苯酚和對苯二酚標準物質(zhì)的純度值和不確定度的測定方法與流程
本發(fā)明涉及化妝品檢測領域，尤其是一種用于檢測祛斑類化妝品和香波中酚類化合物的純度標準物質(zhì)研制方法，酚類化合物主要指苯酚和對苯二酚。
背景技術(shù)：
化妝品中添加劑的準確檢測對化妝品的安全性至關(guān)重要，由于苯酚和對苯二酚是化妝品中禁用物質(zhì)，因此對于該種痕量添加劑的準確檢測的難度大大增加。目前，化妝品中添加劑類的定量檢測大多采用直接檢測法，但是，在實際應用過程中，對于同一樣品，不同檢測機構(gòu)提供的檢測結(jié)果不盡相同，甚至差異較大。與標準化合物相比，化妝品中添加劑類標準物質(zhì)不但具有準確計量的或嚴格定義的標準量值，還能保證特性量值在特定時間期限和貯存條件下保持在規(guī)定范圍內(nèi)的能力，具有量值溯源性，對提高化妝品生產(chǎn)、質(zhì)量控制、檢驗的檢測水平以及添加劑類物質(zhì)分析方法的評價和確認具有重要意義。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為了解決背景技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的提出了一種苯酚和對苯二酚標準物質(zhì)的純度值和不確定度的測定方法，能夠準確測定苯酚和對苯二酚純度值，并建立針對該純度值的定值進行不確定度評價。
本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
步驟1：對原料進行篩查，使得純度合格并進行下一步驟，合格后的產(chǎn)品作為待測樣品進行下一步驟；
步驟2：采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和傅里葉變換紅外光譜法聯(lián)合對待測樣品進行定性確證；
步驟3：采用基于氣相色譜(gc)法、高效液相色譜(hplc)法和差示掃描量熱(dsc)法三種不同原理的方法聯(lián)合對待測樣品進行純度測定；
步驟4：將待測樣品進行分裝后，再進行均勻性和穩(wěn)定性檢驗；
所述的穩(wěn)定性包括短期穩(wěn)定性和長期穩(wěn)定性。
步驟5：根據(jù)步驟3計算得到純度測定引起的不確定度，根據(jù)步驟4計算得到均勻性和穩(wěn)定性引起的不確定度，將各個不確定度進行合成獲得總不確定度。
所述步驟1：原料篩查具體為：
先將工業(yè)原料采用hplc法(見步驟3-1.2)進行純度初檢，判斷純度值是否合格，純度值不低于99％則認為合格進行下一步驟，不合格則進行重結(jié)晶處理，直至純度合格。此時的產(chǎn)品作為待測樣品進行下一步驟。
所述純度值合格是指純度不低于99％。
所述的原料為苯酚或者對苯二酚。本發(fā)明方法針對研制包括苯酚純度標準物質(zhì)和對苯二酚純度標準物質(zhì)。
所述步驟2：定性確證具體為：
將待測樣品分別制成供試品溶液和固體壓片后，再分別采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gc-ms)法和傅立葉變換紅外光譜(ft-ir)法采集得到質(zhì)譜圖和紅外光譜圖，質(zhì)譜圖和紅外光譜圖與標準譜圖對照，根據(jù)匹配度定性確證原料的真實性，若原料真實則進行下一步驟。
所述步驟2中將純度初檢合格后的待測樣品制成供試品溶液和固體壓片具體是：針對待測樣品，一方面溶于純甲醇制成供試品溶液，另一方面采用溴化鉀(kbr)固體壓片法混合研磨并用模具壓制成固體薄片。
所述步驟2中采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gc-ms)法采集得到質(zhì)譜圖具體是：
將供試品溶液進樣到色譜柱中，設置進樣口溫度為250℃，傳輸線溫度為280℃，載氣流速為1ml/min，進樣量為10μl，分流比為10:1，再采用兩階梯逐步升溫方式，質(zhì)譜部分均采用全掃描模式，掃描范圍為12-500m/z，溶劑延遲時間為3min，采集到質(zhì)譜圖。
對于苯酚的供試品溶液，色譜柱升溫操作為：采用初始溫度60℃，保持1min后，以15℃/min的速率升溫至270℃，保持10min。
對于對苯二酚原料，色譜柱升溫操作為：采用初始溫度60℃，以10℃/min的速率升溫至110℃，保持0.5min后，再以10℃/min的速率升溫至180℃，保持3min。
