本發(fā)明屬于農(nóng)藥殘留檢測領(lǐng)域，特別涉及一種植物源性飼料多抗霉素的檢測方法。
背景技術(shù)：
：近年來，隨著高毒高殘留的化學(xué)農(nóng)藥的禁用，綠色環(huán)保低毒低殘留的生物農(nóng)藥越來越受到農(nóng)民的青睞。其中多抗霉素具有抑制病菌產(chǎn)孢和病斑擴(kuò)大的作用，廣泛應(yīng)用于防治黃瓜霜霉病，小麥白粉病，玉米黑穗病，人參黑斑病，蘋果和梨灰斑病以及水稻紋枯病等多種病害。但是目前多抗霉素對人畜的毒性研究相對滯后，毒理作用情況尚不明確。而被多抗霉素污染的水稻、玉米和小麥等作物作為飼料，被豬、牛和羊等食用，會蓄積在體內(nèi)，通過食物鏈進(jìn)入到人體內(nèi)，會造成一定的危害。目前多抗霉素測定方法有微生物法、毛細(xì)管電泳-電致化學(xué)發(fā)光法和高效液相色譜法，國內(nèi)目前采用較多的是毛細(xì)管電泳-電致化學(xué)發(fā)光法和高效液相色譜法。而這些測定方法是用來測定發(fā)酵產(chǎn)生的一系列的多抗霉素代謝物，靈敏度低，耗時長，精密度差。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種植物源性飼料多抗霉素的檢測方法，該方法通過采用材料的前處理、提取和凈化、定性分析測定、定量測定和結(jié)果計(jì)算驗(yàn)證等步驟對植物源飼料中是否含有多抗霉素進(jìn)行檢測，具有鑒定準(zhǔn)確性高、定位準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，在我國多抗霉素的檢測中具有代表性，具有良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明的一種植物源性飼料多抗霉素的檢測方法，包括：(1)取植物源性飼料樣品，磨碎、過篩；然后(按質(zhì)量體積比2.5g:20ml)加入甲酸乙腈溶液，混勻，超聲波提取、離心、吹干，再用氨水溶液溶解，得到待凈化樣品；(2)將萃取柱依次用乙腈、水預(yù)淋洗后，將上述待凈化樣品轉(zhuǎn)入萃取柱中，棄去上樣液，用冰乙酸乙腈水溶液洗脫，收集洗脫液，吹干，定容；(3)采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行定性分析和定量測定，最后通過計(jì)算確定樣品中多抗霉素的含量。所述步驟(1)中的甲酸乙腈溶液的濃度為3％(甲酸：乙腈＝3:97)-8％(甲酸：乙腈＝8:92)；氨水溶液的濃度為1％(氨水：水＝1:99)-3％(氨水：水＝3:97)。所述步驟(1)中的離心速度為5000r/min，離心時間為3-7min。所述步驟(2)中的冰乙酸乙腈溶液的濃度為5％(冰乙酸：乙腈＝5:95)-9％(冰乙酸：乙腈＝9:91)。所述步驟(2)中的萃取柱為max固相萃取柱。所述步驟(3)中定性分析時樣品中待測物質(zhì)保留時間與標(biāo)準(zhǔn)溶液保留時間的偏差不超過標(biāo)準(zhǔn)溶液保留時間的±3％。所述步驟(3)中定量測定采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并保證測試樣品中多抗霉素的響應(yīng)值在儀器的線性范圍內(nèi)。所述步驟(3)中的計(jì)算公式如下：式中：c：樣品中對應(yīng)的多抗霉素的濃度，單位為μg/ml；v：定容體積，單位為ml；f：稀釋倍數(shù)；m：試樣質(zhì)量，單位為g。在重復(fù)條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的15％。有益效果本發(fā)明通過采用材料的前處理、提取和凈化、定性分析測定、定量測定和結(jié)果計(jì)算驗(yàn)證等步驟對植物源飼料中是否含有多抗霉素進(jìn)行檢測，具有鑒定準(zhǔn)確性高、定位準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，在我國多抗霉素的檢測中具有代表性，具有良好的應(yīng)用前景。