本發(fā)明屬于石墨烯生物傳感器領(lǐng)域，特別涉及一種基于多功能納米級(jí)蛋白薄膜的石墨烯腫瘤標(biāo)志物傳感器及其制備方法。

背景技術(shù)：

隨著納米線、碳納米管以及石墨烯等納米材料的出現(xiàn)，通過電學(xué)檢測(cè)方法利用生物自身的電荷可以更加有效地實(shí)現(xiàn)生物分子的檢測(cè)。生物傳感界面中傳感材料的選擇對(duì)于構(gòu)建高靈敏度、價(jià)格合理的生物傳感器具有關(guān)鍵性的作用。二維石墨烯材料具有sp²雜化的碳原子以蜂巢晶格方式排列成單層原子結(jié)構(gòu)。優(yōu)異的機(jī)械、光學(xué)、電學(xué)性能以及高比表面積，這些特點(diǎn)使得石墨烯成為一種理想的生物電子傳感材料?；谑┑纳飩鞲衅髟诘鞍?、dna、納米金以及細(xì)菌等生物分子的檢測(cè)中已經(jīng)有了多樣化的應(yīng)用。

為了能夠保持石墨烯本身優(yōu)異的電學(xué)性能，非共價(jià)的修飾方法通常被用于石墨烯生物傳感器的構(gòu)建中。這些非共價(jià)的交聯(lián)劑通常通過自組裝的方式吸附在石墨烯的表面，但存在吸附量很難控制、容易引入假陽性信號(hào)等問題。

在傳統(tǒng)的石墨烯生物傳感器的構(gòu)建中，器件的制作和界面的修飾通常是兩個(gè)獨(dú)立的部分。而在器件的制作中，光刻、刻蝕以及絕緣層的制作等工藝都會(huì)在石墨烯表面引入表面污染，影響石墨烯的性能與生物探針的修飾，對(duì)石墨烯生物傳感器的構(gòu)建造成不利的影響，因此利用新方法來構(gòu)建生物傳感器具有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種基于多功能納米級(jí)蛋白薄膜的石墨烯腫瘤標(biāo)志物傳感器及其制備方法，該傳感器修飾過程簡(jiǎn)單易于操作，通用性強(qiáng)，可以根據(jù)不同的需求進(jìn)行不同的修飾來實(shí)現(xiàn)不同目標(biāo)分子的高靈敏度和特異性的檢測(cè)，具有良好的應(yīng)用前景。

本發(fā)明的一種基于多功能納米級(jí)蛋白薄膜的石墨烯腫瘤標(biāo)志物傳感器，所述傳感器包括轉(zhuǎn)移至二氧化硅襯底上的石墨烯、多功能納米級(jí)蛋白薄膜以及反應(yīng)腔；其中，多功能納米級(jí)蛋白薄膜非共價(jià)修飾于石墨烯表面；所述多功能納米級(jí)蛋白薄膜為失活bsa蛋白薄膜。

所述失活bsa蛋白薄膜的厚度為9nm-15nm?？梢酝ㄟ^改變修飾的條件實(shí)現(xiàn)對(duì)石墨烯不同類型的摻雜以及不同厚度的修飾，而且利用這種修飾方式可以減小石墨烯對(duì)生物分子的非特異性吸附，以避免假陽性信號(hào)的出現(xiàn)。

所述失活bsa蛋白薄膜的失活溫度為60-90℃，失活時(shí)間為1-3min。

所述失活bsa蛋白薄膜表面偶聯(lián)抗體。

所述抗體通過edc/nhs修飾于失活bsa蛋白薄膜表面。

本發(fā)明的一種基于多功能納米級(jí)蛋白薄膜的石墨烯腫瘤標(biāo)志物傳感器的制備方法，包括：

(1)在二氧化硅襯底上制作鈦金電極，將石墨烯轉(zhuǎn)移至鈦金電極表面；

(2)將bsa溶液滴加在石墨烯的表面進(jìn)行熱失活處理，失活完成后清洗，得到失活bsa蛋白薄膜修飾的石墨烯；

(3)利用光刻定義失活bsa蛋白薄膜修飾的石墨烯的溝道尺寸，利用等離子體進(jìn)行刻蝕，刻蝕完成后用丙酮將溝道表面光刻膠溶解；

(4)將su-8光刻膠旋涂在失活bsa蛋白薄膜修飾的石墨烯溝道表面作為保護(hù)絕緣層；

(5)在失活bsa蛋白薄膜表面偶聯(lián)抗體，偶聯(lián)完成后利用bsa溶液進(jìn)行封閉，將反應(yīng)腔固定在器件的表面，即得。

所述步驟(1)中的石墨烯為單層石墨烯。鈦金電極厚度分別為10nm和100nm。

所述步驟(2)中的bsa溶液的濃度為1％-10％。

所述步驟(3)中的等離子體刻蝕的時(shí)間為4min-8min。

所述步驟(3)中利用失活的bsa蛋白薄膜作為石墨烯的保護(hù)層，步驟(4)中失活的bsa蛋白薄膜作為石墨烯的保護(hù)層避免su-8膠對(duì)石墨烯的影響。

所述步驟(5)中利用edc和nhs作為交聯(lián)劑偶聯(lián)抗體，edc濃度為3mg/ml-6mg/ml，nhs濃度為0.6mg/ml-1.2mg/ml，抗體濃度為1mg/ml-3mg/ml。

