本發(fā)明屬于藥物檢測分析領(lǐng)域，具體涉及一種丹紅注射液體內(nèi)代謝產(chǎn)物鑒定檢測方法。

背景技術(shù)：

丹紅注射液（國藥準字z20026866）是通過現(xiàn)代工藝從丹參（唇形科植物丹參salviamiltiorrhizabunge.的干燥根及根莖）和紅花（菊科植物紅花carthamustinctoriusl.的干燥花）兩味傳統(tǒng)中藥提煉而成的標準化的水溶性成分制劑。丹參和紅花是兩味傳統(tǒng)中藥，常常被合用來治療心腦血管疾病。根據(jù)傳統(tǒng)的中醫(yī)理論，丹參性主寒，紅花性主溫，一升一降，共奏活血化瘀，通經(jīng)活絡之功效。近年來臨床上應用丹紅注射液治療瘀血閉阻所致的胸痹及中風獲得肯定療效，但對其治療缺血性腦病的物質(zhì)基礎(chǔ)仍舊不明確。因此用科學、準確的方法來評估丹紅注射液對腦缺血再灌注損傷的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，了解其的代謝產(chǎn)物和途徑對于丹紅注射液的臨床運用具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種丹紅注射液體內(nèi)代謝產(chǎn)物鑒定檢測方法，具體采用“桿-阱”掃描ida工作模式在一針進樣中同時完成丹紅注射液代謝產(chǎn)物鑒定檢測方法；

本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種丹紅注射液體內(nèi)代謝產(chǎn)物鑒定檢測方法，所述方法包括以下步驟：

(1)取丹紅注射液尾靜脈注射sd大鼠，注射量為10～12mg/kg，在10min～6h各時間點眼眶采血，血樣置肝素化離心管中，離心分離血漿；

(2)血樣處理方法：微量加樣器吸取血漿200μl，加甲醇：乙腈混合液，血漿與混合液體積比1：2.5～3，旋渦混合，離心，取上清作為樣品待測；

(3)采用高效液相色譜-三重四極桿線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜對樣品進行檢測分析，儀器條件如下：

a、液相色譜條件：shimadzuuflcxr

流動相a:h2o(含0.05%fa+5mmnh4fa)

流動相b:ch3oh:ch3cn(1:1)

流速:0.1～0.5ml/min

進樣體積:4～10ul

色譜柱:poroshell120ec-c18

柱溫：40～70℃

梯度洗脫；

b、質(zhì)譜條件:absciexqtrap4500system

掃描模式scanmode：esi,neg/pos

質(zhì)譜模式msmode：ems(100～750)-ida-epi，mrm-ida-epi，prec/nl-ida-epi

增強子離子掃描范圍epirange：m/z80-750

動態(tài)填充時間dynamicfilltime：開啟

動態(tài)背景扣除dbs：開啟

氣簾氣cur：30psi

碰撞氣cad：medium/high

噴霧電壓is：-4500v

離子源溫度tem：550℃

霧化氣gas1：50psi

加熱氣gas2：50psi

(4)qtrap液質(zhì)聯(lián)用儀結(jié)合ida(數(shù)據(jù)依賴性掃描，自動采集ms²)信息相關(guān)掃描方式，ems-ida-epi篩查高含量的有效成分及代謝物，(p)mrm-ida-epi高靈敏度的篩查目標有效成分及預測代謝物，nl/pre-ida-epi篩查具有特征中性丟失和特征子離子的代謝物。(p)mrm-ida-epi是三種掃描方式中靈敏度最高的模式，pmrm=predictivemrm，預測性mrm檢測，pmrm根據(jù)結(jié)構(gòu)類似物或代謝物具有相同的碎片預測mrm。數(shù)據(jù)采集及處理：metabolitepilot?代謝物鑒定軟件；

進一步，所述步驟（1）中，取丹紅注射液尾靜脈注射sd大鼠，注射量為12mg/kg，在10min，30min，60min，6h各時間點眼眶采血，血樣置肝素化離心管中，4000r/min離心分離血漿；

所述步驟（2）中，血樣處理方法：微量加樣器吸取血漿200μl，加甲醇：乙腈（1:9）混合液，血漿與混合液體積比1：3，旋渦混合30s，13000r離心15min，取上清液作為樣品待測；

所述步驟（3）中，流速:0.3ml/min，進樣體積:5ul；

所述步驟（3）中，柱溫：50℃；

所述步驟（3）中：色譜柱:poroshell120ec-c18尺寸規(guī)格150mm×2.1mm，填料粒徑2.7μm；

所述步驟（3）中：梯度洗脫程序：0～2min，流動相b的體積分數(shù)為2%；2～10min，流動相b的體積分數(shù)從2%增加為40%；10～13min，流動相b的體積分數(shù)從40%增加到95%；13～16min，流動相b的體積分數(shù)為95%，16～16.1min，流動相b的體積分數(shù)從95%減少到2%，16.1min～21min，之后，流動相b的體積分數(shù)保持2%；梯度洗脫中，流動相a和流動相b的體積分數(shù)之和為100%；

