本發(fā)明涉及一種百草枯的檢測(cè)方法，尤其涉及一種利用表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)百草枯的方法。

背景技術(shù)：

隨著科技的進(jìn)步，農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)中的使用日益變得廣泛。但農(nóng)藥在農(nóng)產(chǎn)品中的殘留給人身安全帶來(lái)危害。農(nóng)產(chǎn)品中殘留的農(nóng)藥被食用后，在人體內(nèi)部逐步積累，引起慢性中毒危害人身安全。

百草枯作為速效觸殺型滅生性季胺鹽類除草劑，具有高效除草效果，廣泛應(yīng)用于果蔬莊稼作物種植過程中。目前全世界超過130個(gè)國(guó)家和地區(qū)在大量使用含百草枯成份的農(nóng)藥。由于百草枯的化學(xué)分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易降解，在農(nóng)藥施用后很長(zhǎng)時(shí)間存留在植物組織中。并且由于百草枯具有強(qiáng)水溶性，使得百草枯施用后能夠長(zhǎng)時(shí)間殘留在土壤水體中，隨植物的蒸騰作用被運(yùn)輸?shù)街参锔鱾€(gè)組織中，造成農(nóng)產(chǎn)品的污染。由于百草枯對(duì)人和牲畜有較強(qiáng)的生理毒性且無(wú)特效解藥，世界范圍內(nèi)每年均有百草枯急性或慢性致死案例。由于百草枯相比于同類農(nóng)藥具有更高的效果，因而終止百草枯在世界范圍內(nèi)的使用是不現(xiàn)實(shí)的，因而加強(qiáng)對(duì)農(nóng)產(chǎn)品中百草枯的檢測(cè)，對(duì)世界衛(wèi)生安全具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

現(xiàn)有技術(shù)中百草枯的檢測(cè)方法主要包括酶聯(lián)免疫法(ELISA)、高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS/MS)、紫外分光光度法和生物傳感器法等。主流的檢測(cè)手段主要采用色譜-質(zhì)譜手段對(duì)百草枯分子進(jìn)行分離和識(shí)別，由于百草枯是一種強(qiáng)極性離子型化合物，能夠?qū)ιV柱和質(zhì)譜離子源造成損害，縮短儀器壽命，提高檢測(cè)成本。美國(guó)分析化學(xué)家協(xié)會(huì)(AOAC)現(xiàn)行推薦的百草枯檢測(cè)方法需要對(duì)百草枯陽(yáng)離子進(jìn)行還原反應(yīng)，衍生化后進(jìn)行檢測(cè)，提取步驟十分復(fù)雜，需要在硫酸中回流5h以上，操作復(fù)雜。由于色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)前處理程序復(fù)雜、操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、檢測(cè)成本高，而而酶聯(lián)免疫法容易產(chǎn)生假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果，生物傳感器法檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性還有待提高。所以現(xiàn)有技術(shù)所提供的檢測(cè)百草枯的方法并不能實(shí)現(xiàn)對(duì)百草枯快速、廉價(jià)、準(zhǔn)確和靈敏的檢測(cè)。

拉曼光譜分析技術(shù)是基于印度科學(xué)家C.V.拉曼所發(fā)現(xiàn)的拉曼散射效應(yīng)，對(duì)與入射光頻率不同的散射光譜進(jìn)行分析以得到分子振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)方面信息，并應(yīng)用于分子結(jié)構(gòu)研究的一種分析方法。表面增強(qiáng)拉曼光譜(Surface enhanced Raman spectroscopy，SERS)技術(shù)采用經(jīng)特殊處理表面粗糙化的金屬，通過把被分析有機(jī)物吸附在粗糙金屬表面，使得被分析物的拉曼散射信號(hào)增強(qiáng)10⁵～10¹⁴，從而克服常規(guī)激光拉曼光譜技術(shù)靈敏度低的缺點(diǎn)。SERS技術(shù)為食品及復(fù)雜生物體系中痕量物質(zhì)的快速、靈敏檢測(cè)提供一種新的途徑，被廣泛應(yīng)用于痕量有機(jī)分子的分析?，F(xiàn)有技術(shù)中采用銀納米粒子溶膠利用SERS檢測(cè)技術(shù)對(duì)百草枯分子進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)限可達(dá)到0.1mg/mL，但低于0.1mg/mL濃度的百草枯含量依然能通過積累效應(yīng)對(duì)人體產(chǎn)生毒害。

