本發(fā)明屬于食品安全
技術(shù)領(lǐng)域：
。更具體地，涉及一種新型小分子結(jié)構(gòu)及其在檢測(cè)藍(lán)綠藻肝毒素方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：隨著工業(yè)化、城市化的發(fā)展，大量營(yíng)養(yǎng)物注入水中造成水體富營(yíng)養(yǎng)化，而致使藻類(lèi)迅猛生長(zhǎng)，藻類(lèi)代謝產(chǎn)生包括藍(lán)綠藻肝毒素(微囊藻毒素，節(jié)球藻毒素)在內(nèi)的有毒物質(zhì)，危害著人類(lèi)健康。我國(guó)是世界上藻災(zāi)害最為嚴(yán)重的國(guó)家之一，淡水湖泊中發(fā)生的水華80％是有毒的，而微囊藻毒素分布最廣、毒性最大。微囊藻毒素(microcystins，mcs)主要由淡水藻類(lèi)銅綠微囊藻產(chǎn)生。mcs是一類(lèi)單環(huán)七肽肝毒素，由于多肽中兩種可變氨基酸組成的不同，主要有l(wèi)、r、y、w和f，分別代表亮氨酸、精氨酸、酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸，因而具有多種異構(gòu)體，其中存在最普遍，含量最多的是mc-lr、mc-yr和mc-rr三種，其他還包含mc-wr、mc-la、mc-lw、mc-ly和mc-lf等在內(nèi)的80多種。而adda基團(tuán)(3-氨基-9-甲氧基-2,6,8-三甲基-10-苯基-4,6-二烯酸)是一種特殊的β-氨基酸，是微囊藻毒素類(lèi)物質(zhì)共同擁有的結(jié)構(gòu)，且其為主要表達(dá)毒性的部分。mcs分布最廣泛，它對(duì)蛋白磷酸酶1和蛋白磷酸酶2a具有抑制作用，為腫瘤促進(jìn)劑。1998年世界衛(wèi)生組織(who)的《用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中建議飲用水中mcs標(biāo)準(zhǔn)為1.0μg/l。我國(guó)生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)(gb5749-2006)的頒布，將飲用水中微囊藻毒素含量限制為1μg/l，該標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)施對(duì)水源水的質(zhì)量提出了更高的要求。節(jié)球藻毒素(nodularin，nod)也是一種藍(lán)藻水華腐爛后釋放于水中的毒素之一，主要存在于泡沫節(jié)球藻中。nod為環(huán)狀五肽肝毒素，已分離得到7種節(jié)球藻毒素異構(gòu)體，也都具備adda基團(tuán)，是絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶1(pp1)和蛋白磷酸酶2a(pp2a)的抑制劑，同時(shí)也是腫瘤誘發(fā)擠和促進(jìn)劑，其對(duì)人類(lèi)的危害可見(jiàn)一斑，但目前仍沒(méi)有nod的限量標(biāo)準(zhǔn)，但設(shè)置其限量標(biāo)準(zhǔn)勢(shì)在必行。目前，微囊藻毒素和節(jié)球藻毒素的檢測(cè)方法主要有薄層色譜(thinlayerchromatography，tlc)、高效液相色譜(highperformanceliquidchromatography，hplc)、氣相色譜(gaschromatography,gc)、質(zhì)譜(masssepectrum,ms)以及高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用(highperformanceliquidchromatography-masssepectrum，hplc-ms)等方法。這些方法雖然準(zhǔn)確度高，但其儀器設(shè)備昂貴、樣品前處理復(fù)雜繁瑣、檢測(cè)成本高且需要專(zhuān)業(yè)人員操作。而免疫層析檢測(cè)方法具備快速、靈敏、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，且對(duì)樣品純度要求不高，特別適用于大批量樣品的檢測(cè)。目前已報(bào)道的藍(lán)綠藻肝毒素(多種微囊藻毒素類(lèi)似物和節(jié)球藻毒素)制備的抗體大多使用mc-lr和nod偶聯(lián)蛋白制備抗原、抗體，而其抗體特性也有很大差異，廣譜性也受到免疫原和包被原的限制。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)中缺乏同時(shí)檢測(cè)多種微囊藻毒素結(jié)構(gòu)類(lèi)似物和節(jié)球藻毒素的免疫學(xué)檢測(cè)方法，提供一種近似于共同基團(tuán)adda的新型小分子物質(zhì)，以增加檢測(cè)方法的廣譜識(shí)別性能，制備出靈敏性度高且廣譜性強(qiáng)的半定量藍(lán)綠藻肝毒素免疫層析試紙條，適用于多種微囊藻毒素類(lèi)似物和節(jié)球藻毒素，且具有快速、直觀、易于操作等特點(diǎn)，可作為檢測(cè)主要藍(lán)綠藻肝毒素的有效手段，具有廣闊的發(fā)展前景。本發(fā)明的目的是提供一種新型小分子免疫原結(jié)構(gòu)。本發(fā)明另一目的是提供所述小分子免疫原結(jié)構(gòu)在制備藍(lán)綠藻肝毒素廣譜免疫層析試紙條中的應(yīng)用。