所述步驟2中采用傅立葉變換紅外光譜(ft-ir)法采集得到紅外光譜圖具體是：將固體壓片后的樣品上架采用dtgskbr檢測器和kbr分束器測試，采樣增益設置為1.0，紅外光譜掃描范圍為4000～400cm-1，樣品掃描8次，背景掃描8次，取分辨率為4.000cm-1，從而獲得紅外光譜圖。
所述步驟3：純度測定具體為：
3-1：針對待測樣品，制成供試品溶液后，聯(lián)合測定獲得兩組純度值數(shù)據(jù)，兩組純度值數(shù)據(jù)均具有進行多次測定獲得的數(shù)據(jù)；
本發(fā)明處理過程中，gc法和hplc法是基于質(zhì)量平衡法(簡寫作“mb”)原理實現(xiàn)的，還需要對如溶劑殘留、水分和灰分不響應的雜質(zhì)再分別用頂空-gc法、卡爾費休庫倫法和熱重分析法測定。
3-2：針對待測樣品，采用差示掃描量熱(dsc)法測定純度值，獲得一組純度值數(shù)據(jù)，該組純度值數(shù)據(jù)具有進行多次測定獲得的數(shù)據(jù)；
3-3：對于每個待測樣品，重復步驟3-1和步驟3-2進行測量，將獲得三組純度值數(shù)據(jù)，進行數(shù)據(jù)處理獲得待測樣品的最終純度值。
所述步驟3-1具體為：
3-1.1：采用gc法采集色譜圖，將色譜圖用面積歸一化法計算得到待測樣品的初始純度值igc；
3-1.2：用hplc法采集色譜圖，將色譜圖用面積歸一化法計算得到待測樣品的初始純度值ihplc；
3-1.3：分別采用靜態(tài)頂空進樣-gc-氫火焰離子化(fid)檢測器、卡爾費休庫侖儀和熱重分析儀對待測樣品進行測定，分別獲得殘留溶劑的百分比含量isolv、水分的百分比含量imoi、灰分的百分比含量iash(三種雜質(zhì)的百分比含量)；
3-1.4：根據(jù)步驟3-1.1和3-1.2獲得的兩個初始純度值，分別經(jīng)步驟3-1.3獲得的雜質(zhì)百分比含量計算獲得gc法和hplc法分別對應的兩個修正純度值i’gc和i’hplc；
3-1.5：重復步驟3-1.1～3-1.4進行多次測量獲得兩組純度值數(shù)據(jù)。
所述步驟3-1.1具體為：
本發(fā)明優(yōu)化后的gc法測試過程如下：將供試品溶液進樣到弱極性色譜柱db-1701(30m×0.32mm×0.25μm)中，設置進樣口溫度280℃，fid檢測器溫度280℃，載氣氮氣流速1ml/min，進樣量1μl，分流比2.5：1；再采用三階梯逐步升溫方式進行操作，從而采集到色譜圖，將色譜圖用面積歸一化法計算獲得純度值。
對于苯酚，柱溫條件設置初始時為65℃，以3℃/min的速率升溫至200℃，再以10℃/min的速率升溫至260℃，保持6min。苯酚的升溫過程是
對于對苯二酚，柱溫條件設置初始時50℃，以8℃/min的速率升溫至220℃，再以15℃/min的速率升溫至270℃，保持6min。對苯二酚的升溫過程是
本發(fā)明比較了hp-5(弱極性，30m×0.25mm×0.25μm)，db-1701(中等極性，30m×0.25mm×0.25μm)，db-wax(強極性，30m×0.25mm×0.25μm)3種不同極性色譜柱的對雜質(zhì)和主成分的分離結(jié)果，結(jié)果表明，db-1701色譜柱最有利于雜質(zhì)的流出并檢測，且雜質(zhì)與主成分的理論塔板數(shù)更高、分離效果更佳，hp-2色譜柱的分離效果次之，db-wax色譜柱最差。
所述步驟3-1.2具體為：
本發(fā)明優(yōu)化后的hplc法測試過程如下：
采用c18色譜柱(250mm×4.6mm×5μm)，設置進樣量為10μl，柱流量為1ml/min，柱溫為25℃，構(gòu)建原料的流動相采集檢測波長為190nm～400nm的3d數(shù)據(jù)，波長分離度為1.2nm。以271.0nm(苯酚)和289.0nm(對苯二酚)為定值波長，從而采集到色譜圖，將色譜圖用面積歸一化法計算獲得純度值。
對于苯酚，流動相組成為30％甲醇+70％純水。
對于對苯二酚，流動相組成為70％甲醇+30％純水。
本發(fā)明在采用c18色譜柱(250mm×4.6mm×5μm)基礎上，比較5種不同比例的甲醇(a)和純水(b)為流動相(a.10％a+90b％；b.30％a+70％b；c.50％a+50％b；d.70％a+30％b；e.90％a+10％b)對雜質(zhì)和主成分分離結(jié)果的影響，在雜質(zhì)和主成分分子量相近的條件下，可保證各個組分極性大小的順序出峰。通過實驗分析確定本發(fā)明的苯酚和對苯二酚的流動相組成。
由于進樣量過低會導致苯酚中低含量的雜質(zhì)低于儀器的檢測限而無法被檢測出，若進樣量(或柱流量或柱溫)過高，則會導致苯酚中雜質(zhì)與主成分分離不佳，且主成分出峰峰形不對稱。因而選擇本發(fā)明進樣量為10μl的具體工藝條件。