更具體的，優(yōu)選本發(fā)明方法按以下步驟操作：

(1)取丹紅注射液尾靜脈注射sd大鼠，注射量為12mg/kg，在10min，30min，60min，6h各時間點眼眶采血0.3ml，血樣置肝素化離心管中，4000r/min離心分離血漿；

(2)血樣處理方法：微量加樣器吸取血漿200μl，加甲醇：乙腈（1:9）混合液，血漿與混合液體積比1：3，旋渦混合30s，13000r離心15min，取上清作為樣品待測；

(3)采用高效液相色譜-三重四極桿線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜對樣品進行檢測分析，儀器條件如下：

a、液相色譜條件：shimadzuuflcxr

流動相a:h2o(含0.05%fa+5mmnh4fa)

流動相b:ch3oh:ch3cn(1:1)

流速:0.3ml/min

進樣體積:5ul

色譜柱:poroshell120ec-c18(150×2.1mm,2.7um)

柱溫：50℃

梯度洗脫：0～2min，流動相b的體積分數(shù)為2%；2～10min，流動相b的體積分數(shù)從2%增加為40%；10～13min，流動相b的體積分數(shù)從40%增加到95%；13～16min，流動相b的體積分數(shù)為95%，16～16.1min，流動相b的體積分數(shù)從95%減少到2%，16.1min～21min，之后，流動相b的體積分數(shù)保持2%；梯度洗脫中，流動相a和流動相b的體積分數(shù)之和為100%；

b、質(zhì)譜條件:absciexqtrap4500system

掃描模式scanmode：esi,neg/pos

質(zhì)譜模式msmode：ems(100～750)-ida-epi，mrm-ida-epi，prec/nl-ida-epi

增強子離子掃描范圍epirange：m/z80-750

動態(tài)填充時間dynamicfilltime：開啟

動態(tài)背景扣除dbs：開啟

氣簾氣cur：30psi

碰撞氣cad：medium/high

噴霧電壓is：-4500v

離子源溫度tem：550℃

霧化氣gas1：50psi

加熱氣gas2：50psi

(4)qtrap液質(zhì)聯(lián)用儀結(jié)合ida(數(shù)據(jù)依賴性掃描，自動采集ms²)信息相關(guān)掃描方式，ems-ida-epi篩查高含量的有效成分及代謝物，(p)mrm-ida-epi高靈敏度的篩查目標有效成分及預測代謝物，nl/pre-ida-epi篩查具有特征中性丟失和特征子離子的代謝物。(p)mrm-ida-epi是三種掃描方式中靈敏度最高的模式，pmrm=predictivemrm，預測性mrm檢測，pmrm根據(jù)結(jié)構(gòu)類似物或代謝物具有相同的碎片預測mrm。數(shù)據(jù)采集及處理：metabolitepilot?代謝物鑒定軟件；

本檢測方法發(fā)現(xiàn)注射液中含量較高的有效成分丹參素，原兒茶酸，原兒茶醛，迷迭香酸的ii相代謝物，主要是甲基化，硫酸化，甲基化后硫酸化，葡萄糖醛酸化等一系列代謝物，原型丹參素及迷迭香酸在代謝樣品中未檢測到，隨著給藥時間的推移變化，大部分代謝物在10min及30min達cmax，給藥6h后原藥及代謝物已大部分消除?；趒trap系統(tǒng)獨有的informationdependentacquisition的工作模式，在單針進樣中可同時得到待測物的ms和ms²信息，以最少的樣品量獲得最大量的信息，結(jié)合中藥特定的分子結(jié)構(gòu)在質(zhì)譜中的碎裂規(guī)律，建立多種surveyscan-ida-enhancedproductionscan的方法采集分析數(shù)據(jù)，該檢測方法更快速、更靈敏；

下面將結(jié)合附圖、實施例對本發(fā)明的實施方式作進一步詳細描述。

附圖說明

圖1：丹紅注射液代謝產(chǎn)物列表圖；

圖2：丹參素(danshensu,dss)代謝物提取離子流圖及二級質(zhì)譜圖；

圖3：原兒茶酸(protocatechuicacid,dba)代謝物提取離子流圖及二級質(zhì)譜圖；

圖4：原兒茶醛(protocaterchuicaldehyde,pa)代謝物提取離子流圖及二級質(zhì)譜圖；

圖5：迷迭香酸(rosmarinicacid,ra)代謝物提取離子流圖及二級質(zhì)譜圖；

圖6：丹參素主要代謝物在血漿中的時間變化曲線圖；

圖7：原兒茶酸與其主要代謝物在血漿中的時間變化曲線圖；

圖8：原兒茶醛與其主要代謝物在血漿中的時間變化曲線圖；

圖9：迷迭香酸主要代謝物在血漿中的時間變化曲線圖。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案、積極效果更加清楚明白，通過以下實施例對本發(fā)明進行進一步詳細說明。以下對于具體實施方案的描述僅用于解釋本發(fā)明，并不限定本發(fā)明；

