本發(fā)明屬于化學(xué)品急性毒性檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種化學(xué)品毒性藻紅外測試的三指標(biāo)評價方法。

背景技術(shù)：

藻類細胞具有光合磷酸化和氧化磷酸化的兩套能量代謝系統(tǒng)，毒物作用前后藻代謝能量會產(chǎn)生微量變化，這種微能量變化可被紅外測溫儀測試，對測試藻溫進行處理便能分析藻對毒物的響應(yīng)。該技術(shù)具有快速、簡便、價廉、可現(xiàn)場測試等特點，然而，該技術(shù)一直存在4個問題：一是未考慮紅外測溫儀測試的末位藻溫波動性，每次每個測試杯只測1個藻溫，與波動藻溫平均值的偏差較大；二是未考慮到兩個測試杯的藻溫之差伴隨整個測溫過程，在毒性測試藻響應(yīng)溫差時未減去；三是用加藥組和對照組只能得到1種藻溫差，不能藻溫差比較分析；四是只用了藻響應(yīng)溫差這一個指標(biāo)分析藻對毒物的響應(yīng)，效果較差。這4個問題的存在，使藻紅外測試技術(shù)測試毒物毒性的性能較低。

目前，國內(nèi)外關(guān)于急性毒性的單細胞微生物測試法改進的研究報道主要有發(fā)光細菌生物毒性測試方法的改進、發(fā)光細菌毒性測試條件的優(yōu)化、發(fā)光細菌急性毒性測試方法的優(yōu)化、水質(zhì)急性毒性發(fā)光細菌測試法的改進、對測試水質(zhì)發(fā)光細菌的菌種進行改進、Menz J等對發(fā)光細菌法進行改進。關(guān)于藻紅外測試研究有敏感藻的確定方法、重金屬急性毒性藻紅外測試、農(nóng)藥急性毒性藻紅外測試、有機毒害物急性毒性藻紅外測試、急性毒性藻紅外測試中聯(lián)合作用的評價方法、藻紅外測試多元有機毒物急性毒性的初步分析、急性毒性藻紅外測試中聯(lián)合作用評價法的重現(xiàn)性，有關(guān)化學(xué)品急性毒性藻紅外測試技術(shù)改進方法的研究尚未見報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有藻紅外測試方法測試毒物毒性性能較低的問題，提供一種化學(xué)品毒性藻紅外測試的三指標(biāo)評價方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種化學(xué)品毒性藻紅外測試的三指標(biāo)評價方法，包括以下步驟：

(1)藻響應(yīng)測試

選擇滇池銅綠微囊藻為供試藻，其藻密度≥3.16×10⁹個/L；

藻溫測試過程：空白組3重復(fù)，對照組3重復(fù)，加藥組3重復(fù)，在每個測試杯中分別加入5mL藻液，加完后測試每個測試杯的藻溫；

然后進行以下加藥測試：①蒸餾水毒性測試時，用滴液管分別滴加蒸餾水0.05mL于加藥組和對照組的測試杯中，待藻溫穩(wěn)定時測試每個測試杯的藻溫；②待測藥品的毒性測試時，用滴液管滴加0.05mL待測藥液于加藥組的測試杯中，用滴液管滴加蒸餾水0.05mL于對照組的測試杯中，滴加完后測試每個測試杯的藻溫；

(2)數(shù)據(jù)分析

藻響應(yīng)溫差計算方法為：ΔT＝∣ΔT_j∣―∣ΔT_d∣，ΔT＞0

加藥組藻溫差計算方法為：ΔT_j＝(T_j-ti-T_j-t0)-(T_k-ti-T_k-t0)

對照組藻溫差計算方法為：ΔT_d＝(T_d-ti-T_d-t0)-(T_k-ti-T_k-t0)

式中：T_j-ti—加藥后加藥組的藻溫；T_j-t0—加藥前加藥組的藻溫；T_k-ti—加藥后空白組的藻溫；T_k-t0—加藥前空白組的藻溫；T_d-ti—加水后對照組的藻溫；T_d-t0—加水前對照組的藻溫；j—加藥組，滴加藥液；d—對照組，滴加蒸餾水；k—空白組，不滴加藥液或蒸餾水；t_i—測溫遍數(shù)，i＝0,為加藥前的測溫；i＝1,2…n,為加藥后第1,2…n遍測溫；

(3)三指標(biāo)法評價藻對藥液的響應(yīng)