所述步驟3-1.3具體為：
(1)殘留溶劑百分比含量測定：
針對待測樣品，根據(jù)原料生產(chǎn)工藝估計待測樣品中可能產(chǎn)生的殘留溶劑種類，依次運用靜態(tài)頂空法進樣、氣相色譜法分離和fid檢測器法檢測測定殘留溶劑的百分比含量。
靜態(tài)頂空進樣法測定條件是：平衡溫度80℃，定量環(huán)溫度90℃，轉(zhuǎn)移線溫度110℃，平衡時間30min，加壓時間2min；
氣相色譜法測定條件是：采用agilentdb-624色譜柱，30m×0.32mm×0.50μm，載氣流速1ml/min，分流比10:1，進樣口溫度200℃，起始柱溫40℃，保持15min，以10℃/min程序升溫至150℃，保持10min；
fid檢測器檢測條件是：溫度250℃；將fid檢測器檢測獲得的色譜圖運用外標法計算殘留溶劑的濃度值。
(2)水分百分比含量測定：
針對待測樣品，運用卡爾費休庫侖儀測定獲得水分的百分比含量，測定條件是：
檢測環(huán)境溫度為20℃，濕度為40％，極化電極為dm143-5c，極化電流5.0μa，指示單位為電壓(mv)，攪拌轉(zhuǎn)速45％，控制終點為100.0mv；電解電極的電流為自動終止，終止類型為漂移相對終止，漂移值為3.0μg/min，時間范圍為0～3600s。
(3)灰分百分比含量測定：
針對待測樣品，運用熱重分析儀測定獲得灰分的濃度值，測定條件是：采用al2o3坩堝，在初溫25℃以10℃/min的速率升溫至650℃；記錄熱分解過程中的質(zhì)量變化，得到熱重曲線，根據(jù)熱重曲線分析輸出灰分的濃度值。
所述步驟3-1.4具體是：
i'gc＝(100％-imoi-isolv-iash)×igc
i'hplc＝(100％-imoi-isolv-iash)×ihplc公式(1)
式中，i'gc和i'hplc分別為氣相色譜(gc)法和高效液相色譜(hplc)法對應的修正純度值，i'gc和i'hplc是由上述公式從igc和ihplc修正得到，igc和ihplc分別為氣相色譜(gc)法和高效液相色譜(hplc)法對應獲得的初始純度值，imoi、isolv和iash分別表示水分、溶劑殘留和灰分的濃度值。
所述步驟3-2具體為：差示掃描量熱法測純度，采用空的40μl標準鋁坩堝為參比，稱樣量為3.24～6.80mg，再采用三階梯逐步升溫方式進行操作，然后采用純度分析軟件proteusanalysis獲得純度值idsc，并進行多次測定獲得兩組純度值數(shù)據(jù)。
對于苯酚，初始溫度為0℃，以5℃/min的速率升溫至20℃，再以1℃/min的速率升溫至60℃。苯酚的升溫過程是
對于對苯二酚，初始溫度為0℃，以20℃/min的速率升溫至155℃，再以10℃/min的速率升溫至190℃。對苯二酚的升溫過程是
所述步驟3-3具體為：
針對同一待測樣品，將運用三種方法測得的三組純度值數(shù)據(jù)采用以下方式依次處理：
3-3.1：針對三組純度值數(shù)據(jù)(即為多次測定獲得的純度值i'gc，i'hplc和idsc)，分別先運用峰態(tài)系數(shù)法和偏態(tài)系數(shù)法進行正態(tài)分布性檢驗，再運用grabbs法和dixon法進行離群值檢驗剔除可疑值；
3-3.2：三組純度值數(shù)據(jù)的每兩組純度值之間(即i'gc與i'hplc之間，i'hplc與idsc之間，i'gc與idsc之間)均運用t檢驗法進行平均值的等精度檢驗，運用f檢驗法進行標準偏差的等精度檢驗；
3-3.3：根據(jù)平均值和標準偏差的等精度結(jié)果，求取平均值作為原料的最終純度值：
若步驟3-3.1保留的純度值數(shù)據(jù)同時滿足平均值和標準偏差的等精度，則取三組純度值數(shù)據(jù)的算術(shù)平均值；
若步驟3-3.1保留的純度值數(shù)據(jù)不同時滿足平均值和標準偏差的不等精度，則取三組純度值數(shù)據(jù)的加權(quán)平均值。
所述步驟4中將原料進行分裝具體是：在常溫20℃±3℃的潔凈室中準確稱取待測樣品50mg左右，分裝至棕色玻璃樣品瓶中，得到分裝樣品，重復上述步驟，獲得分裝樣品200瓶，編上號碼，于冷藏和避光條件下保存，用于后續(xù)均勻性和穩(wěn)定性檢驗。
所述步驟4中在分裝后具體為：
4-1：均勻性檢驗
分別從200瓶分裝樣品中按照頭尾、中間編號隨機抽取10瓶樣品，配制成供試品溶液，振蕩，按照hplc法(見步驟3-1.2)測定純度值，每瓶樣品平行測定3次；再采用單因素方差分析方法對測定結(jié)果進行統(tǒng)計分析，計算f統(tǒng)計值，查表獲得f臨界值，通過比較f統(tǒng)計值和f臨界值，檢驗分裝樣品的均勻性；若f統(tǒng)計值小于f臨界值，則樣品均勻；若f統(tǒng)計值大于等于f臨界值，則樣品不均勻。