本發(fā)明上述目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種新型小分子結(jié)構(gòu)lh-1，其結(jié)構(gòu)式如式(i)所示：該新型小分子結(jié)構(gòu)lh-1采用系統(tǒng)命名法命名為：(2e，4e，6s，7s)-7-甲氧基-4,6-二甲基-8-苯辛基-2,4-二烯酸(即：(2e,4e,6s,7s)-7-methoxy-4,6-dimethyl-8-phenylocta-2,4-dienoicacid)。本發(fā)明首先獲得了一種特殊的新型小分子結(jié)構(gòu)作為免疫原，將該小分子及微囊藻毒素mc-lr分別與載體蛋白偶聯(lián)制得人工抗原，利用將該小分子人工抗原乳化后免疫兔，分離純化兔血清得到免疫制備多克隆抗體，制備抗體標(biāo)記的納米金顆粒，將mc-lr人工抗原包被于硝酸纖維膜上作為檢測(cè)帶，羊抗兔二抗作為控制帶，依據(jù)免疫競(jìng)爭(zhēng)法原理建立得快速檢測(cè)藍(lán)綠藻肝毒素的廣譜性免疫層析試紙條。該免疫層析試紙條靈敏性度高、廣譜性強(qiáng)，可半定量檢測(cè)藍(lán)綠藻肝毒素，適用于多種微囊藻毒素類(lèi)似物和節(jié)球藻毒素，且具有快速、直觀、易于操作等優(yōu)勢(shì)。所述新型小分子結(jié)構(gòu)lh-1的制備方法是使用n-丙?；蚺嫉榱蛲?jīng)過(guò)縮二脲醛醇縮合、反式酰胺化反應(yīng)、烷基化反應(yīng)、還原反應(yīng)、wittig反應(yīng)、還原反應(yīng)、氧化反應(yīng)、wittig反應(yīng)、還原反應(yīng)、氧化反應(yīng)、氧化反應(yīng)共11步反應(yīng)生成新型小分子。具體地，新型小分子結(jié)構(gòu)的制備方法包括以下步驟：將右旋n-丙?；蚺嫉榱蛲苡跓o(wú)水二氯甲烷中，冷卻后依次加入四氯化鈦、n,n-二異丙基乙胺、n-甲基吡咯烷酮和苯乙醛，經(jīng)縮二脲醛醇縮合純化后生成黃色固體狀的醛醇2。將醛醇2溶于無(wú)水二氯甲烷，依次加入n,o-二甲基羥胺鹽酸鹽和咪唑，經(jīng)反式酰胺化反應(yīng)，純化后得黃色油狀物中間體weinreb酰胺。將碘甲烷溶于無(wú)水四氫呋喃中，加入固體碳酸鈉攪拌，將混合物冷卻，脫脂棉過(guò)濾并加入到先前獲得的weinreb酰胺中，之后加入氫化鈉，純化后得到黃色油狀物3。將weinreb酰胺3溶于無(wú)水二氯甲烷中，冷卻后滴加二異丁基氫化鋁的無(wú)水甲苯溶液，純化后過(guò)濾，并真空濃縮得到橙色油狀中間體醛。將新制備的醛溶于無(wú)水甲苯中，加入穩(wěn)定的磷葉立德(1-乙氧基羰基亞乙基)三苯基正膦，回流攪拌過(guò)夜，wittig反應(yīng)純化后得到黃色油狀烯烴4。將烯烴4溶于無(wú)水四氫呋喃中，冷卻后滴加1.0m二異丁基氫化鋁的無(wú)水甲苯溶液攪拌，還原反應(yīng)純化后得淡黃色油狀的烯丙醇。將烯丙醇溶于無(wú)水甲苯中，加入活化的二氧化錳，將所得懸浮液在55℃劇烈攪拌2h，氧化反應(yīng)純化后得到黃色油狀物醛5。將新制備的醛5溶于無(wú)水甲苯中，加入磷葉立德(1-乙氧基羰基亞甲基)三苯基正膦，wittig反應(yīng)純化后得到黃色油狀物酯6。將酯6溶于無(wú)水四氫呋喃中，冷卻后滴加二異丁基氫化鋁的無(wú)水甲苯溶液，還原反應(yīng)純化后得到黃色油狀中間體醇。將醇溶于無(wú)水甲苯中，冷卻加入二氧化錳，氧化反應(yīng)純化后減壓濃縮濾液得到黃色油狀醛7。將醛7溶于二甲基亞砜中，加入1,3,5-三甲氧基苯，次氯酸鈉和磷酸二氫鈉，經(jīng)純化即得新型小分子結(jié)構(gòu)。更優(yōu)選地，所述新型小分子結(jié)構(gòu)物質(zhì)lh-1的制備方法，包括以下步驟：(a)縮二脲醛醇縮合：室溫下，稱(chēng)取26.2g右旋n-丙?；蚺嫉榱蛲?cas：1217320-19-8)溶于250ml無(wú)水二氯甲烷中攪拌，之后在丙酮中用干冰冷卻至-78℃，逐滴向上述溶液中加入12ml四氯化鈦，所得混合物攪拌15min形成鈦絡(luò)合物，再向上述溶液中加入18.9ml蒸餾過(guò)的n,n-二異丙基乙胺，將混合物接著攪拌40min形成相應(yīng)的烯醇化鈦，再加入20.0ml新蒸餾的n-甲基吡咯烷酮，10min后，加入13.4ml新蒸餾的苯乙醛，將上述溶液持續(xù)在-78℃再放置30min后溫?zé)嶂?℃，并在該溫度下再攪拌1h。通過(guò)tlc監(jiān)測(cè)反應(yīng)，展開(kāi)劑為環(huán)己烷-乙酸乙酯(7:3，v/v)，最后加入300ml50％nh4cl水溶液猝滅反應(yīng)。將有機(jī)層用300ml1.0n的hcl和300ml10％na2co3和300ml鹽水洗滌兩次，再用na2so4干燥。得到黃色固體狀的醛醇2。(b)反式酰胺化反應(yīng)：將37.1g醛醇2溶于無(wú)水150ml二氯甲烷中，依次加入14.6gn,o-二甲基羥胺鹽酸鹽和27.2g咪唑，將此混合物在室溫下攪拌12h。通過(guò)tlc監(jiān)測(cè)反應(yīng)，展開(kāi)劑為環(huán)己烷-乙酸乙酯(7:3，v/v)。然后用300ml去離子水將有機(jī)層洗滌3次，再用na2so4干燥，過(guò)濾并真空濃縮。所得殘余物通過(guò)硅膠柱層析純化，稱(chēng)取600g硅膠填柱，以環(huán)己烷和乙酸乙酯(acoet，30-50％)作為流動(dòng)相梯度洗脫，得到黃色油狀物中間體weinreb酰胺。(c)烷基化反應(yīng)：將40.1ml碘甲烷溶于140ml無(wú)水四氫呋喃中，再將此溶液與1.38g固體na2co3混合攪拌10min后冷卻至4℃，通過(guò)脫脂棉過(guò)濾并加入到先前獲得的15.1gweinreb酰胺中，之后，在4℃下向上述溶液中加入2.49g的nah(60％分散在礦物油中)，將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌4h。