當(dāng)藻溫差數(shù)據(jù)同時滿足下面三個指標(biāo)時，表示藻對藥液有響應(yīng)：

指標(biāo)①—最大藻溫差比較值，︱ΔT_j-max︱＞︱ΔT_d-max︱；

指標(biāo)②—平均藻溫差比較值，∣Δ〒_j∣＞∣Δ〒_d∣；

指標(biāo)③—藻響應(yīng)率(ψ)，∣ΔT_j∣＞∣ΔT_d∣的出現(xiàn)次數(shù)≥6；

其中：ΔT_j-max—加藥組的最大藻溫差，ΔT_d-max—對照組的最大藻溫差，Δ〒_j—加藥組的平均藻溫差，Δ〒_d—對照組的平均藻溫差。

作為優(yōu)選，步驟(1)中測藻溫時，每次每個測試杯連測3個藻溫，3個藻溫的平均值即為測試杯的藻溫。

作為優(yōu)選，步驟(1)中加藥前測溫1遍，加藥后測溫10遍，其中，三個重復(fù)測溫完成即為測溫1遍，前一遍測溫完成后，按相同的測溫順序進行下一遍測溫。

作為優(yōu)選，三指標(biāo)法評價藻響應(yīng)重金屬的靈敏度為0.001～0.1mg/L。

作為優(yōu)選，所述待測藥品為重金屬、農(nóng)藥、有機藥品、抗生素。

相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下有益效果：

1、本發(fā)明采用三指標(biāo)法(即最大藻溫差比較值、平均藻溫差比較值、藻響應(yīng)率的分析法)分析藻對毒物的響應(yīng)，降低了分析結(jié)果的偶然性，能夠控制假結(jié)果出現(xiàn)率為20％，由其評價藻響應(yīng)重金屬的靈敏度為0.001～0.1mg/L，由其得到的測試結(jié)果的平均重現(xiàn)率為86.8～100％、重現(xiàn)性出現(xiàn)率為100％，具有準(zhǔn)確性高，重復(fù)性好，靈敏度高的特點；

2、本發(fā)明每次每個測試杯連測3個藻溫，用其平均值避免了儀器測試藻溫的波動性造成的偏差，用空白組、對照組、加藥組三個測試組，得到兩種藻溫差，避免了現(xiàn)有測試技術(shù)只能得到一種藻溫差，不能進行藻溫差比較分析的問題。

附圖說明

圖1為實施例1測試杯的布局圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和具體實施方式，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步說明。

本發(fā)明所采用的原料和設(shè)備若非特指，均可從市場購得或是本領(lǐng)域常用的，實施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。

實施例1

本實施例以重金屬為例對藻紅外測試的三指標(biāo)評價方法進行詳細說明。

1、試驗材料

藻種：滇池銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa in Dianchi Lake in china)及其培養(yǎng)基配方由中國科學(xué)院武漢水生生物研究所提供。該藻具有春化作用，為滇池水華藻種，生長快、飽和密度高，可保證實驗所需的藻密度和藻用量。

藥品：ZnCl₂，Pb(NO₃)₃，CuSO₄，F(xiàn)eCl₃·6H₂O，MnSO₄.H₂O，CrCl₃·6H₂O，HgSO₄，AlCl₃·6H₂O，Cd(NO₃)₃·4H₂O。

上述藥液的配制要求為：取1滴藥液(約0.05mL)加入5mL藻液中，使得加入藻液中的重金屬濃度等于《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》GB5749-2006對應(yīng)毒理指標(biāo)重金屬濃度(見各重金屬毒性分析表)。

其中，藻液中重金屬濃度計算方法為：

N＝M÷(1000×D)×(重金屬原子量÷藥品分子量)×1000ml÷V

式中：N—藻液中藥品濃度，M—藥液濃度，D—移液管滴定1ml藥液的滴數(shù)，V—測試杯中藻液毫升數(shù)。

儀器：紅外測溫儀，型號ST60，靈敏度0.1℃。

測試杯：直徑4cm、高3cm、厚0.1～0.2cm的透明塑料容器。

2、試驗方法

2.1、藻溫測試方法

藻溫測試在室內(nèi)條件下進行，采用散射日光或燈光采光。實驗的藻液用量為5ml/杯，藻密度≥3.16×10⁹個/L；測試杯加藻液前，藻液充分搖均；當(dāng)培養(yǎng)時藻增長率≤0時，藻液不再用于實驗；滴加藥液前，藥液充分搖勻。