f統(tǒng)計值計算方式如下：
式中，sinter和sintra分別表示瓶間和瓶內(nèi)方差，νinter和νintra分別表示瓶間和瓶內(nèi)自由度。
4-2：穩(wěn)定性檢驗
4-2.1短期穩(wěn)定性
從分裝樣品中隨機抽取數(shù)瓶，分別放在4℃、20℃和50℃環(huán)境中，分別至第1天，第2天，第5天和第8天各取出1瓶后，配制成供試品溶液，振蕩，按照hplc法(見步驟3-1.2)測定純度值，每瓶樣品平行測定3次，取平均值；再以放置在4℃環(huán)境中的分裝樣品測得的純度值為標準，查表獲得t臨界值，計算t統(tǒng)計值ttest，通過比較t統(tǒng)計值和t臨界值檢驗短期穩(wěn)定性：若t統(tǒng)計值小于t臨界值，則樣品短期穩(wěn)定；若t統(tǒng)計值大于等于t臨界值，則樣品短期不穩(wěn)定。
t統(tǒng)計值ttest計算公式如下：
式中，x0和s0分別表示放置在4℃冰箱中的分裝樣品測得的純度平均值和純度標準偏差，
4-2.2長期穩(wěn)定性
將分裝樣品儲存于20℃環(huán)境中，采用hplc法(見步驟3-1.2)進行12個月的穩(wěn)定性監(jiān)測，按照先密后疏的原則選取時間節(jié)點，每個時間節(jié)點選取1個樣品，每個樣品平行測定3次，取平均值；然后在潛在動力學機理未知的情況下，采用線性模型進行線性擬合，以x代表時間，以y代表某個時間節(jié)點的樣品純度值，擬合成一條直線，利用該直線斜率的顯著性判斷樣品的穩(wěn)定性。
利用該直線斜率的顯著性作為穩(wěn)定性，來判斷樣品的穩(wěn)定性具體是計算直線斜率的標準差，標準差與查表的t檢驗臨界值相乘后和直線斜率的絕對值比較，如果直線斜率的絕對值小，則樣品長期穩(wěn)定；否則樣品長期不穩(wěn)定。
所述步驟5是采用以下方式計算獲得總不確定度：
5-1：先采用以下計算方法獲得gc法和hplc法測定純度值引起的不確定度：
根據(jù)公式(1)，將基于gc法和hplc法獲得i'gc和i'hplc的計算公式合并為：
i'gc-hplc＝(100％-imoi-isolv-iash)×igc-hplc＝f1(igc-hplc,imoi,isolv,iash)公式(4)
將獲得i'gc和i'hplc過程引起的不確定度合并為一個不確定度考慮u'gc-hplc，根據(jù)公式(4)，推導其計算公式如下：
公式(5)中，ugc-hplc表示獲得igc和ihplc引起的合成不確定度，
ugc-hplc的計算方式為：
5-2：再采用以下公式計算dsc法測定純度值引起的不確定度udsc：
其中，udsc-a和udsc-b表示dsc法測定中a類評定和b類評定的標準不確定度，udsc-a是通過測量dsc法的重復性計算得到；
對于udsc-b，由于dsc法測定純度的原理是基于范特霍夫方程，該方程如下：
idsc表示dsc法測定樣品的純度值，y表示雜質(zhì)的摩爾分數(shù)，t0和tm分別表示純樣品和實際樣品的熔融溫度，△hf表示摩爾熔融焓，r為氣體常數(shù)，q為樣品吸收的熱量，m為樣品的質(zhì)量，m為樣品的摩爾質(zhì)量。
因此，udsc-b的計算方法如下：
其中，um，uq，ut分別為天平的稱量誤差、儀器的熱量測量誤差、儀器的溫度誤差這三個互相不相關(guān)的輸入量的標準不確定度，
第二函數(shù)f2表示為：
式中，t0和tm分別表示純樣品和實際樣品的熔融溫度，r為氣體常數(shù)，q為樣品吸收的熱量，m為樣品的質(zhì)量，m為樣品的摩爾質(zhì)量。
5-3：計算分不確定度
根據(jù)均勻性檢驗得到的單因素方差分析結(jié)果采用以下公式計算得到均勻性引起的不確定度uh：
根據(jù)長期穩(wěn)定性檢驗得到的擬合直線斜率的標準偏差乘以穩(wěn)定性監(jiān)測時間，采用以下公式計算得到穩(wěn)定性引起的不確定度us：
us＝s(b1)·t公式(10)
5-4：計算總不確定度
采用以下公式將gc法、hplc法和dsc法測定純度引起的不確定度，以及均勻性和穩(wěn)定性引起的不確定度進行綜合計算得到總不確定度，公式如下：
其中，uh表示均勻性引起的不確定度，us表示穩(wěn)定性引起的不確定度，u'gc-hplc表示gc法和hplc法獲得純度修正值引起的合成不確定度，udsc表示dsc法測定純度值引起的不確定度。