一種丹紅注射液體內(nèi)代謝產(chǎn)物鑒定檢測方法：

一、儀器：qtrap液質(zhì)聯(lián)用儀（質(zhì)譜absciexqtrap4500system，液相shimadzuuflcxr）；

二、樣品準備

丹紅注射液尾靜脈注射sd大鼠，注射量為12mg/kg，在10min，30min，60min，6h各時間點眼眶采血0.3ml，血樣置肝素化離心管中，4000r/min離心分離血漿。微量加樣器吸取血漿200μl，加甲醇：乙腈（1:9）混合液，血漿與混合液體積比1：3，旋渦混合30s，13000r離心15min，取上清作為樣品待測；

三、檢測條件

a、液相色譜條件：shimadzuuflcxr

流動相a:h2o(含0.05%fa+5mmnh4fa)

流動相b:ch3oh:ch3cn(1:1)

流速:0.3ml/min

進樣體積:5ul

色譜柱:poroshell120ec-c18(150×2.1mm,2.7um)

柱溫：50℃

梯度洗脫：0～2min，流動相b的體積分數(shù)為2%；2～10min，流動相b的體積分數(shù)從2%增加為40%；10～13min，流動相b的體積分數(shù)從40%增加到95%；13～16min，流動相b的體積分數(shù)為95%，16～16.1min，流動相b的體積分數(shù)從95%減少到2%，16.1min～21min，之后，流動相b的體積分數(shù)保持2%；梯度洗脫中，流動相a和流動相b的體積分數(shù)之和為100%；

b、質(zhì)譜條件:absciexqtrap4500system

掃描模式scanmode：esi,neg/pos

質(zhì)譜模式msmode：ems(100～750)-ida-epi，mrm-ida-epi，prec/nl-ida-epi

增強子離子掃描范圍epirange：m/z80-750

動態(tài)填充時間dynamicfilltime：開啟

動態(tài)背景扣除dbs：開啟

氣簾氣cur：30psi

碰撞氣cad：medium/high

噴霧電壓is：-4500v

離子源溫度tem：550℃

霧化氣gas1：50psi

加熱氣gas2：50psi

四、分析方法

qtrap液質(zhì)聯(lián)用儀結(jié)合ida(數(shù)據(jù)依賴性掃描，自動采集ms2)信息相關(guān)掃描方式，靈敏度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性與三重四極桿完全一致，同時具有高靈敏度、高掃描速度和多級掃描的定性功能，且還具有獨特的掃描功能，即桿-阱相互關(guān)聯(lián)的掃描，實時動態(tài)背景扣（dbs），一次進樣，可運用實時正負切換數(shù)據(jù)采集，ems-ida-epi、(p)mrm-ida-epi、nl/pre-ida-epi等多種掃描模式，同時結(jié)合智能的代謝物鑒定軟件metabolitepilot?，具有快速鑒定代謝物的獨特功能；

1、ems-ida-epi，mrm-ida-epi，pre/nl-ida-epi等多種掃描模式結(jié)合，發(fā)現(xiàn)丹紅注射液中含量較高的有效成分丹參素，原兒茶酸，原兒茶醛，迷迭香酸的ii相代謝物，主要是甲基化，硫酸化，甲基化后硫酸化，葡萄糖醛酸化等一系列代謝物。丹紅注射液代謝產(chǎn)物列表見圖1所示，原型丹參素及迷迭香酸在代謝樣品中未檢測到；

2、如圖2～5所示，分別是丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛、迷迭香酸(rosmarinicacid,ra)代謝物提取離子流圖及二級質(zhì)譜圖；

3、丹紅注射液四個重要活性成分（丹參素，迷迭香酸，原兒茶醛，原兒茶酸）的代謝物追蹤：分別在10min、30min、60min、6h不同時間點采集的血樣，采用液質(zhì)聯(lián)用儀開展對母藥及各代謝產(chǎn)物開展定量分析，測定不同時間點的血藥濃度，繪制時間變化曲線圖，結(jié)果如圖6～9所示，檢測到的各代謝物含量隨著給藥時間的推移變化，大部分代謝物在10min及30min達cmax，給藥6h后原藥及代謝物已大部分消除；

本說明書中未作詳細描述的內(nèi)容，屬于本專業(yè)技術(shù)人員公知的現(xiàn)有技術(shù)。