通過(guò)tlc監(jiān)測(cè)反應(yīng)，展開(kāi)劑為環(huán)己烷-乙酸乙酯(6:4，v/v)。再加入1.24g的nah(60％油溶液)，將反應(yīng)混合物在室溫下再攪拌2h。通過(guò)tlc監(jiān)測(cè)反應(yīng)，展開(kāi)劑為環(huán)己烷-乙酸乙酯(6:4，v/v)。冷卻至4℃后，過(guò)量的nah通過(guò)加入150ml飽和nh4cl去除?；旌衔镉胊coet萃取兩次，有機(jī)層再用250ml鹽水洗滌，之后用na2so4干燥，過(guò)濾并減壓濃縮。用300g硅膠填柱后，用環(huán)己烷-acoet(6:4，v/v)作為流動(dòng)相純化，得到黃色油狀weinreb酰胺3。(d)還原反應(yīng)：將10.71gweinreb酰胺3溶于100ml無(wú)水二氯甲烷中，將所得溶液用在丙酮中的干冰冷卻至-78℃。在80min內(nèi)滴加100ml的1.0m二異丁基氫化鋁的無(wú)水甲苯溶液。通過(guò)tlc監(jiān)測(cè)反應(yīng)，展開(kāi)劑為環(huán)己烷-乙酸乙酯(7:3，v/v)，再依次加入40ml甲醇和40ml飽和nh4cl猝滅反應(yīng)，之后將該溶液升溫至室溫?cái)嚢?0min。然后將混合物通過(guò)545墊，并用300ml苯乙基洗滌，合并有機(jī)相后用200ml2.0nhcl洗滌，再用mgso4干燥，過(guò)濾并真空濃縮得到橙色油狀中間體醛。(e)wittig反應(yīng)：將8.48g新制備的醛溶于275ml無(wú)水甲苯中，加入18.52g磷葉立德(1-乙氧基羰基亞乙基)三苯基正膦，將所得混合物回流反應(yīng)12h。通過(guò)tlc監(jiān)測(cè)反應(yīng)，展開(kāi)劑為環(huán)己烷-乙酸乙酯(8:2，v/v)。將反應(yīng)混合物減壓濃縮，所得殘余物通過(guò)硅膠柱純化，用0-10％acoet的環(huán)己烷溶液作為流動(dòng)相，得到黃色油狀烯烴4。(f)還原反應(yīng)：將7.59g烯烴4溶于55ml無(wú)水四氫呋喃中，并將所得溶液用丙酮中的干冰冷卻至-78℃，在1h內(nèi)向上述溶液滴加68ml1.0m二異丁基氫化鋁的無(wú)水甲苯溶液，在該溫度下攪拌90min，并通過(guò)tlc監(jiān)測(cè)反應(yīng)，展開(kāi)劑為環(huán)己烷-乙酸乙酯(8:2，v/v)，之后依次加入30ml甲醇和30mlnh4cl淬滅反應(yīng)。使所得溶液升溫至室溫30min后將混合物用545墊過(guò)濾并用150ml二氯甲烷洗滌，再將有機(jī)層用200ml1.0nhcl洗滌，合并有機(jī)層并用mgso4干燥，過(guò)濾并真空濃縮，再經(jīng)過(guò)硅膠柱層析純化，以0-20％acoet的環(huán)己烷溶液作為流動(dòng)相梯度洗脫，得到淡黃色油狀的烯丙醇。(g)氧化反應(yīng)：將3.4g烯丙醇溶于100ml無(wú)水甲苯中，將所得溶液冷卻至0℃，再加入13.6gmno2，將所得懸浮液在55℃劇烈攪拌2h。通過(guò)tlc監(jiān)測(cè)反應(yīng)，展開(kāi)劑為環(huán)己烷-乙酸乙酯(8:2，v/v)，將所得溶液用545墊過(guò)濾，并用大量二氯甲烷洗滌。將所得濾液減壓濃縮，得到黃色油狀物醛5。(h)wittig反應(yīng)：將3.39g新制備的醛5溶于80ml無(wú)水甲苯中，加入6.06g磷葉立德(1-乙氧基羰基亞甲基)三苯基正膦，將所得反應(yīng)混合物攪拌并回流過(guò)夜。通過(guò)tlc監(jiān)測(cè)反應(yīng)，展開(kāi)劑為環(huán)己烷-乙酸乙酯(8:2，v/v)。此后，將反應(yīng)混合物用545墊過(guò)濾，用二氯甲烷洗滌并減壓濃縮。所得油狀殘余物通過(guò)硅膠柱純化，以0-20％acoet的環(huán)己烷溶液作為流動(dòng)相梯度洗脫，得到黃色油狀物酯6。(i)還原反應(yīng)：將1.0g酯6溶于12ml無(wú)水四氫呋喃中，并將所得溶液用干冰的丙酮冷卻至-78℃，在15min內(nèi)向上述溶液中逐滴滴加12ml1.0m二異丁基氫化鋁的無(wú)水甲苯溶液，在-78℃下攪拌90min，并通過(guò)tlc監(jiān)測(cè)反應(yīng)，展開(kāi)劑為環(huán)己烷-乙酸乙酯(8:2，v/v)，之后在-78℃下，緩慢加入5ml甲醇和5mlnh4cl淬滅反應(yīng)，然后將溶液溫?zé)嶂潦覝財(cái)嚢?0min。加入50ml1.0nhcl后，用acoet萃取有機(jī)相，并用mgso4干燥，過(guò)濾并在真空下濃縮。所得殘余物通過(guò)硅膠柱純化，以0-20％acoet的環(huán)己烷溶液作為流動(dòng)相梯度洗脫，得到黃色油狀中間體醇。(j)氧化反應(yīng)：將上一步所得醇全部溶于35ml無(wú)水甲苯中，冷卻至4℃。加入4.0gmno2，在50℃下攪拌1h。通過(guò)tlc監(jiān)測(cè)反應(yīng)，展開(kāi)劑為環(huán)己烷-乙酸乙酯(7:3，v/v)，并將懸浮液用545墊過(guò)濾，并用大量二氯甲烷洗滌，減壓濃縮濾液得到黃色油狀醛7。