果汁、蔬菜汁等飲料成分復(fù)雜，會(huì)對(duì)檢測(cè)基底產(chǎn)生干擾，影響檢測(cè)結(jié)果靈敏度。因此需要對(duì)現(xiàn)有技術(shù)加以改進(jìn)，能夠快速、高效、準(zhǔn)確的測(cè)定出果汁等樣品中痕量的百草枯。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種利用表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)百草枯的方法，該方法能夠簡(jiǎn)便快捷的實(shí)現(xiàn)樣品尤其是飲料中百草枯含量的準(zhǔn)確檢測(cè)，并且靈敏度好，選擇性高。

本發(fā)明技術(shù)方案為：一種利用表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)百草枯的方法，步驟包括：

(1)待測(cè)樣品用弱陽(yáng)離子交換樹脂預(yù)處理，收集洗脫液；

(2)用金納米顆粒溶膠做基底，通過表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)洗脫液。

待測(cè)樣品為果汁、蔬菜汁或者其混合物，尤其是蘋果汁。且待測(cè)樣品中不含固體懸浮物。

待測(cè)樣品中糖含量為8wt％～20wt％，糖酸比為10～15：1。優(yōu)選的，樣品中糖含量為10wt％～13wt％，糖酸比為11～14：1。

進(jìn)一步，步驟(1)所述預(yù)處理的步驟包括：

a.用體積比為0.5～1.5：1的甲醇與超純水的混合液作為活化液，對(duì)弱陽(yáng)離子交換樹脂柱進(jìn)行活化；

b.將待檢測(cè)樣品上樣；

c.用淋洗液進(jìn)行淋洗；所述的淋洗液為體積比0.5～1.5：1的甲醇與水的混合液；

d.用洗脫劑進(jìn)行洗脫，并收集洗脫液；所述的洗脫劑為體積比1.5～2.5：70～100：9～16的甲酸、甲醇和水的混合液。

所述活化液、待測(cè)樣品、淋洗液、洗脫劑的體積比為4～8：5：2～4：1～3；所述活化液中甲醇與水的體積比為0.5～1.5：1；所述淋洗液中甲醇與水的體積比為0.5～1.5：1；所述洗脫劑中甲酸、甲醇與水的體積比為1.5～2.5：70～100：9～16。

優(yōu)選的，所述活化液、待測(cè)樣品、淋洗液、洗脫劑的體積比為5～7：5：2.5～3.5：1.5～2.5；所述活化液中甲醇與水的體積比為0.9～1.1：1；優(yōu)選的，所述淋洗液中甲醇與水的體積比為0.9～1.1：1；優(yōu)選的，所述洗脫劑中甲酸、甲醇與水的體積比為1.8～2.2：80～90：11～15。

更為優(yōu)選的，所述活化液、待測(cè)樣品、淋洗液、洗脫劑的體積比為6：5：3：2；所述活化液中甲醇與水的體積比為1：1；更為優(yōu)選的，所述淋洗液中甲醇與水的體積比為1：1；更為優(yōu)選的，所述洗脫劑中甲酸、甲醇與水的體積比為2：85：13。