本實施例測試杯布局如圖1所示，在每個測試杯中加入5mL藻液，加完后進行加藥前測溫記錄，每次每杯連測3個藻溫。然后，滴加藥液，蒸餾水毒性測試時，用滴液管分別滴加蒸餾水1滴(約0.05ml)于加藥組、對照組的測試杯中，重金屬毒性測試時，用滴液管滴加藥液1滴與加藥組的測試杯中，用滴液管滴加蒸餾水1滴于對照組的測試杯中，立即進行加藥后的測溫記錄，每次每杯連測3個藻溫。測溫時，紅外測溫儀頭部距離藻液正上方10～15cm，指示紅色光點對準(zhǔn)藻液面中心時測溫。每杯每次連測3個藻溫，用于計算平均值。測溫順序：按如圖1所示的布局從上到下，從左到右。測溫遍數(shù)：三個重復(fù)測溫完時即為測溫1遍。藥液滴入藻液后到藻產(chǎn)生響應(yīng)有一個過程，藻對不同藥液的響應(yīng)過程不同，加藥前測溫1遍，加藥后測溫10遍。前一遍測溫完后接著下一遍測溫。

本實施例中藻溫的計算公式為：

T＝(T_n1+T_n2+T_n3)÷3 (1)

T_ni＝(T_b1+T_b2+T_b3)÷3 (2)

T_bi＝(T₁+T₂+T₃)÷3 (3)

(1)、(2)、(3)中：T—每遍測溫的處理藻溫；T_n1、T_n2、T_n3—分別為重復(fù)一、二、三的平均藻溫；T_ni—重復(fù)組的平均藻溫，i＝1,2,3；T_bi—每個測試杯的平均藻溫,i＝1,2,3；T_b1、T_b2、T_b3—分別為空白、對照、加藥的測試杯的平均藻溫；T_i—每個測試杯連續(xù)測試的藻溫(3個藻溫)，i＝1,2,3。

2.2、藻溫差計算方法

藻響應(yīng)溫差計算：藻響應(yīng)溫差是指加藥組藻溫差的絕對值與對照組藻溫差的絕對值的差值，該差值大于零，其計算方法為：

ΔT＝∣ΔT_j∣―∣ΔT_d∣，ΔT＞0

加藥組藻溫差計算：ΔT_j＝(T_j-ti-T_j-t0)-(T_k-ti-T_k-t0)

對照組藻溫差計算：ΔT_d＝(T_d-ti-T_d-t0)-(T_k-ti-T_k-t0)

式中：T_j-ti—加藥后加藥組的藻溫；T_j-t0—加藥前加藥組的藻溫；T_k-ti—加藥后空白組的藻溫；T_k-t0—加藥前空白組的藻溫；T_d-ti—加水后對照組的藻溫；T_d-t0—加水前對照組的藻溫；j—加藥組，滴加藥液；d—對照組，滴加蒸餾水；k—空白組，不滴加藥液或蒸餾水；t_i—測溫遍數(shù)，i＝0,為加藥前的測溫；i＝1,2…n,為加藥后第1,2…n遍測溫。

3、藻對藥液響應(yīng)的三指標(biāo)評價法

當(dāng)藻溫差數(shù)據(jù)同時滿足下面三個指標(biāo)時，表示藻對藥液有響應(yīng)：

指標(biāo)①—最大藻溫差比較值，︱ΔT_j-max︱＞︱ΔT_d-max︱；

指標(biāo)②—平均藻溫差比較值，∣Δ〒_j∣＞∣Δ〒_d∣；

指標(biāo)③—藻響應(yīng)率(ψ)，∣ΔT_j∣＞∣ΔT_d∣的出現(xiàn)次數(shù)≥6；

其中：ΔT_j-max—加藥組的最大藻溫差，ΔT_d-max—對照組的最大藻溫差，Δ〒_j—加藥組的平均藻溫差，Δ〒_d—對照組的平均藻溫差。

4、結(jié)果與討論

分析三指標(biāo)法的評價效果是利用水平比較法和垂直比較分析法，水平比較分析法是指不同指標(biāo)法評價同一種藥液濃度的藻溫差的比較方法，用來分析控制假結(jié)果出現(xiàn)率，如蒸餾水毒性測試實驗。垂直比較分析法是指不同指標(biāo)法評價不同濃度藥液的藻溫差的比較方法，用來分析不同評價法對藻響應(yīng)藥液的靈敏度，如重金屬毒性測試實驗。

評價法的控制假結(jié)果出現(xiàn)率與靈敏度的關(guān)系是正相關(guān)關(guān)系，即控制假結(jié)果出現(xiàn)率的效果好，則評價的靈敏度就高(見4.2.1c)。這是控制假結(jié)果出現(xiàn)率是檢驗技術(shù)可行性的唯一標(biāo)準(zhǔn)的原因，也是控制測試結(jié)果質(zhì)量的原因。

