本發(fā)明涉及體外診斷技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種血小板功能檢測方法。

背景技術(shù)：

血栓性疾?。ㄈ缧墓?、腦梗等）具有高發(fā)病率，高致殘和高致死率，已成為目前全球疾病致死的首要因素，而血小板在血栓形成中起關(guān)鍵作用，也是形成動(dòng)脈血栓的主要因素。在醫(yī)學(xué)臨床實(shí)踐中也將抗血小板藥物作為血栓性疾病治療和預(yù)防的主要措施。醫(yī)學(xué)研究已證實(shí)血小板功能異常時(shí)發(fā)生血栓性疾病和出血性疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加。因此，要維護(hù)機(jī)體處于健康狀態(tài)，避免血栓或出血性疾病的發(fā)生，需要控制血小板功能處于一個(gè)合理的功能狀態(tài)范圍內(nèi)。

血小板功能檢測的臨床意義：

1，抗血小板藥物與血小板功能檢測

前抗血小板藥物已成為臨床對血栓性疾病進(jìn)行預(yù)防和治療的有效的和重要的核心措施?，F(xiàn)在許多中年及以上患者每天服用一片阿司匹林預(yù)防血栓性疾病。阿司匹林的抗血栓機(jī)理主要是通過抑制機(jī)體中血小板的功能實(shí)現(xiàn)預(yù)防血栓的目的。但醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，人對阿司匹林等抗血小板藥物的反應(yīng)個(gè)體差異很大。其中約20％的人被確定為血小板對阿司匹無反應(yīng)性；還有13％會(huì)出現(xiàn)臨床阿司匹林抵抗（即服用阿司匹林非但沒有抑制血栓病的發(fā)生，反而出現(xiàn)血栓癥狀）。近年來對抗血小板藥物個(gè)體差異的研究也比較成熟，可以確定約有30%的個(gè)體在使用相同品種、相同劑量的抗血小板藥物無效，同時(shí)約有10%的患者服藥抗血小板藥物后會(huì)出現(xiàn)出血，說明人體對抗血小板藥物存在較大的個(gè)體差異。因此，如果及時(shí)檢測出抗血小板藥物無效的患者以及用藥過量或不適的患者，抗血栓的預(yù)防、治療效率至少將提供20%以上。而目前由于95%以上的高風(fēng)險(xiǎn)人群及抗血小板藥物應(yīng)用的患者都沒有得到血小板功能檢測，無法及時(shí)發(fā)現(xiàn)哪些患者屬于受到不利影響的群體，目前的血栓病治療或預(yù)防的效果只能憑臨床經(jīng)驗(yàn)，由于目前血小板功能檢測缺失導(dǎo)致血栓性疾病危害十分嚴(yán)重。因此，開展血小板功能檢測不僅可以作為血栓性疾病的診斷依據(jù)，而且更重要的是血小板功能檢測可以及時(shí)對患者使用抗血小板藥物的療效進(jìn)行有效評價(jià)和監(jiān)控，指導(dǎo)臨床醫(yī)師進(jìn)行必要的用藥調(diào)整，確保對血栓性疾病預(yù)防和治療達(dá)到預(yù)期效果并避免或減少副作用。

2，血小板功能檢測的現(xiàn)狀

血小板功能檢測的方法有多種，包括以檢測血小板粘附功能；血小板聚集功能；血小板釋放因子等幾種類型。其中一種以光學(xué)比濁法為基本原理檢測血小板聚集功能的方法應(yīng)用最為普遍，但是由于該方法操作十分繁瑣、檢測結(jié)果穩(wěn)定性差，在臨床應(yīng)用較少。除此之外其它的血小板功能檢測的方法如血小板粘附功能檢測、血小板釋放因子檢測等方法也因?yàn)闄z測操作復(fù)雜、設(shè)備成本高、檢測結(jié)果質(zhì)量差等原因也沒有得到普及應(yīng)用。近年來，使用血栓彈力圖儀檢測血小板功能逐步增多，這種方式采用的是凝固法檢測，由于直接檢測了血小板參與促凝的功能，其結(jié)果較之前的方法更可靠。

但是血栓彈力圖儀檢測技術(shù)產(chǎn)生在上世紀(jì)七十年代以前，雖然現(xiàn)在逐步廣泛用于應(yīng)用于臨床，但由于過去生產(chǎn)技術(shù)和檢測方法較為落后,使基于血栓彈力圖儀的凝固法檢測血小板功能的結(jié)果誤差較大，而且由于成本高，影響了它在臨床上的價(jià)值,現(xiàn)在,由于新的生物化學(xué)合成技術(shù)、分子生物技術(shù)與檢測技術(shù)的更新,所以現(xiàn)在提供一種新的血小板功能的檢測方法,以提高檢測可靠性和降低檢測低成本 ，解決現(xiàn)有檢測技術(shù)中的存在的同題，作為目前更適合臨床應(yīng)用的血小板功能檢測方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺點(diǎn),提供一種檢測結(jié)果可靠穩(wěn)定、準(zhǔn)確率高、成本低、適用臨床推廣的血小板功能檢測方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是設(shè)計(jì)一種血小板功能檢測方法，分析評價(jià)血小板功能，包括以下血小板檢測：