進(jìn)一步，步驟(1)所述的預(yù)處理步驟還包括：弱陽(yáng)離子交換樹脂柱洗脫得到的洗脫液用孔徑為0.2～0.3μm濾膜過濾。

優(yōu)選的，所述金納米顆粒溶膠粒徑為64±6nm。

進(jìn)一步，所述金納米顆粒溶膠的制備方法包括以下步驟：將氯金酸溶液加熱至沸騰，加入檸檬酸三鈉溶液后攪拌并保持沸騰10～25min。更優(yōu)選的，可將產(chǎn)物冷卻離心，棄去上清液，得到金納米顆粒溶膠(離心濃縮倍數(shù)約5～20倍)。

所述氯金酸、檸檬酸三鈉的質(zhì)量比為1：0.5～1.5，優(yōu)選為1：0.6～1；所述檸檬酸三鈉溶液的濃度為0.5wt％～1.5wt％，優(yōu)選為0.8wt％～1.2wt％；所述氯金酸溶液的濃度為0.005wt％～0.015wt％，優(yōu)選為0.009wt％～0.011wt％。

進(jìn)一步，所述金納米顆粒溶膠的制備方法包括以下步驟：將濃度為0.01wt％的氯金酸溶液加熱至沸騰，加入濃度為1wt％檸檬酸三鈉溶液后攪拌并保持沸騰12～15min；氯金酸溶液與檸檬酸三鈉溶液的體積比為100：0.7；產(chǎn)物冷卻離心，棄去上清液，得到金納米顆粒溶膠(離心濃縮倍數(shù)約5～20倍)。

進(jìn)一步，所述表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)中采用的激光波長(zhǎng)優(yōu)選為780nm，掃描范圍優(yōu)選為550～2000cm^-1。

在1645±5cm^-1特征峰下，峰強(qiáng)度與百草枯濃度線性相關(guān)。測(cè)定不同百草枯濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品表面增強(qiáng)拉曼光譜強(qiáng)度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量檢測(cè)待測(cè)樣品中百草枯的濃度。

本發(fā)明的有益效果在于，提供了一種利用表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)百草枯的方法，果汁、蔬菜汁等樣品經(jīng)過弱陽(yáng)離子交換樹脂預(yù)處理，然后采用金納米顆粒溶膠做基底，通過表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)樣品中百草枯。在1645±5cm^-1下，峰強(qiáng)度與百草枯濃度線性相關(guān)，從而可以對(duì)百草枯進(jìn)行定量檢測(cè)。該方法能夠快速、有效地定性或定量檢測(cè)樣品中百草枯。

本發(fā)明的方法靈敏度高，檢測(cè)限低，能夠有效定性或定量檢測(cè)出果汁等樣品中殘留的百草枯，檢測(cè)限0.02μg/mL，優(yōu)于歐盟的最低檢測(cè)限標(biāo)準(zhǔn)(0.05μg/mL)，而未經(jīng)過弱陽(yáng)離子交換樹脂預(yù)處理的樣品，百草枯含量的檢測(cè)限為5μg/mL。因此本技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)了百草枯農(nóng)藥的實(shí)用、快速、高效、低成本檢測(cè)。

附圖說明

圖1為百草枯標(biāo)準(zhǔn)品的拉曼光譜；

圖2為實(shí)施例1金納米顆粒TEM圖；

圖3為百草枯標(biāo)準(zhǔn)溶液SERS譜圖；

圖4為經(jīng)過WCX柱預(yù)處理的含百草枯蘋果汁SERS譜圖；

圖5為蘋果汁中百草枯含量的定量分析模型；

圖6為直接混合法測(cè)定蘋果汁中百草枯SERS譜圖；

圖7為采用不同尺寸金納米顆粒為基底的百草枯標(biāo)準(zhǔn)溶液SERS譜圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。實(shí)施例中所采用的蘋果汁含糖量在12～13g/100mL之間，糖酸比在13～15：1范圍內(nèi)。

實(shí)施例1 金納米顆粒溶膠的制備

將100mL濃度為0.01wt％的氯金酸溶液倒入燒瓶中，放在恒溫磁力攪拌器上，1100rpm劇烈攪拌并加熱至溶液沸騰，然后加入0.7mL濃度為1wt％的檸檬酸三鈉溶液，同時(shí)以1100rpm劇烈攪拌并保持沸騰15min，冰浴迅速結(jié)束反應(yīng)，待反應(yīng)液冷卻后，取15mL離心后棄除上層清液(約14mL)，取下層的金納米顆粒水溶膠，用于后續(xù)的檢測(cè)。

