距離玻片的距離小于2cm，將細(xì)胞懸液滴于玻片左側(cè)1/3處，隨后將玻片向右下傾斜，待細(xì)胞懸液自然擴(kuò)散直至布滿(mǎn)整張玻片；

4.2.將玻片水平放置于烤片架上，于60℃干燥烘烤過(guò)夜或75℃烘烤3h，經(jīng)胰酶消化和吉姆薩染色，即得所述淋巴細(xì)胞染色體g帶。

實(shí)施例2

本實(shí)施例的淋巴細(xì)胞染色體g帶的制備方法，包括如下步驟：

步驟1：接種

1.1.取0.5ml外周血，接種于3ml含小牛血清的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液中，于37℃恒溫培養(yǎng)71h；

1.2.于終止培養(yǎng)前1.5h，加入秋水仙素，得到血液和培養(yǎng)液的混合液；

步驟2：收獲細(xì)胞

2.1.將步驟1.2得到的血液和培養(yǎng)液的混合液，倒入離心管內(nèi)，1500r/min離心12min，取出，棄去上清；

2.2.低滲：加入已預(yù)溫至37℃的8ml的0.075mol/lkcl中，混勻，再于37℃恒溫孵育12min；

步驟3：細(xì)胞固定

3.1.加入固定液2ml，混勻，靜置2min，1500r/min離心12min；

3.2.取出，棄去上清，加入固定液8ml，混勻，靜置30min，1500r/min離心12min；

3.3.取出，棄去上清，加入固定液8ml，混勻，靜置2-3h，1500r/min離心12min；

3.4.取出，棄去上清，加入固定液，混勻，制成細(xì)胞懸液；

步驟4：制片

4.1.滴片：環(huán)境溫度為25℃，濕度為60％，將步驟3.4制成的細(xì)胞懸液充分混勻，距離玻片的距離小于2cm，將細(xì)胞懸液滴于冰玻片左側(cè)1/3處，隨后將冰玻片向右下傾斜，待細(xì)胞懸液自然擴(kuò)散直至布滿(mǎn)整張冰玻片；

4.2.將冰玻片水平放置于烤片架上，于65℃干燥烘烤過(guò)夜或78℃烘烤3h，經(jīng)胰酶消化和吉姆薩染色，即得所述淋巴細(xì)胞染色體g帶。

實(shí)施例3

本實(shí)施例的淋巴細(xì)胞染色體g帶的制備方法，包括如下步驟：

步驟1：接種

1.1.取0.8ml外周血，接種于3ml含小牛血清的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液中，于37℃恒溫培養(yǎng)74h；

1.2.于終止培養(yǎng)前1.5h，加入秋水仙素，得到血液和培養(yǎng)液的混合液；

步驟2：收獲細(xì)胞

2.1.將步驟1.2得到的血液和培養(yǎng)液的混合液，倒入離心管內(nèi)，1500r/min離心15min，取出，棄去上清；

2.2.低滲：加入已預(yù)溫至37℃的8ml的0.075mol/lkcl中，混勻，再于37℃恒溫孵育12min；

步驟3：細(xì)胞固定

3.1.加入固定液2ml，混勻，靜置2min，1500r/min離心15min；

3.2.取出，棄去上清，加入固定液8ml，混勻，靜置30min，1500r/min離心15min；

3.3.取出，棄去上清，加入固定液8ml，混勻，靜置2-3h，1500r/min離心15min；

3.4.取出，棄去上清，加入固定液，混勻，制成細(xì)胞懸液；

步驟4：制片

4.1.滴片：環(huán)境溫度為25℃，濕度為70％，將步驟3.4制成的細(xì)胞懸液充分混勻，距離玻片的距離小于2cm，將細(xì)胞懸液滴于玻片左側(cè)1/3處，隨后將玻片向右下傾斜，待細(xì)胞懸液自然擴(kuò)散直至布滿(mǎn)整張玻片；

4.2.將玻片水平放置于烤片架上，于70℃干燥烘烤過(guò)夜或80℃烘烤3h，經(jīng)胰酶消化和吉姆薩染色，即得所述淋巴細(xì)胞染色體g帶。

實(shí)驗(yàn)例1

取同一樣本經(jīng)培養(yǎng)后的淋巴細(xì)胞進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，采用常規(guī)方法設(shè)立實(shí)驗(yàn)組1-1、實(shí)驗(yàn)組1-2、實(shí)驗(yàn)組1-3和對(duì)照組1，實(shí)驗(yàn)組分別采用同一濃度、同一吹打方法下不同的低滲時(shí)間，其中：

實(shí)驗(yàn)組1-1：低滲時(shí)間8分鐘；

實(shí)驗(yàn)組1-2：低滲時(shí)間20分鐘；

實(shí)驗(yàn)組1-3：低滲時(shí)間30分鐘；

對(duì)照組1：低滲時(shí)間12分鐘。

在鏡下觀察制片結(jié)果，使用的顯微鏡為zeissimager.z2，如圖1-4所示，低滲時(shí)間12分鐘時(shí)(對(duì)照組1，圖4)細(xì)胞已充分膨脹，細(xì)胞膜破裂而保留了完整的染色體，縮短了制片時(shí)間且制片效果較好。

實(shí)驗(yàn)例2

取同一樣本經(jīng)培養(yǎng)后的淋巴細(xì)胞進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，采用常規(guī)方法設(shè)立實(shí)驗(yàn)組2-1、實(shí)驗(yàn)組2-2和對(duì)照組2，實(shí)驗(yàn)組分別采用同一濃度不同的滴片方法，其中：

實(shí)驗(yàn)組2-1：滴管口距離玻片40cm，玻片頭、體尾部各一滴，待細(xì)胞懸液在載玻片上自然擴(kuò)散，玻片快速經(jīng)過(guò)酒精燈外焰至表面液體干燥；

實(shí)驗(yàn)組2-2：滴管口距離玻片20cm，玻片頭、體尾部各一滴，待細(xì)胞懸液在載玻片上自然擴(kuò)散，玻片快速經(jīng)過(guò)酒精燈外焰至表面液體干燥；

對(duì)照組2：滴管口距玻片約1cm，將細(xì)胞懸液滴于冰玻片左側(cè)約1/3處中心位置，此時(shí)玻片稍向右下傾斜，待懸液自然擴(kuò)散至片尾直到布滿(mǎn)整張玻片,平放于60-70℃干燥箱烤干過(guò)夜。

在鏡下觀察制片結(jié)果，使用的顯微鏡為zeissimager.z2，如圖5-7所示，對(duì)照組2制片方法(圖7)提高細(xì)胞懸液利用率、避免高位滴片造成的細(xì)胞浪費(fèi)、滴片位置不準(zhǔn)、細(xì)胞疊加分散不良等情況，制片效果比較好。

根據(jù)上述說(shuō)明書(shū)的揭示，本申請(qǐng)所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員還可以對(duì)上述實(shí)施方式進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兏托薷摹Ｒ虼?，本申?qǐng)并不局限于上面揭示和描述的具體實(shí)施方式，對(duì)本申請(qǐng)的一些修改和變更也應(yīng)當(dāng)落入本申請(qǐng)的權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。