1）血小板活化檢測：在血液樣本中加入血小板激活劑后進(jìn)行檢測，得到血小板被活化后的凝血因子激活檢測值；

2）凝血因子激活檢測：在血液樣本中加入凝血因子激活劑進(jìn)行檢測，得到凝血因子激活后的血小板活化檢測值；

3）血小板抑制檢測：在血液樣本中加入血小板抑制劑進(jìn)行檢測，得到血小板被抑制后的血小板抑制檢測值。

優(yōu)選的，所述血小板激活劑包括二磷酸腺苷、花生四烯酸、瑞思妥霉素、腎上腺素。

優(yōu)選的，所述凝血因子激活劑包括組織因子、高嶺土、鞣花酸、磷脂、氯化鈣。

優(yōu)選的，所述血小板抑制劑包括替羅非班、阿昔單抗。

本發(fā)明適用于血栓彈力圖儀以凝固法進(jìn)行血小板功能測定，通過在被檢血液樣品中分別加入血小板激活劑、血小板抑制劑、血小板激活劑并分別所得到血小板檢測數(shù)值，通過進(jìn)一步的計(jì)算，得到血小板功能檢測結(jié)果。由于本方法采用了血小板抑制劑，其檢測數(shù)值作為血小板功能分析中的本底對照參數(shù)，使檢測結(jié)果更可靠。且與現(xiàn)有的檢測方法相比，本方法不需要使用昂貴的蛇毒血凝酶，使檢測成本降低。本發(fā)明還提供了一種血小板功能檢測試劑盒，適于臨床推廣。

本發(fā)明使用了血小板抑制劑使血小板功能被抑制，檢測時(shí)血液樣本在凝固過程中沒有血小板的促凝作用參與，所以其檢測結(jié)果用于分析血小板功能時(shí)作為空白對照。

現(xiàn)有技術(shù)以血栓彈力圖儀為血小板功能檢測的試劑，在作為檢測血液樣本空白對照時(shí)，為了讓血小板不參與血液的凝固，使用了蛇毒血凝酶，因?yàn)樯叨狙冈跈z測中不活化血小板，其檢測數(shù)值可以作為空白對照。但是使用蛇毒血凝酶的問題是，因?yàn)樯叨狙竷H能部分水解纖維蛋白原變?yōu)槔w維蛋白，其凝固的強(qiáng)度低，使以檢測血液樣本彈力為技術(shù)基礎(chǔ)的血栓彈力圖儀不能很好的得到樣本的凝固狀態(tài)，使檢測結(jié)果不穩(wěn)定。另一方面，蛇毒血凝酶來源少，成本高，易分解，試劑保存困難。而本血小板功能試劑不使用蛇毒血凝酶，使用成本低的材料，例如使用替羅非班，在檢測中抑制血小板的功能，使其不參與凝固的過程，樣本凝固產(chǎn)生時(shí)，所有纖維蛋白原均可以參與凝固，使結(jié)果穩(wěn)定可靠。

本發(fā)明中的試劑檢測可以為多種組合，例如血小板活化檢測試劑，在檢測血小板活化時(shí)可以同時(shí)進(jìn)行二磷酸腺苷、花生四烯酸兩種激活劑的檢測，可以分別得到血小板在不同激活劑下的活化結(jié)果，用于分析針對阿司匹林及氯吡格雷的血小板的藥效反應(yīng)。

本發(fā)明使用了凝血因子激活檢測試劑，用于激活血液樣本中的凝血因子，由于凝血因子在激活劑在作用下被激活，凝血因子活化后所產(chǎn)生的血液凝固的強(qiáng)度可達(dá)到最大值，遠(yuǎn)大于血小板的促凝作用，所以將凝血因子激活檢測數(shù)值作為分析計(jì)算的最大值。

本發(fā)明中血小板功能結(jié)果的計(jì)算：

血小板功能=（凝血因子激活檢測值-血小板活化檢測值/凝血因子激活檢測值-血小板抑制檢測值）×100%。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步描述。以下實(shí)施例僅用于更加清楚地說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而不能以此來限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

在下述具體實(shí)施例中使用的原料、試劑、儀器來源如下:

原料及試劑 廠家

Tris，Hcl，Proclin-300 SIGMA

組織因子、磷脂 SIGMA

替羅非班、阿昔單抗 SIGMA

二磷酸腺苷,花生四烯酸 國藥

瑞思妥霉素、腎上腺素 國藥

高嶺土、鞣花酸、氯化鈣 國藥

儀器：本公司全自動(dòng)血栓彈力圖儀

調(diào)Tris-Hcl緩沖液PH=7.20，緩沖液中加入0.2% Proclin-300。

鞣花酸溶液在上述緩沖液中的濃度為0.1%

替羅非班溶液在上述緩沖液中濃度為0.1%

二磷酸腺苷在上述緩沖液中的濃度為0.5%

檢測時(shí)，按照全自動(dòng)血栓彈力圖儀的操作手冊，將上述試劑放置在儀器的試劑區(qū)，將血液樣本放置在儀器的樣本區(qū)。

下發(fā)檢測任務(wù)，儀器自動(dòng)開始檢測。

儀器將鞣花酸加入血液樣本中，測得凝血因子激活檢測值；

儀器將鞣花酸和替羅非班分別加入到血液樣本中，測得血小板抑制檢測值；

儀器將二磷酸腺苷加入到血液樣本中測得血小板被二磷酸腺苷活化檢測值。

血小板功能的計(jì)算：

血小板功能（二磷酸腺苷）=（凝血因子激活檢測值-血小板活化檢測值/凝血因子激活檢測值-血小板抑制檢測值）×100%

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。