對(duì)所制備的金納米顆粒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖2，所制備的金納米顆粒平均粒徑為64±6nm，尺寸均勻，分散度好。

實(shí)施例2 百草枯標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢測(cè)

首先配制梯度濃度的百草枯標(biāo)準(zhǔn)水溶液(10μg/L、5μg/L、2μg/L、1μg/L、0.5μg/L、0.2μg/L、0μg/L)，將標(biāo)準(zhǔn)水溶液用0.22μm濾膜過濾后，取50μL置于1.5mL離心管中，加入等體積的金納米顆粒溶膠(實(shí)施例1制備)混合，渦旋振蕩10s后，取5μL混合液滴加至干凈的硅片上，烘干后采用顯微拉曼光譜儀進(jìn)行表面增強(qiáng)拉曼光譜測(cè)定。顯微拉曼光譜儀功率為80mW，激光波長(zhǎng)為780nm，采集的波譜范圍為550～2000cm^-1。

梯度濃度的百草枯標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)試結(jié)果如圖3所示，百草枯標(biāo)準(zhǔn)品的拉曼譜圖如圖1所示。根據(jù)圖3分析可知，本技術(shù)方案所提供的SERS技術(shù)對(duì)百草枯標(biāo)準(zhǔn)溶液的最低檢出濃度為0.2μg/L，說明以金納米顆粒溶膠作為基底的SERS檢測(cè)百草枯的方法具有高靈敏性。

實(shí)施例3 蘋果汁中百草枯的直接測(cè)定

蘋果汁中加入百草枯母液，配制0～20μg/mL梯度濃度的百草枯的蘋果汁樣品并經(jīng)過0.22μm濾膜過濾，取50μL置于1.5mL離心管中，加入等體積金納米顆粒溶膠(實(shí)施例1制備混合)，振蕩10s后，取5μL滴在干凈硅片上，烘干，采用顯微拉曼光譜儀進(jìn)行測(cè)定。顯微拉曼光譜儀功率80mW，激光波長(zhǎng)780nm，掃描范圍550～2000cm^-1。

所獲得的SERS譜圖如圖6所示，可以看出采用直接混合法測(cè)定蘋果汁中百草枯含量，最低檢測(cè)濃度為5μg/mL。

實(shí)施例4 用弱陽(yáng)離子交換樹脂預(yù)處理蘋果汁樣品并檢測(cè)百草枯

(一)用弱陽(yáng)離子交換樹脂預(yù)處理蘋果汁樣品

蘋果汁中加入百草枯母液，配制梯度濃度的含百草枯的蘋果汁(百草枯濃度分別為0.02μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL)，然后將含有百草枯的蘋果汁用CNWBOND WCX弱陽(yáng)離子交換SPE小柱(60mg，3mL；上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份)預(yù)處理。

具體操作為：①取6mL等體積比的甲醇-超純水混合液對(duì)WCX小柱進(jìn)行活化；

②取5ml待測(cè)的蘋果汁上樣；

③取3ml等體積比的甲醇-水溶液進(jìn)行淋洗；

④取2ml甲酸-甲醇-水進(jìn)行洗脫，其中甲酸、甲醇和水的體積比為2：85：13；并且采用孔徑為0.22μm的PVDF針式濾膜過濾洗脫液。

(二)蘋果汁中百草枯含量的測(cè)定

將所得洗脫液與等體積的金納米顆粒溶膠(實(shí)施例1制備)混合，然后渦旋振蕩10秒鐘，得到檢測(cè)溶液。

取5μL檢測(cè)溶液滴加到干凈的硅片上，并烘干，然后通過顯微拉曼光譜儀進(jìn)行測(cè)定。顯微拉曼光譜儀功率為80mW，激光波長(zhǎng)為780nm，采集的波譜范圍為550～2000cm^-1，SERS譜圖如圖4所示。