4.1、蒸餾水毒性測試試驗

檢驗的理論：在10次蒸餾水毒性測試中，10個測試結(jié)果為藻無響應(yīng)，可能三指標(biāo)法門檻過高，實測時一些有毒藥液毒性可能不能被測出；藻有響應(yīng)的測試結(jié)果占多數(shù)，可能三指標(biāo)法門檻過低，實測時一些無毒藥液可能被測出有毒性；藻無響應(yīng)的測試結(jié)果占大多數(shù)，表明藻有響應(yīng)(假結(jié)果)出現(xiàn)率得到控制，這樣的三指標(biāo)法才能評價藻溫差。因此，能否控制假結(jié)果出現(xiàn)率，是檢驗三指標(biāo)法的唯一標(biāo)準(zhǔn)。

4.1.1、不同藻響應(yīng)率對三指標(biāo)法影響的分析結(jié)果

由表1可知，連測3個藻溫的三指標(biāo)法的藻響應(yīng)率為60％、50％、70％、80％時，藻無響應(yīng)結(jié)果(真結(jié)果)出現(xiàn)率分別是80％、60％、80％、100％，當(dāng)藻響應(yīng)率達到60％時，藻無響應(yīng)結(jié)果(真結(jié)果)的出現(xiàn)率達到80％，藻無響應(yīng)結(jié)果(真結(jié)果)的出現(xiàn)率已足夠高，因此三指標(biāo)法中設(shè)計的藻響應(yīng)率60％是合理的。

表1三指標(biāo)法中藻響應(yīng)率與測試分析結(jié)果

4.1.2、蒸餾水毒性的不同指標(biāo)分析結(jié)果

由表2可知，連測3個藻溫的不同指標(biāo)法評價的真結(jié)果重現(xiàn)率：三指標(biāo)法為80％、①指標(biāo)法為30％、②指標(biāo)法為20％、①②指標(biāo)法為50％，表明三指標(biāo)法中真結(jié)果的出現(xiàn)率為80％，遠遠高于單指標(biāo)法，可把假結(jié)果出現(xiàn)率控制在20％，能夠有效的控制假結(jié)果出現(xiàn)率。

表2不同指標(biāo)法的評價結(jié)果

4.1.3、蒸餾水毒性的不同藻溫數(shù)的三指標(biāo)法分析結(jié)果

由表3可知，連測3個藻溫的三指標(biāo)法評價的真結(jié)果出現(xiàn)率為80％，即假結(jié)果出現(xiàn)率為20％，測試1個藻溫的三指標(biāo)法評價的真結(jié)果出現(xiàn)率為50％，即假結(jié)果出現(xiàn)率為50％，表明連測3個藻溫的三指標(biāo)法真結(jié)果出現(xiàn)率較高，相對于測試1次藻溫的三指標(biāo)法，能夠有效控制假結(jié)果出現(xiàn)率。

表3 兩種藻溫數(shù)的三指標(biāo)法評價結(jié)果

由上述蒸餾水毒性測試試驗，分析表1、2和3可知，每次每杯測試3個藻溫的三指標(biāo)法藻無響應(yīng)結(jié)果(真結(jié)果)的出現(xiàn)率可達到80％，可有效控制“假結(jié)果”的出現(xiàn)率。

4.2、重金屬毒性測試試驗

4.2.1、不同指標(biāo)法評價的分析結(jié)果

a、毒物的生物毒性與總濃度：由表4可知，毒理指標(biāo)濃度的5種重金屬單獨存在時，藻對其無響應(yīng)，而它們以4種不同形式共存時，藻對其產(chǎn)生響應(yīng)，這主要是共存的濃度高于非共存的濃度，這符合混合毒物的生物毒性與總濃度正相關(guān)的情況。

b、三指標(biāo)法評價共存重金屬毒性：由表4可知，不同指標(biāo)法的評價效果用平均重現(xiàn)率(％)/重現(xiàn)性出現(xiàn)率(％)分析的結(jié)果是，測試3個藻溫的所有評價法都為100/100，而測試1個藻溫的三指標(biāo)法為67/100，表明在共存重金屬濃度(實驗的高濃度0.066～0.156mg/L)時，所有評價方法都可藻對藥液評價的響應(yīng)，但測試3個藻溫的三指標(biāo)法優(yōu)于測試1個藻溫的三指標(biāo)法。