(k)氧化反應(yīng)：將醛7溶于10mldmso中，再加入3.0g1,3,5-三甲氧基苯后攪拌5min，之后將2.0gnaclo2和3.0gnah2po4溶于水中，再將該水溶液逐滴加入到dmso溶液中并持續(xù)攪拌，通過(guò)tlc監(jiān)測(cè)反應(yīng)，展開(kāi)劑為環(huán)己烷-乙酸乙酯(1:1，v/v)，反應(yīng)4h后使用na2s2o3猝滅反應(yīng)并加入5ml1.0nhcl酸化反應(yīng)，通過(guò)acoet萃取有機(jī)相并用水洗滌，再用mgso4干燥，所得殘余物通過(guò)硅膠柱純化，以40％acoet的正己烷溶液(0.1％hoac)作為流動(dòng)相梯度洗脫，減壓濃縮濾液得到黃色油狀羧酸8，經(jīng)tlc純化反應(yīng)，展開(kāi)劑為環(huán)己烷-乙酸乙酯(1:1，v/v)。另外，上述新型小分子結(jié)構(gòu)lh-1在制備藍(lán)綠藻肝毒素檢測(cè)用人工抗原、在制備藍(lán)綠藻肝毒素檢測(cè)用抗體或在制備藍(lán)綠藻肝毒素檢測(cè)產(chǎn)品方面的應(yīng)用，均應(yīng)在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。一種由上述新型小分子結(jié)構(gòu)lh-1與載體蛋白偶聯(lián)制得小分子人工抗原，以及由該人工抗原免疫動(dòng)物獲得的抗體，也均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。優(yōu)選地，所述載體蛋白為鑰孔血藍(lán)蛋白(klh)等。具體是將該小分子人工抗原乳化后免疫兔，分離純化兔血清得到多克隆抗體。作為優(yōu)選的實(shí)施方案，新型小分子結(jié)構(gòu)多克隆抗體的制備方法包括以下步驟：用新型小分子結(jié)構(gòu)偶聯(lián)鑰孔血藍(lán)蛋白(klh)的人工抗原免疫新西蘭大白兔，分別將1mg/ml的人工抗原溶液與等量佐劑混合乳化，初次免疫與弗氏完全佐劑混合乳化后免疫，之后的加強(qiáng)免疫使用免疫原與弗氏不完全佐劑乳化后免疫，共免疫四次，每次間隔3周，每次免疫劑量為0.6ml/只；第四次免疫后第十天采血，采用辛酸-硫酸銨法純化抗體。另外，上述小分子人工抗原或由其制備的藍(lán)綠藻肝毒素檢測(cè)用抗體在制備藍(lán)綠藻肝毒素檢測(cè)產(chǎn)品方面的應(yīng)用，也都在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。一種藍(lán)綠藻肝毒素廣譜免疫層析試紙條，是將上述抗體進(jìn)行金納米顆粒標(biāo)記制得抗體標(biāo)記的納米金顆粒，將微囊藻毒素mc-lr人工抗原(微囊藻毒素mc-lr與載體蛋白偶聯(lián)制得)包被于硝酸纖維膜上作為檢測(cè)帶，羊抗兔二抗作為控制帶，依據(jù)免疫競(jìng)爭(zhēng)法原理建立快速檢測(cè)藍(lán)綠藻肝毒素的廣譜性免疫層析試紙條。具體地，所述藍(lán)綠藻肝毒素廣譜免疫層析試紙條依次包括點(diǎn)樣孔、檢測(cè)帶和控制帶；點(diǎn)樣孔上噴涂新型小分子結(jié)構(gòu)抗體標(biāo)記的膠體金復(fù)合物，檢測(cè)帶為微囊藻毒素mc-lr的蛋白載體的偶聯(lián)物，控制帶上噴涂羊抗兔二抗；試紙的基質(zhì)為硝酸纖維膜。更具體地，所述藍(lán)綠藻肝毒素廣譜免疫層析試紙條由如下方法制備得到：將新型小分子結(jié)構(gòu)抗體標(biāo)記的膠體金復(fù)合物噴涂金標(biāo)墊(噴涂量為50～70μl/cm2，優(yōu)選60μl/cm2)，用7～10mg/ml(優(yōu)選8mg/ml)的mc-lr-ova在硝酸纖維膜(nc膜)上劃線為檢測(cè)線(t線)，用0.1～0.3mg/ml(優(yōu)選為0.2mg/ml)的羊抗兔二抗劃線作為控制線(c線)，將金標(biāo)墊裁剪為4～10mm(優(yōu)選6mm)的寬度，待干燥后組裝試紙條，使用免疫定量讀數(shù)儀度數(shù)。其中，所述mc-lr-ova為微囊藻毒素mc-lr與載體蛋白偶聯(lián)制得的人工抗原。所述新型小分子結(jié)構(gòu)抗體標(biāo)記的膠體金復(fù)合物由如下方法制備得到：將超純水加熱至沸騰，加入0.5～1.5％(優(yōu)選1％)氯金酸，再次加熱至沸騰，加入2～5％(優(yōu)選4％)檸檬酸三鈉，煮沸直至溶液顏色由藍(lán)紫色變?yōu)樽霞t色且不再發(fā)生變化后2～5min；待膠體金溶液冷卻后，向膠體金溶液中加入0.1～0.3mol/ml(優(yōu)選0.2mol/ml)碳酸鉀溶液震蕩，再加入的權(quán)利要求5所述抗體后將混合液靜置反應(yīng)3～8min(優(yōu)選5min)，再加入15～25％(優(yōu)選20％)bsa封閉，6000～10000rpm離心3～8min(優(yōu)選8000rpm離心5min)，溶液濃縮至原體積的85～90％。其中，優(yōu)選地，所述超純水：1％氯金酸：4％檸檬酸三鈉的體積比為400：16：5～8。優(yōu)選地，所述膠體金溶液：碳酸鉀溶液：抗體：bsa的體積比為1ml：1μl：2μl：20μl。另外，上述藍(lán)綠藻肝毒素廣譜免疫層析試紙條在檢測(cè)微囊藻毒素結(jié)構(gòu)類(lèi)似物和/或節(jié)球藻毒素方面的應(yīng)用，也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。優(yōu)選地，所述微囊藻毒素結(jié)構(gòu)類(lèi)似物和/或節(jié)球藻毒素公有九種：mc-yr、mc-lr、mc-wr、nod、mc-la、mc-rr、mc-lw、mc-ly和mc-lf。