所述步驟1中的純度初檢和所述步驟4的均勻性和穩(wěn)定性檢驗中的純度值測定均與所述步驟3-1.2相同的過程。
本發(fā)明通過原材料篩選、定性確證、純度測定、均勻性和穩(wěn)定性檢驗以及不確定度計算，獲得了了苯酚和對苯二酚的標準物質(zhì)，從而提高化妝品中酚類物質(zhì)檢測的準確度，同時保證檢測結(jié)果的溯源性。
本發(fā)明的有益效果是：
本發(fā)明能夠準確測定苯酚和對苯二酚純度值，并建立針對該純度值的定值獲取不確定度的方式。
本發(fā)明定性準確全面，三種純度測定方法減少了因單一定值方法帶來的系統(tǒng)誤差，均勻性、穩(wěn)定性和不確定度評估方法系統(tǒng)全面，保證了量值準確性、穩(wěn)定性和可溯源性，獲得了高純度(99％以上)苯酚和對苯二酚純度標準物質(zhì)。
本發(fā)明測定結(jié)果可獲得苯酚和對苯二酚純度標準物質(zhì)，并通過純度標準物質(zhì)使得化妝品中相應添加劑的檢測結(jié)果更加準確，可用于相應物質(zhì)檢測結(jié)果的量值溯源和量值傳遞、分析方法和檢測能力的評價以及生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制。
附圖說明
圖1是本發(fā)明方法流程框圖；
圖2是實施例1采集到的苯酚的質(zhì)譜圖；
圖3是實施例1采集到的苯酚的紅外光譜圖；
圖4是實施例1采集到的苯酚的氣相色譜圖；
圖5是實施例1采集到的苯酚的液相色譜圖；
圖6是實施例1采集到的苯酚的差示掃描量熱法曲線圖；
圖7是實施例2采集到的對苯二酚的質(zhì)譜圖；
圖8是實施例2采集到的對苯二酚的紅外光譜圖；
圖9是實施例2采集到的對苯二酚的液相色譜圖；
圖10是實施例2采集到的對苯二酚的氣相色譜圖；
圖11是實施例2采集到的對苯二酚的差示掃描量熱法曲線圖。
具體實施方式
下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。
本發(fā)明的實施例如下：
實施例1：苯酚
步驟1——原料篩選
采用百靈威科技有限公司生產(chǎn)的苯酚原料。運用hplc法(見實施例1步驟3-1.2)測定純度值，重結(jié)晶2次后得到純度初檢合格后的待測樣品。
步驟2——定性確證
運用gc-ms法和ft-ir法定性確證苯酚。
步驟2-1、采用gc-ms法定性確證苯酚
針對苯酚待測樣品，溶于甲醇后制成供試品溶液，進樣測試。測試條件如下：設置進樣口溫度為250℃，傳輸線溫度為280℃，載氣流速為1ml/min，進樣量為10μl，分流比為10:1；色譜柱升溫操作為：采用初始溫度60℃，保持1min后，以15℃/min的速率升溫至270℃，保持10min。
由附圖1可得，分子離子峰94，經(jīng)nist標準譜圖庫檢索得苯酚標準質(zhì)譜圖，二者匹配度為96％。
步驟2-2、采用ft-ir法定性確證苯酚
針對苯酚待測樣品，采用kbr混合研磨后用模具壓制成固體薄片，上架測試。測試條件如下：采用dtgskbr檢測器和kbr分束器測試，采樣增益設置為1.0，紅外光譜掃描范圍為4000～400cm-1，樣品掃描8次，背景掃描8次，取分辨率為4.000cm-1，從而獲得紅外光譜圖(見附圖2)。
由附圖2可得，ν＝3355.44cm-1(1)附近寬大的吸收峰是容易發(fā)生締合的酚羥基o-h的伸縮振動峰，ν＝3090.03cm-1(2)，ν＝3046.04cm-1(3)，ν＝3020.22cm-1(4)均是苯環(huán)上不飽和c-h鍵的伸縮振動峰，ν＝1599.81cm-1(5)，ν＝1499.28cm-1(6)均是苯環(huán)的骨架振動，ν＝1231.12cm-1(7)是酚羥基中c-o的伸縮振動峰，ν＝752.99cm-1(8)和ν＝690.54cm-1(9)，是苯環(huán)上單取代的c-h鍵彎曲振動峰。經(jīng)標準譜圖庫檢索得苯酚標準紅外光譜圖，二者匹配度為94％。
步驟3——純度測定
運用gc法、hplc法和dsc法測定苯酚純度。
步驟3-1、針對苯酚的待測樣品，溶于純甲醇，制成供試品溶液，采用gc法和hplc法聯(lián)合測定純度值；溶劑殘留、水分和灰分不響應的雜質(zhì)再分別用頂空-gc法、卡爾費休庫倫法和熱重分析法測定。
步驟3-1.1、采用gc法采集色譜圖，優(yōu)化采集條件如下：