結(jié)合圖4的SERS譜圖可知，百草枯的最強(qiáng)特征峰為1646cm^-1，在該特征峰下繪制的工作曲線如圖5所示，并可得出1646cm^-1下峰強(qiáng)度與百草枯濃度線性相關(guān)，R²為0.982，均方根誤差為0.04，相對(duì)分析誤差為7.50。根據(jù)圖4可知，采用金納米顆粒溶膠做SERS檢測(cè)的基底檢測(cè)蘋果汁中的百草枯，檢測(cè)限可以達(dá)到0.02μg/mL，優(yōu)于歐盟設(shè)定的蘋果汁中百草枯最低檢出濃度(0.05μg/mL)。

與百草枯標(biāo)準(zhǔn)水溶液的檢測(cè)限(0.2μg/L)相比，經(jīng)過弱陽(yáng)離子交換樹脂小柱(WCX)處理后，蘋果汁中百草枯的含量檢測(cè)限為0.02μg/mL，而未經(jīng)預(yù)處理的蘋果汁，直接進(jìn)行表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)的檢測(cè)限為5μg/mL(如圖6)。這是由于蘋果汁中的除了水之外的主要成分諸如糖、氨基酸、有機(jī)酸、色素等有機(jī)分子會(huì)對(duì)表面增強(qiáng)拉曼光譜檢測(cè)方法造成干擾。將蘋果汁經(jīng)過弱陽(yáng)離子交換樹脂小柱(WCX)處理后，所得到的洗脫液中糖、氨基酸、有機(jī)酸、色素分子含量降低，減少了對(duì)百草枯分子的拉曼光譜干擾。將圖4與圖6相比，可以看出未經(jīng)過弱陽(yáng)離子交換樹脂小柱處理的蘋果汁做得到的測(cè)試譜圖基線波動(dòng)很大，雜峰較多；而經(jīng)過弱陽(yáng)離子交換樹脂小柱處理后，如圖4所示，極限很平整，并且雜峰數(shù)量減少，有效提高了檢測(cè)靈敏度。

由于果汁成分來(lái)自于植物果皮細(xì)胞中液泡內(nèi)部的細(xì)胞液，無(wú)論何種水果，其果汁主要成分均為糖、氨基酸、有機(jī)酸、色素和水。因此本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員有理由相信本具體實(shí)施方式用于蘋果汁的檢測(cè)方法對(duì)多種果汁、蔬菜汁均具有普適性。

實(shí)施例5 金納米顆粒尺寸對(duì)百草枯檢測(cè)靈敏度的影響

按實(shí)施例1的方法，通過改變檸檬酸三鈉的用量，得到粒徑大小不同的金納米顆粒溶膠。分別取粒徑23nm、49nm和102nm的金納米顆粒溶膠，以及實(shí)施例1所制備的64±6nm金納米顆粒溶膠，然后與等體積0.05μg/mL的百草枯標(biāo)準(zhǔn)水溶液混合，渦旋10s。取5μL混合液滴加至干凈的硅片上，烘干后進(jìn)行表面增強(qiáng)拉曼光譜測(cè)定。顯微拉曼光譜儀功率為80mW，激光波長(zhǎng)為780nm，采集的波譜范圍為550～2000cm^-1。

測(cè)試結(jié)果如圖7所示，根據(jù)圖7分析可知，當(dāng)金納米顆粒尺寸處于64±6nm時(shí)，所測(cè)得的表面增強(qiáng)拉曼光譜的特征峰強(qiáng)度最大，因此采用粒徑64±6nm的金納米顆粒溶膠進(jìn)行百草枯的檢測(cè)最為靈敏。

需要指出的是，上述實(shí)施例僅為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此項(xiàng)目技術(shù)的人士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。