本發(fā)明具有以下有益效果：(1)本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種新型小分子結(jié)構(gòu)lh-1((2e，4e，6s，7s)-7-甲氧基-4,6-二甲基-8-苯辛基-2,4-二烯酸)的合成方法，該方法簡(jiǎn)單可行，可以用于與載體蛋白偶聯(lián)作為免疫原或包被原增加檢測(cè)方法的廣譜性；(2)本發(fā)明得到的lh-1抗體對(duì)mc-lr進(jìn)行檢測(cè)的ic50為7.0ng/ml，lod為0.1ng/ml，ic20-ic80為0.6-87.8ng/ml，對(duì)mc-lw、mc-yr、mc-lf、mc-wr、nod、mc-la、mc-rr和mc-ly的交叉反應(yīng)率分別為405.7％、164.6％、163.5％、136.6％、129.4％、92.1％、70.1％和37.8％，lod均低于1ng/ml故本法所得新型小分子結(jié)構(gòu)lh-1多克隆抗體靈敏度良高，特異型好，可用于建立藍(lán)綠藻肝毒素免疫層析試紙條；(3)本發(fā)明制得的藍(lán)綠藻肝毒素廣譜性免疫層析試紙條靈敏度高，廣譜性好，可半定量檢測(cè)九種主要微囊藻毒素結(jié)構(gòu)類(lèi)似物和節(jié)球藻毒素，對(duì)其中的mc-yr、mc-lr、mc-wr、nod、mc-la檢測(cè)限可以達(dá)到1ng/ml，mc-rr、mc-lw、mc-ly和mc-lf檢測(cè)限也可達(dá)到2ng/ml，具有廣闊的發(fā)展前景。附圖說(shuō)明圖1.廣譜性免疫層析試紙條制備流程圖。圖2.新型小分子結(jié)構(gòu)lh-1合成過(guò)程示意圖。圖3.新型小分子結(jié)構(gòu)lh-1人工抗原紫外掃描鑒定曲線。圖4.新型小分子結(jié)構(gòu)lh-1抗體間接競(jìng)爭(zhēng)elisa標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖5.廣譜性免疫層析試紙條廣譜性檢測(cè)結(jié)果。圖6.廣譜性免疫層析試紙條基質(zhì)效應(yīng)的影響。具體實(shí)施方式以下結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說(shuō)明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本
技術(shù)領(lǐng)域：
常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。除非特別說(shuō)明，以下實(shí)施例所用試劑和材料均為市購(gòu)。本發(fā)明研究由如下基金支持：國(guó)家自然科學(xué)基金：藻毒素廣譜特異性免疫識(shí)別分子基礎(chǔ)研究(u1301214)；廣東省大學(xué)生科技創(chuàng)新培育專(zhuān)項(xiàng)資金：微囊藻毒素廣譜性快速檢測(cè)膠體金免疫層析試紙條的研制(pdjh2016b0089)。以下實(shí)施例包括新型小分子結(jié)構(gòu)lh-1的合成、人工抗原的合成、新型小分子結(jié)構(gòu)lh-1多克隆抗體的制備、新型小分子結(jié)構(gòu)lh-1抗體的elisa檢測(cè)、藍(lán)綠藻肝毒素廣譜性免疫試紙條的制備，流程如圖1所示。實(shí)施例1新型小分子lh-1結(jié)構(gòu)的合成1、新型小分子結(jié)構(gòu)lh-1的合成新型小分子結(jié)構(gòu)lh-1的合成路線圖如圖2所示，具體反應(yīng)流程如下：(a)縮二脲醛醇縮合：室溫下，稱(chēng)取26.2g右旋n-丙酰基硫偶氮烷硫酮(cas：1217320-19-8)溶于250ml無(wú)水二氯甲烷中攪拌，之后在丙酮中用干冰冷卻至-78℃，逐滴向上述溶液中加入12ml四氯化鈦，所得混合物攪拌15min形成鈦絡(luò)合物，再向上述溶液中加入18.9ml蒸餾過(guò)的n,n-二異丙基乙胺，將混合物接著攪拌40min形成相應(yīng)的烯醇化鈦，再加入20.0ml新蒸餾的n-甲基吡咯烷酮，10min后，加入13.4ml新蒸餾的苯乙醛，將上述溶液持續(xù)在-78℃再放置30min后溫?zé)嶂?℃再攪拌1h。通過(guò)tlc監(jiān)測(cè)反應(yīng)，展開(kāi)劑為環(huán)己烷-乙酸乙酯(7:3，v/v)，最后加入300ml50％nh4cl水溶液猝滅反應(yīng)。將有機(jī)層用300ml1.0n的hcl和300ml10％na2co3和300ml鹽水洗滌兩次，再用na2so4干燥。得到黃色固體狀的醛醇2。(b)反式酰胺化反應(yīng)：將37.1g醛醇2溶于無(wú)水150ml二氯甲烷中，依次加入14.6gn,o-二甲基羥胺鹽酸鹽和27.2g咪唑，將此混合物在室溫下攪拌12h。通過(guò)tlc監(jiān)測(cè)反應(yīng)，展開(kāi)劑為環(huán)己烷-乙酸乙酯(7:3，v/v)。然后用300ml去離子水將有機(jī)層洗滌3次，再用na2so4干燥，過(guò)濾并真空濃縮。所得殘余物通過(guò)硅膠柱層析純化，稱(chēng)取600g硅膠填柱，以環(huán)己烷和乙酸乙酯(acoet，30-50％)作為流動(dòng)相梯度洗脫，得到黃色油狀物中間體weinreb酰胺。(c)烷基化反應(yīng)：將40.1ml碘甲烷溶于140ml無(wú)水四氫呋喃中，再將此溶液與1.38g固體na2co3混合攪拌10min后冷卻至4℃，通過(guò)脫脂棉過(guò)濾并加入到先前獲得的15.1gweinreb酰胺中，之后，在4℃下向上述溶液中加入2.49g的nah(60％分散在礦物油中)，將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌4h。通過(guò)tlc監(jiān)測(cè)反應(yīng)，展開(kāi)劑為環(huán)己烷-乙酸乙酯(6:4，v/v)。