比較了hp-5(弱極性，30m×0.25mm×0.25μm)，db-1701(中等極性，30m×0.25mm×0.25μm)，db-wax(強極性，30m×0.25mm×0.25μm)3種不同極性色譜柱的對雜質(zhì)和主成分的分離結(jié)果，結(jié)果表明，db-1701色譜柱最有利于雜質(zhì)的流出并檢測，且雜質(zhì)與主成分的理論塔板數(shù)更高、分離效果更佳，因此選擇弱極性色譜柱db-1701(30m×0.32mm×0.25μm)。
設置進樣口溫度280℃，fid檢測器溫度280℃，載氣氮氣流速1ml/min，進樣量1μl，分流比2.5：1；色譜柱升溫過程是
步驟3-1.2、采用hplc法采集色譜圖，優(yōu)化采集條件如下：
比較了5種不同比例的甲醇(a)和純水(b)為流動相(a.10％a+90b％；b.30％a+70％b；c.50％a+50％b；d.70％a+30％b；e.90％a+10％b)對雜質(zhì)和主成分分離度、理論塔板數(shù)、峰寬、對稱性因素的影響，確定構(gòu)建流動相組成為30％純甲醇+70％純水，采用c18色譜柱(250mm×4.6mm×5μm)，設置進樣量為10μl，柱流量為1ml/min，柱溫為25℃，采集檢測波長為190nm～400nm的3d數(shù)據(jù)，以271.0nm苯酚為定值波長，將采集到的色譜圖(見附圖4)用面積歸一化法計算獲得初始純度值(用ihplc表示)。附圖4中峰1和峰2為雜質(zhì)，峰3為苯酚，曲線b是曲線a的放大圖。
步驟3-1.3、分別采用靜態(tài)頂空進樣-gc-氫火焰離子化(fid)檢測器、卡爾費休庫侖儀和熱重分析儀對待測樣品進行測定，分別獲得殘留溶劑、水分、灰分的三種雜質(zhì)的百分比含量(分別用isolv，imoi和iash表示)。具體測定條件如下：
(1)殘留溶劑百分比含量測定：
針對待測樣品，根據(jù)原料生產(chǎn)工藝，估計待測樣品中可能產(chǎn)生的殘留溶劑種類為丙酮，依次運用靜態(tài)頂空法進樣、氣相色譜法分離和fid檢測器法檢測采集色譜圖。
靜態(tài)頂空進樣法測定條件是：平衡溫度80℃，定量環(huán)溫度90℃，轉(zhuǎn)移線溫度110℃，平衡時間30min，加壓時間2min；
氣相色譜法測定條件是：采用agilentdb-624色譜柱，30m×0.32mm×0.50μm，載氣流速1ml/min，分流比10:1，進樣口溫度200℃，起始柱溫40℃，保持15min，以10℃/min程序升溫至150℃，保持10min；
fid檢測器檢測條件是：溫度250℃；
依照上述測定條件建立純丙酮溶劑的標準曲線，運用外標法計算丙酮的百分比含量(用isolv表示)。
(2)水分百分比含量測定：
針對待測樣品，運用卡爾費休庫侖儀測定水分的百分比含量，測定條件是：
檢測環(huán)境溫度為20℃，濕度為40％，極化電極為dm143-5c，極化電流5.0μa，指示單位為電壓(mv)，攪拌轉(zhuǎn)速45％，控制終點為100.0mv；電解電極的電流為自動終止，終止類型為漂移相對終止，漂移值為3.0μg/min，時間范圍為0～3600s。獲得的水分百分比含量用imoi表示。
(3)灰分百分比含量測定：
針對待測樣品，運用熱重分析儀測定獲得灰分的濃度值，測定條件是：采用al2o3坩堝，在初溫25℃以10℃/min的速率升溫至650℃；記錄熱分解過程中的質(zhì)量變化，得到熱重曲線，根據(jù)熱重曲線分析輸出灰分的百分比含量(用iash表示)。
3-1.4、根據(jù)步驟3-1.1和3-1.2獲得的純度值，分別經(jīng)步驟3-1.3獲得的雜質(zhì)百分比含量，根據(jù)公式(1)計算獲得修正純度值(分別用i'gc和i'hplc表示)。
步驟3-2、針對苯酚的待測樣品，采用dsc法測定苯酚純度值。測定條件如下：
采用空的40μl標準鋁坩堝為參比，稱樣量為3.24～6.80mg，升溫過程是
步驟3-3對于每個苯酚的待測樣品，重復步驟3-1和步驟3-2進行10次測定，獲得10次測定對應的三組純度值，進行數(shù)據(jù)處理獲得待測樣品的最終純度值。
步驟3-3.1
3-3.1：針對三組純度值(i'gc，i'hplc和idsc)，分別先運用峰態(tài)系數(shù)法和偏態(tài)系數(shù)法進行正態(tài)分布性檢驗，再運用grabbs法和dixon法進行離群值檢驗，結(jié)果表明無可疑值，保留數(shù)據(jù)進行下一步驟；
3-3.2：針對每兩組純度值(i'gc與i'hplc，i'hplc與idsc，i'gc與idsc)進行等精度檢驗，t檢驗結(jié)果顯示三組數(shù)據(jù)的平均值是等精度的，f檢驗結(jié)果顯示三組數(shù)據(jù)的標準偏差是等精度的；