附圖說明圖1為0.1mg/l多抗霉素色譜圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實(shí)施例1取河北、山東、福建等地植物源性飼料：(1)材料的前處理；取有代表性飼料樣品500g，四分法縮減至少100g，磨碎，過0.9mm孔徑樣品篩，混勻裝入密閉容器中，避光低溫保存?zhèn)溆茫?2)提取和凈化提?。悍Q取2.5g試樣，置入50.0ml離心管中，加入20ml4％甲酸乙腈溶液，渦旋混勻1min，置于超聲波提取30min，然后5000r/min離心5min，取8ml上清液，在50℃下氮?dú)鈨x吹至近干，用1ml的2.5％氨水溶液溶解提取的樣品并渦旋30s，待凈化；凈化：將混合陽離子固相萃取柱依次用3.0ml乙腈、水預(yù)淋洗后，將上述待凈化樣品轉(zhuǎn)入柱中，棄去上樣液，用10ml6％冰乙酸乙腈水溶液洗脫，收集洗脫液于20ml玻璃試管中，再用氮?dú)鈨x吹干，用1ml乙腈水溶液定容，待測。(3)定性分析測定：采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定：色譜和質(zhì)譜條件：色譜柱：hypersilgoldamino柱，30mm×3.0mm(i.d.)，1.9μm或相當(dāng)規(guī)格色譜柱；流動相及梯度洗脫條件見表1：表1流動相及梯度洗脫條件時間/min流速/(ml/min)流動相a(1％甲酸)/％流動相b(甲醇)/％00.2515850.50.2515851.00.2550504.00.2550505.00.2515856.00.251585柱溫：40℃；進(jìn)樣體積：5μl；離子源：esi；掃描方式：負(fù)離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測；電噴霧電壓：4500v；霧化氣流速：15.0l/min；干燥氣流速：3.0l/min；加熱模塊溫度：400℃；dl管溫度：250℃。電離模式、定性離子對、定量離子對、保留時間及碰撞能量參考值見表2：表2電離模式、定性離子對、定量離子對、保留時間及碰撞能量參考值在相同實(shí)驗(yàn)條件下，樣品中待測物質(zhì)保留時間與標(biāo)準(zhǔn)溶液保留時間的偏差不超過標(biāo)準(zhǔn)溶液保留時間的±3％，且樣品中各組分的定性離子的相對豐度與質(zhì)量濃度接近的標(biāo)準(zhǔn)溶液中對應(yīng)的定性離子的相對豐度進(jìn)行比較，偏差不超過表3規(guī)定的范圍，則可判定樣品中存在對應(yīng)的待測物。表3定性確證時相對離子豐度的最大允許偏差(％)相對離子豐度＞5020～5010～20<10允許的相對偏差±20±25±30±50(4)定量測定本標(biāo)準(zhǔn)中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜采用外標(biāo)-標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量測定。為減少基質(zhì)對定量測定的影響，定量用標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并保證測試樣品中多抗霉素的響應(yīng)值在儀器的線性范圍內(nèi)。上述色譜和質(zhì)譜條件下，多抗霉素的標(biāo)準(zhǔn)溶液的多反應(yīng)監(jiān)測圖譜見圖1。(5)結(jié)果計(jì)算驗(yàn)證試樣中多抗霉素的含量(x)以質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示(mg/kg)，用下面公式計(jì)算：式中：c：試樣液中對應(yīng)的多抗霉素b的濃度，單位為微克每毫升(μg/ml)；v：定容體積，單位為毫升(ml)；f：稀釋倍數(shù)；m：試樣質(zhì)量，單位為克(g)。在重復(fù)條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的15％。經(jīng)上述步驟(1)～(5)的檢測，確定所檢測植物源飼料中多抗霉素含量。結(jié)果如下：當(dāng)前第1頁12