再加入1.24g的nah(60％油溶液)，將反應(yīng)混合物在室溫下再攪拌2h。通過(guò)tlc監(jiān)測(cè)反應(yīng)，展開(kāi)劑為環(huán)己烷-乙酸乙酯(6:4，v/v)。冷卻至4℃后，過(guò)量的nah通過(guò)加入150ml飽和nh4cl去除?；旌衔镉胊coet萃取兩次，有機(jī)層再用250ml鹽水洗滌，之后用na2so4干燥，過(guò)濾并減壓濃縮。用300g硅膠填柱后，用環(huán)己烷-acoet(6:4，v/v)作為流動(dòng)相純化，得到黃色油狀weinreb酰胺3。(d)還原反應(yīng)：將10.71gweinreb酰胺3溶于100ml無(wú)水二氯甲烷中，將所得溶液用在丙酮中的干冰冷卻至-78℃。在80min內(nèi)滴加100ml的1.0m二異丁基氫化鋁的無(wú)水甲苯溶液。通過(guò)tlc監(jiān)測(cè)反應(yīng)，展開(kāi)劑為環(huán)己烷-乙酸乙酯(7:3，v/v)，再依次加入40ml甲醇和40ml飽和nh4cl猝滅反應(yīng)，之后將該溶液升溫至室溫?cái)嚢?0min。然后將混合物通過(guò)545墊，并用300ml苯乙基洗滌，合并有機(jī)相后用200ml2.0nhcl洗滌，再用mgso4干燥，過(guò)濾并真空濃縮得到橙色油狀中間體醛。(e)wittig反應(yīng)：將8.48g新制備的醛溶于275ml無(wú)水甲苯中，加入18.52g磷葉立德(1-乙氧基羰基亞乙基)三苯基正膦，將所得混合物回流反應(yīng)12h。通過(guò)tlc監(jiān)測(cè)反應(yīng)，展開(kāi)劑為環(huán)己烷-乙酸乙酯(8:2，v/v)。將反應(yīng)混合物減壓濃縮，所得殘余物通過(guò)硅膠柱純化，用0-10％acoet的環(huán)己烷溶液作為流動(dòng)相，得到黃色油狀烯烴4。(f)還原反應(yīng)：將7.59g烯烴4溶于55ml無(wú)水四氫呋喃中，并將所得溶液用丙酮中的干冰冷卻至-78℃，在1h內(nèi)向上述溶液滴加68ml1.0m二異丁基氫化鋁的無(wú)水甲苯溶液，在該溫度下攪拌90min，并通過(guò)tlc監(jiān)測(cè)反應(yīng)，展開(kāi)劑為環(huán)己烷-乙酸乙酯(8:2，v/v)，之后依次加入30ml甲醇和30mlnh4cl淬滅反應(yīng)。使所得溶液升溫至室溫30min后將混合物用545墊過(guò)濾并用150ml二氯甲烷洗滌，再將有機(jī)層用200ml1.0nhcl洗滌，合并有機(jī)層并用mgso4干燥，過(guò)濾并真空濃縮，再經(jīng)過(guò)硅膠柱層析純化，以0-20％acoet的環(huán)己烷溶液作為流動(dòng)相梯度洗脫，得到淡黃色油狀的烯丙醇。(g)氧化反應(yīng)：將3.4g烯丙醇溶于100ml無(wú)水甲苯中，將所得溶液冷卻至0℃，再加入13.6gmno2，將所得懸浮液在55℃劇烈攪拌2h。通過(guò)tlc監(jiān)測(cè)反應(yīng)，展開(kāi)劑為環(huán)己烷-乙酸乙酯(8:2，v/v)，將所得溶液用545墊過(guò)濾，并用大量二氯甲烷洗滌。將所得濾液減壓濃縮，得到黃色油狀物醛5。(h)wittig反應(yīng)：將3.39g新制備的醛5溶于80ml無(wú)水甲苯中，加入6.06g磷葉立德(1-乙氧基羰基亞甲基)三苯基正膦，將所得反應(yīng)混合物攪拌并回流過(guò)夜。通過(guò)tlc監(jiān)測(cè)反應(yīng)，展開(kāi)劑為環(huán)己烷-乙酸乙酯(8:2，v/v)。此后，將反應(yīng)混合物用545墊過(guò)濾，用二氯甲烷洗滌并減壓濃縮。所得油狀殘余物通過(guò)硅膠柱純化，以0-20％acoet的環(huán)己烷溶液作為流動(dòng)相梯度洗脫，得到黃色油狀物酯6。(i)還原反應(yīng)：將1.0g酯6溶于12ml無(wú)水四氫呋喃中，并將所得溶液用干冰的丙酮冷卻至-78℃，在15min內(nèi)向上述溶液中逐滴滴加12ml1.0m二異丁基氫化鋁的無(wú)水甲苯溶液，在-78℃下攪拌90min，并通過(guò)tlc監(jiān)測(cè)反應(yīng)，展開(kāi)劑為環(huán)己烷-乙酸乙酯(8:2，v/v)，之后在-78℃下，緩慢加入5ml甲醇和5mlnh4cl淬滅反應(yīng)，然后將溶液溫?zé)嶂潦覝財(cái)嚢?0min。加入50ml1.0nhcl后，用acoet萃取有機(jī)相，并用mgso4干燥，過(guò)濾并在真空下濃縮。所得殘余物通過(guò)硅膠柱純化，以0-20％acoet的環(huán)己烷溶液作為流動(dòng)相梯度洗脫，得到黃色油狀中間體醇。(j)氧化反應(yīng)：將上一步所得醇全部溶于35ml無(wú)水甲苯中，冷卻至4℃。加入4.0gmno2，在50℃下攪拌1h。通過(guò)tlc監(jiān)測(cè)反應(yīng)，展開(kāi)劑為環(huán)己烷-乙酸乙酯(7:3，v/v)，并將懸浮液用545墊過(guò)濾，并用大量二氯甲烷洗滌，減壓濃縮濾液得到黃色油狀醛7。(k)氧化反應(yīng)：將醛7溶于10mldmso中，再加入3.0g1,3,5-三甲氧基苯后攪拌5min，之后將2.0gnaclo2和3.0gnah2po4溶于水中，再將該水溶液逐滴加入到dmso溶液中并持續(xù)攪拌，通過(guò)tlc監(jiān)測(cè)反應(yīng)，展開(kāi)劑為環(huán)己烷-乙酸乙酯(1:1，v/v)，反應(yīng)4h后使用na2s2o3猝滅反應(yīng)并加入5ml1.0nhcl酸化反應(yīng)，通過(guò)acoet萃取有機(jī)相并用水洗滌，再用mgso4干燥，所得殘余物通過(guò)硅膠柱純化，以40％acoet的正己烷溶液(0.1％hoac)作為流動(dòng)相梯度洗脫，減壓濃縮濾液得到黃色油狀羧酸8，經(jīng)tlc純化反應(yīng)，展開(kāi)劑為環(huán)己烷-乙酸乙酯(1:1，v/v)。