所述步驟(5)中的bsa溶液的濃度為1％，封閉時(shí)間為0.5-2小時(shí)。

本發(fā)明利用失活bsa蛋白薄膜既作為石墨烯器件制作工藝過程的保護(hù)層，同時(shí)又作為石墨烯的非共價(jià)交聯(lián)劑偶聯(lián)生物探針，構(gòu)建石墨烯生物傳感器。該傳感器的特點(diǎn)是通過多功能的失活bsa薄膜，可以解決器件在制作過程中引入表面污染的問題，提高器件的性能，并利用edc和sulfo-nhs在失活bsa薄膜表面偶聯(lián)抗體，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分子的高靈敏度和特異性的檢測(cè)。

有益效果

本發(fā)明在石墨烯表面修飾失活bsa蛋白薄膜，不僅可以作為石墨烯器件制作的保護(hù)層，同時(shí)作為石墨烯的非共價(jià)交聯(lián)劑來偶聯(lián)生物探針，通過液柵石墨烯場(chǎng)效應(yīng)管可以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分子的檢測(cè)；修飾過程簡(jiǎn)單易于操作，通用性強(qiáng)，可以根據(jù)不同的需求進(jìn)行不同的修飾來實(shí)現(xiàn)不同目標(biāo)分子的高靈敏度和特異性的檢測(cè)，具有良好的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的結(jié)構(gòu)示意圖；其中，1為硅襯底，2為二氧化硅，3為漏端，4為源端，5為石墨烯，6為失活bsa蛋白薄膜，7和8為su-8光刻膠，9為反應(yīng)腔，10為抗體，11為電解液，12為目標(biāo)分子抗原，13為ag/agcl參比電極；

圖2(a)～(g)為本發(fā)明的制備工藝流程圖；

圖3為本發(fā)明源漏電流的增量隨癌胚抗原(carcinoembryonicantigen,cea)濃度的變化曲線；圖4為本發(fā)明的特異性檢測(cè)曲線。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。

實(shí)施例1

如圖1所示，本實(shí)施例的制備過程如下：

在硅襯底上帶有300nm的二氧化硅，通過剝離(lift-off)工藝在二氧化硅表面制作鈦金電極分別作為漏端和源端，在金電極表面轉(zhuǎn)移單層石墨烯，工藝步驟如圖2(a)所示。將bsa溶液滴加在石墨烯表面，在80℃下失活3min石墨烯表面形成失活的bsa蛋白薄膜，工藝步驟如圖2(b)所示。通過光刻工藝確定石墨烯溝道尺寸并用氧等離子體刻蝕將溝道以外的部分刻蝕掉，工藝步驟如圖2(c)和圖2(d)所示。最后用丙酮將溝道保護(hù)的光刻膠溶解，工藝如圖2(e)所示，旋涂su-8光刻膠作為電極的絕緣保護(hù)層，曝光顯影后留下電極表面的su-8光刻膠，工藝步驟如圖2(f)和2(g)所示。整個(gè)工藝流程中失活bsa蛋白薄膜都作為石墨烯的保護(hù)層來避免表面污染。

基于失活bsa蛋白薄膜修飾的石墨烯器件制作完成后，利用edc和nhs在失活bsa薄膜表面偶聯(lián)cea的抗體(anti-cea)，修飾完成后用1％bsa封閉1小時(shí)，封閉完成后在器件表面固定反應(yīng)腔，加入1μm的磷酸鹽緩沖液作為電解液，采用電化學(xué)的ag/agcl參比電極與電解液一起共同構(gòu)成柵極。通過在石墨烯場(chǎng)效應(yīng)管的源和漏兩端加上固定的電壓vds和以及柵源兩端加上固定的電壓vgs，通過加入不同濃度的目標(biāo)分子cea抗原，通過測(cè)量源漏電流的變化實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分子的檢測(cè)。

具體檢測(cè)抗原的流程如下：

(1)不同濃度抗原的檢測(cè)，在反應(yīng)腔中加入200ul的測(cè)試緩沖液，將anti-cea修飾的石墨烯場(chǎng)效應(yīng)管源極接地，其漏極加上0.1v的電壓，柵極加上-0.3v的電壓，記錄加入不同抗原濃度下源漏電流的增量，如圖3所示。由圖3可知，隨著帶負(fù)電的目標(biāo)分子cea被anti-cea捕獲數(shù)量的增大，石墨烯溝道的電導(dǎo)增大，使得anti-cea修飾的石墨烯場(chǎng)效應(yīng)管源漏電流增大。

(2)特異性的檢測(cè)，測(cè)試條件與(1)中所述相同，在反應(yīng)腔中依次加入2ul的血清稀釋液(cotrol)、鱗狀細(xì)胞癌(squamouscellcarcinoma,scc)、細(xì)胞角蛋白19片段(cytokerantin-19-fragment,cyfra21-1)以及cea抗原，對(duì)gfet源漏兩端之間的電流進(jìn)行實(shí)時(shí)的監(jiān)測(cè)，電流的變化曲線如圖4所示。從結(jié)果可以看出基于失活bsa蛋白薄膜修飾的石墨烯場(chǎng)效應(yīng)管對(duì)目標(biāo)分子cea蛋白的響應(yīng)明顯高于對(duì)照組的響應(yīng)，因此可以確定該器件具有良好的特異性。