c、不同指標(biāo)法評價共存重金屬毒性：由表4可知，不同指標(biāo)法的評價效果用平均重現(xiàn)率(％)/重現(xiàn)性出現(xiàn)率(％)分析的結(jié)果是，測試3個藻溫中的三指標(biāo)法為100/100、雙指標(biāo)法為0/13.4、單指標(biāo)法為0/0和0/13.4，從中可以看出，雙指標(biāo)法和單指標(biāo)法評價得到的無響應(yīng)結(jié)果沒有重現(xiàn)性，因為它們不能控制假結(jié)果出現(xiàn)率(見4.1.2)，假結(jié)果大量出現(xiàn)；相反，三指標(biāo)法能夠控制假結(jié)果出現(xiàn)率；分析說明，控制假結(jié)果出現(xiàn)率對技術(shù)非常重要。平均重現(xiàn)率(％)/重現(xiàn)性出現(xiàn)率(％)比較是：測試3個藻溫中的三指標(biāo)法為100/100，測試1個藻溫的三指標(biāo)法為81.2/100，說明后者評價結(jié)果的重現(xiàn)性較低，是因為后者控制假結(jié)果重現(xiàn)率低于前者(見4.1.3)，導(dǎo)致評價效果不如前者。分析可知，在單一重金屬濃度低濃度(實驗的低濃度0.001～0.1mg/L)時，測試3個藻溫的三指標(biāo)法評價效果最好。

由上述分析可知，測試3個藻溫的三指標(biāo)法能夠評價藻對實驗的高低濃度藥液的響應(yīng)，即能夠評價的藥液濃度范圍更大，評價的靈敏度高，可達0.001～0.1mg/L。

表4單一、共存重金屬毒性的不同指標(biāo)法評價結(jié)果

注：重現(xiàn)率＝相同結(jié)果數(shù)÷總結(jié)果數(shù)×100％，重現(xiàn)性出現(xiàn)率＝重復(fù)性結(jié)果數(shù)÷總結(jié)果數(shù)×100％。

4.2.2、共存重金屬毒性三指標(biāo)法評價的分析結(jié)果

a、評價指標(biāo)的分析：從測試的3個藻溫的三指標(biāo)法評價中評價結(jié)果與各指標(biāo)的關(guān)系(表5-1)可知，測試數(shù)據(jù)在指標(biāo)①、指標(biāo)②的分析值大于0，而指標(biāo)③的分析值大于或等于60％，表明藻對共存重金屬的響應(yīng)通過了三指標(biāo)的評價，但測試結(jié)果有待重現(xiàn)性分析。

表5-1 共存重金屬毒性三指標(biāo)法的評價結(jié)果

b、評價結(jié)果的重現(xiàn)性分析：由表5-2可知，藻對5種不同共存重金屬的有響應(yīng)結(jié)果“+”都有重復(fù)性，表明有重現(xiàn)性的測試結(jié)果可靠。由表5-2還可知，共存重金屬數(shù)(元數(shù))的測試結(jié)果重現(xiàn)率是：2元、3元共存的為67％，低于兩個4元共存、一個5元共存的100％，平均為86.8％，表明測試3個藻溫的三指標(biāo)法的靈敏度好。

表5-2 三指標(biāo)法評價結(jié)果的重現(xiàn)性分析

4.3、重現(xiàn)性試驗分析

測試結(jié)果的可靠性需要重現(xiàn)性實驗分析，當(dāng)3次實驗有2次測試結(jié)果相同，測試結(jié)果具有重現(xiàn)性，有重現(xiàn)性的測試結(jié)果才是可靠的測試結(jié)果。在重金屬毒性測試實驗結(jié)果中，測試3個藻溫的三指標(biāo)法評價不同藻溫差的測試結(jié)果都有重現(xiàn)性，其平均重現(xiàn)率為86.8％(表5-2)、100％(表4)，重現(xiàn)性出現(xiàn)率為100％(表4，表5-2)，表明改進后的技術(shù)具有很好的穩(wěn)定性、具有重現(xiàn)性的測試結(jié)果可靠。在測試急性毒性時，重現(xiàn)性分析不可或缺。

4.4、總結(jié)

測試3個藻溫的三指標(biāo)法能夠很好地控制假結(jié)果出現(xiàn)率，表明該三指標(biāo)法能夠控制測試結(jié)果的質(zhì)量。為使測試結(jié)果可靠，重現(xiàn)性實驗也是測試結(jié)果的重要質(zhì)量保證。測試3個藻溫的三指標(biāo)法能夠控制假結(jié)果出現(xiàn)率為20％，由其評價藻響應(yīng)重金屬的靈敏度為0.001～0.1mg/L，由其得到的測試結(jié)果的平均重現(xiàn)率為86.8～100％、重現(xiàn)性出現(xiàn)率為100％。由此可知，測試3個藻溫的三指標(biāo)法具有準(zhǔn)確性高，重復(fù)性好，靈敏度高的特點。

最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。