3-3.3：數(shù)據(jù)處理結(jié)果見表1。由于三組數(shù)據(jù)為等精度測定，則取三組純度值的算術(shù)平均值為最終純度值，即為：
表1三種方法測定苯酚純度值結(jié)果
步驟4——分裝
在常溫20℃±3℃的潔凈室中準確稱取苯酚50mg左右，分裝至棕色玻璃樣品瓶中，獲得分裝樣品，重復上述步驟，獲得分裝樣品約200瓶，編上號碼，于冷藏和避光條件下保存。用于均勻性和穩(wěn)定性檢驗。
步驟5——均勻性檢驗
苯酚均勻性檢驗結(jié)果見表2。采用單因素方差分析方法對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，根據(jù)公式(2)得到
表2苯酚均勻性檢驗結(jié)果
步驟6——穩(wěn)定性檢驗
步驟6-1短期穩(wěn)定性檢驗
表3苯酚的短期穩(wěn)定性檢驗結(jié)果
苯酚的短期穩(wěn)定性檢驗結(jié)果見表3。以放置在4℃環(huán)境中的分裝樣品測得的純度值為標準。由表3得，純度標準值為x0＝99.60％，，其相對標準偏差為s0＝0.03％，平行測定次數(shù)n＝3，自由度ν＝n+n-2＝4。代入公式(3)計算得到t統(tǒng)計值(用ttest表示)。查t分布雙側(cè)分位數(shù)表可知，t(0.05,4)＝2.78。由表3得，在20℃條件下，ttest<t(0.05,4)，50℃條件下，ttest>t(0.05,4)，表明分裝樣品在常溫穩(wěn)定性良好，而在高溫條件下分裝樣品的純度值發(fā)生顯著衰減，因此分裝樣品需在常溫下保存。
步驟6-2長期穩(wěn)定性檢驗
表4苯酚的長期穩(wěn)定性檢驗結(jié)果
苯酚的長期穩(wěn)定性檢驗結(jié)果見表4。設時間對純度值的方程為y＝b0+b1x，斜率的標準偏差為s(b1)，經(jīng)回歸分析得|b1|＝8.6×10-3，s(b1)＝3.78×10-3，經(jīng)查t檢驗臨界值表得t(0.95,4)＝2.78，則|b1|<t0.95,4·s(b1)，則斜率估計值不顯著，表明當置信水平為0.95時，分裝樣品的純度值沒有發(fā)生顯著變化。
步驟7——不確定度評定
步驟7-1純度測定引起的不確定度評定
三種方法進行純度測定引起的不確定度結(jié)果如表所示(表5：gc法和hplc法；表6：dsc法)。
表5gc法和hplc法測定純度引起的不確定度
表6dsc法純度測定引起的不確定度
純度測定引入的不確定度(用ud表示)，由三種方法的不確定度合成，則得到：
步驟7-2均勻性和穩(wěn)定性引入的不確定度評定
根據(jù)均勻性檢驗結(jié)果和公式(9)，得到均勻性引入的不確定度分量為：
步驟8——結(jié)論
根據(jù)步驟3得到，苯酚的純度標準值為99.42％，根據(jù)步驟7和公式(11)標準不確定度為0.10％，擴展不確定度為0.20％，k＝2。在有效期一年時間內(nèi)、常溫下儲存的均勻性和穩(wěn)定性良好，可作為純度標準物質(zhì)用于化妝品中苯酚的準確測定、量值傳遞和量值溯源。
本實施例的苯酚純度標準物質(zhì)經(jīng)用戶單位(深圳市通檢測技術(shù)有限公司、深圳中檢聯(lián)檢測有限公司和杭州市環(huán)境監(jiān)測中心站)試用后，出具了用戶試用報告，試用報告表示，該標準物質(zhì)均勻性良好，量值準確可靠，使用方便，滿足了化妝品中苯酚百分比含量準確測定的要求，具有很高的實用價值和推廣價值。
實施例2：對苯二酚
步驟1原料篩選
通過市售的采用百靈威科技有限公司生產(chǎn)的對苯二酚原料。運用hplc法(見實施例2步驟3-1.2)測定純度值，重結(jié)晶3次后得到純度初檢合格后的待測樣品。
步驟2——定性確證
運用gc-ms法和ft-ir法定性確證對苯二酚。
步驟2-1、采用gc-ms法定性確證對苯二酚
針對對苯二酚待測樣品，溶于甲醇后制成供試品溶液，進樣測試。測試條件如下：設置進樣口溫度為250℃，傳輸線溫度為280℃，載氣流速為1ml/min，進樣量為10μl，分流比為10:1；色譜柱升溫操作為：色譜柱升溫操作為：采用初始溫度60℃，以10℃/min的速率升溫至110℃，保持0.5min后，再以10℃/min的速率升溫至180℃，保持3min，采用全掃描方式掃描，掃描范圍為12-500m/z，溶劑延遲時間為3min。采集到的質(zhì)譜圖與標準質(zhì)譜圖對照，得到匹配度95％，表明待測樣品是真實的(見附圖6)。
由附圖6可得，分子離子峰119.9，經(jīng)標準譜圖庫檢索得對苯二酚標準質(zhì)譜圖，二者匹配度為95％。
步驟2-2、采用ft-ir法定性確證對苯二酚