2、鑒定：取新型小分子結(jié)構(gòu)lh-1進(jìn)行氫譜核磁、碳譜核磁和質(zhì)譜鑒定。氫譜核磁結(jié)果如下：1h-nmr(400mhz，cdcl3)δh7.41(1h，d，j＝10.4hz，h-2)，7.28(2h，dd，j＝8.8hz，j＝2.8hz，h-3’,5’)，7.17-7.22(3h，m，h-2’,4’,6’)，5.88(1h，d，j＝6.4hz，h-5)，5.81(1h，d，j＝10.4hz，h-3)，3.27(3h，s，c7-och3)，3.22-3.26(1h，m，h-7)，2.80(1h，dd，j＝9.2hz，j＝3.2hz，h-8a)，2.72(1h，dd，j＝9.2hz，j＝4.8hz，h-8b)，2.63-2.68(1h，m，h-6)，1.68(3h，s，c4-ch3)，1.07(3h，d，j＝4.4hz，c6-ch3)。碳譜核磁結(jié)果如下：13c-nmr(100mhz，cdcl3)δc172.9(c-1)，152.0(c-3)，145.7(c-1’)，138.9(c-5)，132.5(c-4)，129.4(c-3’,5’)，128.3(c-2’,6’)，126.2(c-4’)，115.3(c-2)，86.4(c-7)，58.7(c7-och3)，38.1(c-8)，37.1(c-6)，15.6(c4-ch3)，12.3(c6-ch3)質(zhì)譜結(jié)果如下：esi-ms：m/z[m-h]-243.2(c17h21o3)。兩者結(jié)果皆表明合成結(jié)果正確且成功，成功合成得到新型小分子結(jié)構(gòu)lh-1。實(shí)施例2人工抗原的合成1、人工抗原的合成(1)準(zhǔn)確稱(chēng)取2mglh-1，1mgnhs和1mgedc溶解于500μldmf中，室溫下避光過(guò)夜攪拌，未見(jiàn)沉淀出現(xiàn)；(2)8mg鑰孔血藍(lán)蛋白(klh)加入到500μl的碳酸緩沖液(0.1mol/l，ph9.6)中；(3)將lh-1溶液緩慢逐滴加入klh溶液中，室溫下避光攪拌3h；(4)用磷酸鹽緩沖液透析兩天，每天4次，透析結(jié)束后得lh-1人工抗原。(5)mc-lr與卵清蛋白(ova)的偶聯(lián)方法同上。碳酸鹽溶液(0.1m，ph9.6)：稱(chēng)量1.59gna2co3和2.93gnahco3，用去離子水定容1000ml。磷酸鹽緩沖液(0.01m，ph7.4)：na2hpo4·12h2o2.90g，nacl8.50g，kcl0.20g，kh2po40.20g，加去離子水定容至1000ml。2、鑒定取人工抗原進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果如圖3所示。lh-1、klh和人工抗原分別進(jìn)行紫外(200～400nm)掃描鑒定，并通過(guò)比較偶聯(lián)前后的各物質(zhì)的最高吸光值，發(fā)現(xiàn)人工抗原的吸收曲線與載體蛋白明顯不同，klh僅在280nm處有特征峰，lh-1在300nm處有特征峰，而偶聯(lián)反應(yīng)后，lh-1-klh在290nm處出現(xiàn)特征峰，對(duì)比三者曲線可看出發(fā)生顯著位移，故說(shuō)明反應(yīng)產(chǎn)物是載體蛋白與lh-1的復(fù)合物，偶聯(lián)成功。實(shí)施例3新型小分子結(jié)構(gòu)lh-1多克隆抗體的制備及純化1、新型小分子結(jié)構(gòu)lh-1抗體制備用lh-1-klh免疫新西蘭大白兔，將1mg/ml的人工抗原溶液與等量佐劑混合乳化，初次免疫與弗氏完全佐劑混合乳化后免疫，之后的加強(qiáng)免疫使用免疫原與弗氏不完全佐劑乳化后免疫，共免疫四次，每次間隔3周，每次免疫劑量為0.6ml/只，第四次免疫后第十天采血。2、新型小分子結(jié)構(gòu)lh-1多克隆抗體純化(辛酸-硫酸銨法)：(1)取兔血清，在4℃條件下，12000r/min離心15min，去除沉淀；(2)取1體積的兔血清與2體積的醋酸鹽緩沖液混合(ph4.8)，室溫?cái)嚢柘拢鸬渭尤胝了?，使用量?5μl正辛酸/ml兔血清；(3)室溫?cái)嚢杌旌?0min，4℃靜止2h使其充分沉淀；(4)4℃條件下，12000r/min離心15min，去除沉淀；(5)上清經(jīng)砂芯漏斗或125μm尼龍網(wǎng)過(guò)濾后，加入1/10體積的pbs緩沖液(0.1m，ph7.4)，用2m的氫氧化鈉調(diào)ph至7.4，計(jì)算總?cè)芤后w積；(6)冰浴下于30min內(nèi)加入0.277g/ml的硫酸銨，使其成為45％飽和溶液；(7)4℃靜止1h以上后，4℃條件下，12000r/min離心15min，棄上清；(8)沉淀用pbs緩沖液(0.1m，ph7.4)溶解并透析三天。實(shí)施例4新型小分子結(jié)構(gòu)lh-1抗體的elisa檢測(cè)1、elisa檢測(cè)流程(1)將mc-lr-ova人工抗原用包被液稀釋至0.5μg/ml的濃度，包被96孔酶標(biāo)板，每孔加入100μl，37℃溫育過(guò)夜；(2)棄去包被液，洗滌2次；(3)每孔加入120μl封閉液(5％脫脂奶粉)，37℃封閉30min；(4)棄去封閉液，拍板，37℃烘干備用；(5)用pbst1:8000倍稀釋新型小分子結(jié)構(gòu)lh-1抗體，并將微囊藻毒素mc-lr稀釋至1000，100，10，1，0.1，0.01，0.001ng/ml；(6)每行加50μlmc-lr稀釋液(三組平行)，再加50μl抗體稀釋液/孔，在37℃溫育40min，洗滌5次；(7)加入羊抗兔二抗-hrp(4000倍稀釋)，37℃溫育30min，洗滌5次，拍板；(8)加入顯色液顯色10min；(9)加入50μl10％h2so4終止反應(yīng)，并在450nm處讀取od值；(10)將mc-lr換成mc-rr、mc-yr、mc-lw、mc-lf、mc-la、mc-ly、mc-wr和nod八種藥物分別檢測(cè)，使用ic50的比值計(jì)算交叉反應(yīng)率。