技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及血漿樣品衍生化技術(shù)，具體涉及多肽樣品在血漿中衍生化的前處理技術(shù)。

背景技術(shù)：
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在生物樣本分析中，前處理技術(shù)是建立可靠，靈敏度高的分析方法的基礎(chǔ)。常見的衍生化過程，均需除去生物樣本中的蛋白后進(jìn)行測定，衍生化過程和條件根據(jù)不同的反應(yīng)多有不同。具體過程為，生物樣品利用蛋白沉淀法(包括有機(jī)溶劑蛋白沉淀法，酸沉淀法，熱變性法等)或固相萃取法進(jìn)行處理后，揮干樣品后，用反應(yīng)溶劑進(jìn)行復(fù)溶，一定條件下進(jìn)行衍生化反應(yīng)。這種方法對于蛋白結(jié)合率高和吸附性強(qiáng)的樣品分析具有一定限制。且對于反應(yīng)條件苛刻的衍生化，過程復(fù)雜，耗時長，成本高，使用溶劑對環(huán)境污染大。并且多肽的蛋白結(jié)合率高及非特異性吸附比較嚴(yán)重，使得其血漿樣品前處理面臨更加巨大挑戰(zhàn)。

質(zhì)譜由于其適用范圍廣，專屬性高，靈敏度好等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于多肽定量分析。但是在分析過程中對于一些離子化效率低的樣品，分析方法的靈敏度會受到很大影響。因此需要對樣品進(jìn)行衍生化，提高離子化效率，從而提高多肽測定的靈敏度。

本發(fā)明利用馬來酰亞胺衍生物作為衍生化試劑，利用巰基和衍生化試劑的邁克爾加成反應(yīng)的原理進(jìn)行衍生化。由于邁克爾加成反應(yīng)是十分容易進(jìn)行的反應(yīng)，對反應(yīng)條件并無特殊要求。因此建立了一個簡單快捷的一步法前處理技術(shù)，蛋白沉淀及衍生化一步進(jìn)行，不僅提高了多肽的質(zhì)譜響應(yīng)，建立了靈敏度更高的質(zhì)譜方法同時提高了多肽在血漿中的提取回收率。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明提供了一種測定血漿中含巰基多肽樣品的衍生化前處理方法。有效的提高了樣品測定的靈敏度及回收率。

一種基于衍生化的多肽在血漿樣品中的前處理方法是通過以下方案進(jìn)行實(shí)施的，流程見圖1：

稱取一定量的衍生化試劑，將其直接溶于乙腈中，配成1.5mg/ml的衍生化試劑。取空白小鼠血漿50μl，加入一定量的含有巰基的待測多肽樣品，渦旋混合。加入100μl的衍生化試劑，在40℃條件下渦旋震蕩40min。由于乙腈能夠?qū)Υ蠓肿恿康牡鞍踪|(zhì)進(jìn)行沉淀變性，同時對上清中的多肽樣品進(jìn)行衍生反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后對血漿樣品進(jìn)行離心，利用低溫冷凍離心機(jī)4℃，12000rmp，離心5min.取上清，利用優(yōu)化好的液質(zhì)方法對樣品進(jìn)行定性定量的分析。

本發(fā)明有益效果如下：

1.本發(fā)明中，操作步驟簡單，將衍生化反應(yīng)和蛋白沉淀法同時進(jìn)行，避免了傳統(tǒng)衍生化法和前處理中操作過程繁瑣等問題。

2.本發(fā)明中，反應(yīng)簡單易行，條件溫和。和常見衍生化方法相比，條件更加綠色環(huán)保，成本低。

3.多肽衍生化試劑多用于蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，能增加多肽豐度提高檢測的多肽數(shù)量。本發(fā)明將衍生化試劑用于多肽體內(nèi)分析的定量研究。

4.本發(fā)明中，將季銨基團(tuán)引入到多肽中有效提高多肽離子化效率，提高樣品測定的靈敏度。

5.本發(fā)明中，多肽樣品在衍生化后對樣品的回收率有顯著提高。多肽引入衍生化基團(tuán)后，對原有多肽結(jié)構(gòu)發(fā)生部分改變能夠有效降低蛋白結(jié)合率。

6.本發(fā)明中的方法能夠?qū)袔€基的多肽樣品進(jìn)行測定，具有應(yīng)用到含有巰基的多肽藥物的體內(nèi)分析的潛能。

7.本發(fā)明中，利用邁克爾加成的原理將馬來酰亞胺衍生物和含有巰基的多肽進(jìn)行反應(yīng)。該反應(yīng)原理適用于其他的衍生化試劑，本方法可以根據(jù)實(shí)際樣本進(jìn)行衍生化反應(yīng)。

附圖說明：

圖1為樣品前處理過程示意圖

圖2為hbb與衍生化產(chǎn)物(mpta-hbb)在相同濃度下的質(zhì)譜響應(yīng)圖。

具體實(shí)施方式：

為了更好的理解本發(fā)明，下面通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步說明，實(shí)施例只用于解釋本發(fā)明，不會對本發(fā)明定構(gòu)成任何的限定。

實(shí)施例1：利用4-(n-馬來酰亞胺基)苯基三甲基碘化銨對多肽hbb小鼠血漿樣品進(jìn)行衍生化的方法建立。

(1)hbb為血紅蛋白β鏈中的一部分，為15個氨基酸。對其體內(nèi)藥代動進(jìn)行研究。

(2)利用本發(fā)明中的衍生化方法，建立測定方法并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。具體過程為：配制1.5mg/ml的衍生化試劑。配制系列濃度的hbb樣品，濃度分別為1，3，10，20，50，100和120ng/ml的模擬血漿樣品進(jìn)行分析，選擇內(nèi)標(biāo)的濃度為50ng/ml。按照上述過程，將衍生化試劑兩倍體積加入小鼠血漿中，40℃，渦旋反應(yīng)40min，利用低溫冷凍離心機(jī)對樣品進(jìn)行離心，條件為12000rpm，5min。建立測定方法。

(3)該分析方法與常規(guī)蛋白沉淀法比較回收率和響應(yīng)均提高了很多。其中4-(n-馬來酰亞胺基)苯基三甲基碘化銨的測定結(jié)果是最好的，hbb的回收率從原來的30％提高到70％左右。同時響應(yīng)提高了174倍，見圖2。顯著改善了hbb的質(zhì)譜響應(yīng)及回收率。

技術(shù)特征：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種基于多肽衍生化方法對血漿樣品進(jìn)行前處理的方法。該方法是將衍生化試劑馬來酰亞胺衍生物：N?苯基馬來酰亞胺，1?[4?(二甲氨基)苯基]馬來酰亞胺及4?(N?馬來酰亞胺基)苯基三甲基碘化銨分別直接溶于蛋白沉淀劑乙腈中，在優(yōu)化好的條件下對含有巰基的多肽同時進(jìn)行衍生化及血漿蛋白沉淀。樣品利用低溫冷凍離心機(jī)對樣品進(jìn)行離心，取上清進(jìn)樣。建立質(zhì)譜方法并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，對樣品進(jìn)行定量分析。該方法與傳統(tǒng)的衍生化法相比大大簡化了樣品前處理步驟，同時提高了多肽回收率及分析靈敏度。該方法具有操作簡單，檢測靈敏度高，成本低等優(yōu)點(diǎn)，對含有巰基的多肽定性定量檢測具有廣泛的應(yīng)用前景。

技術(shù)研發(fā)人員：狄斌;楊漾;秦星宇;陳夢伊
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國藥科大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：2017.01.13
技術(shù)公布日：2017.08.15