2、檢測(cè)結(jié)果lh-1-klh免疫所得抗體間接競(jìng)爭(zhēng)elisa標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示。對(duì)mc-lr的識(shí)別性能良好，其ic50為7.0ng/ml，lod為0.1ng/ml，ic20-ic80為0.6-87.8ng/ml，對(duì)mc-lw、mc-yr、mc-lf、mc-wr、nod、mc-la、mc-rr和mc-ly的交叉反應(yīng)率分別為405.7％、164.6％、163.5％、136.6％、129.4％、92.1％、70.1％和37.8％，lod均低于1ng/ml故本法所得新型小分子結(jié)構(gòu)lh-1多克隆抗體靈敏度良高，特異型好，可用于建立藍(lán)綠藻肝毒素免疫層析試紙條。實(shí)施例5藍(lán)綠藻肝毒素廣譜性免疫試紙條的制備1、膠體金的制備將400ml超純水加熱至沸騰，加入16ml的1％氯金酸，再次加熱至沸騰，加入5～8ml的4％檸檬酸三鈉，煮沸直至溶液顏色由藍(lán)紫色變?yōu)樽霞t色且不再發(fā)生變化后2～5min，帶膠體金溶液冷卻后備用，所得金顆粒大小均一。2、新型小分子結(jié)構(gòu)lh-1多抗膠體金的標(biāo)記向1ml膠體金中分別加入1μl的0.2mol/ml碳酸鉀溶液震蕩，再加入2μl的多抗，將混合液靜置反應(yīng)5min，再加入20μl的20％bsa封閉，8000rpm離心5min，濃縮至900μl，噴涂金標(biāo)墊(60μl/cm2)。3、樣品墊液的確定用6mg/ml的mc-lr-ova在硝酸纖維膜(nc)上劃線為檢測(cè)線(t線)，用0.2mg/ml的羊抗兔二抗劃線作為控制線(c線)，將金標(biāo)墊裁剪為6mm的寬度，待干燥后組裝試紙條，用5‰caseinna+1‰、2‰、3‰、4‰吐溫+曲拉通10mmolpbs溶液做樣品液，點(diǎn)樣孔上分別滴加60μl的樣品液，每隔5min使用免疫定量讀數(shù)儀度數(shù)。結(jié)果如表1。表1時(shí)間1‰吐溫+曲拉通2‰吐溫+曲拉通3‰吐溫+曲拉通4‰吐溫+曲拉通5min6147.240.344.910min88.37072.857.115min117.789.1113.386.620min128106149.9115.8可得出使用5‰caseinna+1‰吐溫+曲拉通10mmolpbs溶液做樣品液時(shí)，顯色最快且顏色最深。4、mc-lr-ova包被量的確定用1、4、6、8mg/ml的mc-lr-ova在nc膜上劃線為檢測(cè)線(t線)，用0.2mg/ml的羊抗兔二抗劃線作為控制線(c線)，將金標(biāo)墊裁剪為6mm的寬度，待干燥后組裝試紙條，用5‰caseinna+1‰吐溫+曲拉通10mmolpbs溶液涂樣品墊，使用蒸餾水為陰性樣品，稀釋成1ng/ml的微囊藻毒素mc-lr作為陽(yáng)性樣品，點(diǎn)樣時(shí)，每孔分別滴加60μl，每隔5min使用免疫定量讀數(shù)儀度數(shù)。結(jié)果如表2。表2可得出使用8mg/mlmc-lr-ova溶液包被于nc膜上時(shí)，顯色最快且顏色最深，且陰陽(yáng)性數(shù)值差最明顯，且可看出在15min后反應(yīng)趨于平衡，數(shù)值變化不明顯，故于15min時(shí)度數(shù)。5、試紙條靈敏度及廣譜性的檢測(cè)使用上述實(shí)施例中確定的條件噴涂nc膜、金標(biāo)墊和樣品墊，組裝試紙條，將試紙條裁成3.5nm寬度，使用蒸餾水為陰性樣品，將mc-lr、mc-yr、mc-rr、mc-wr、mc-la、mc-lw、mc-ly、mc-lf和don分別稀釋成8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625ng/ml作為陽(yáng)性樣品進(jìn)行檢測(cè)，點(diǎn)樣時(shí)，每孔分別滴加60μl，每隔5min使用免疫定量讀數(shù)儀度數(shù)，每組重復(fù)三次，結(jié)果如圖5所示。制得的藍(lán)綠藻肝毒素廣譜性免疫層析試紙條靈敏度高，廣譜性好，可半定量檢測(cè)九種主要藍(lán)綠藻肝毒素，對(duì)其中的mc-yr、mc-lr、mc-wr、nod、mc-la檢測(cè)限可以達(dá)到1ng/ml，mc-rr、mc-lw、mc-ly和mc-lf檢測(cè)限也可達(dá)到2ng/ml，具有廣闊的發(fā)展前景。6、試紙條基質(zhì)效應(yīng)的檢測(cè)使用上述實(shí)施例中確定的條件噴涂nc膜、金標(biāo)墊和樣品墊，組裝試紙條，將試紙條裁成3.5nm寬度，分別用蒸餾水和湖水分別將mc-lr稀釋成8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625，0ng/ml，點(diǎn)樣時(shí)，每孔分別滴加60μl，每隔5min使用免疫定量讀數(shù)儀度數(shù)，每組重復(fù)三次，結(jié)果如圖6所示，即本技術(shù)所述試紙條在檢測(cè)湖水時(shí)，檢測(cè)限仍可以達(dá)到1ng/ml，故該免疫層析試紙條可對(duì)經(jīng)過(guò)濾后的湖水樣品進(jìn)行檢測(cè)。當(dāng)前第1頁(yè)12