針對對苯二酚待測樣品，采用kbr混合研磨后用模具壓制成固體薄片，上架測試。測試條件如下：
采用dtgskbr檢測器和kbr分束器測試，采樣增益設置為1.0，紅外光譜掃描范圍為4000～400cm-1，樣品掃描8次，背景掃描8次，取分辨率為4.000cm-1，從而獲得紅外光譜圖(見附圖7)。
由附圖7可得，ν＝3261.34cm-1(1)處寬大的吸收峰是容易發(fā)生締合的酚羥基o-h的伸縮振動峰。ν＝3030.11cm-1(2)是苯環(huán)上不飽和c-h鍵的伸縮振動峰。ν＝1517.92cm-1(3)，ν＝1475.25(4)均是苯環(huán)的骨架振動，ν＝1242.99cm-1(5)，ν＝1209.42cm-1(6)，ν＝1191.72cm-1(7)是酚羥基中c-o的伸縮振動峰，ν＝827.22cm-1(8)是苯環(huán)上1,4-二取代的c-h鍵彎曲振動峰。與標準譜圖對照后，匹配度為94％。
步驟3——純度測定
運用gc法、hplc法和dsc法測定對苯二酚純度。
步驟3-1、針對對苯二酚的待測樣品，溶于純甲醇，制成供試品溶液，采用gc法和hplc法聯(lián)合測定純度值；溶劑殘留、水分和灰分不響應的雜質(zhì)再分別用頂空-gc法、卡爾費休庫倫法和熱重分析法測定。
步驟3-1.1、采用gc法采集色譜圖，優(yōu)化采集條件如下：
比較了hp-5(弱極性，30m×0.25mm×0.25μm)，db-1701(中等極性，30m×0.25mm×0.25μm)，db-wax(強極性，30m×0.25mm×0.25μm)3種不同極性色譜柱的對雜質(zhì)和主成分的分離結(jié)果，結(jié)果表明，db-1701色譜柱最有利于雜質(zhì)的流出并檢測，且雜質(zhì)與主成分的理論塔板數(shù)更高、分離效果更佳，因此選擇弱極性色譜柱db-1701(30m×0.32mm×0.25μm)。
設置進樣口溫度280℃，fid檢測器溫度280℃，載氣氮氣流速1ml/min，進樣量1μl，分流比2.5：1；色譜柱升溫過程是
附圖8中，峰1是溶劑，峰2是對苯二酚，峰3是雜質(zhì)。曲線b是曲線a的放大圖。
步驟3-1.2、采用hplc法采集色譜圖，優(yōu)化采集條件如下：
比較了5種不同比例的甲醇(a)和純水(b)為流動相(a.10％a+90b％；b.30％a+70％b；c.50％a+50％b；d.70％a+30％b；e.90％a+10％b)對雜質(zhì)和主成分分離度、理論塔板數(shù)、峰寬、對稱性因素的影響，確定構(gòu)建流動相組成為70％純甲醇+30％純水，采用c18色譜柱(250mm×4.6mm×5μm)，設置進樣量為10μl，柱流量為1ml/min，柱溫為25℃，采集檢測波長為190nm～400nm的3d數(shù)據(jù)，以289.0nm苯酚為定值波長，將采集到的色譜圖(見附圖9)用面積歸一化法計算獲得初始純度值(用ihplc表示)。
附圖9中，峰1，峰3和峰4是雜質(zhì)，峰2是對苯二酚。曲線b是曲線a的放大圖。
步驟3-1.3、分別采用靜態(tài)頂空進樣-gc-氫火焰離子化(fid)檢測器、卡爾費休庫侖儀和熱重分析儀對待測樣品進行測定，分別獲得殘留溶劑、水分、灰分的三種雜質(zhì)的百分比含量(分別用isolv，imoi和iash表示)。具體測定條件如下：
(1)殘留溶劑百分比含量測定：
針對待測樣品，根據(jù)原料生產(chǎn)工藝，估計待測樣品中可能產(chǎn)生的殘留溶劑種類為丙酮，依次運用靜態(tài)頂空法進樣、氣相色譜法分離和fid檢測器法檢測采集色譜圖。
靜態(tài)頂空進樣法測定條件是：平衡溫度80℃，定量環(huán)溫度90℃，轉(zhuǎn)移線溫度110℃，平衡時間30min，加壓時間2min；
氣相色譜法測定條件是：采用agilentdb-624色譜柱，30m×0.32mm×0.50μm，載氣流速1ml/min，分流比10:1，進樣口溫度200℃，起始柱溫40℃，保持15min，以10℃/min程序升溫至150℃，保持10min；
fid檢測器檢測條件是：溫度250℃；
依照上述測定條件建立純丙酮溶劑的標準曲線，運用外標法計算丙酮的百分比含量(用isolv表示)。
(2)水分百分比含量測定：
針對待測樣品，運用卡爾費休庫侖儀測定水分的百分比含量，測定條件是：
檢測環(huán)境溫度為20℃，濕度為40％，極化電極為dm143-5c，極化電流5.0μa，指示單位為電壓(mv)，攪拌轉(zhuǎn)速45％，控制終點為100.0mv；電解電極的電流為自動終止，終止類型為漂移相對終止，漂移值為3.0μg/min，時間范圍為0～3600s。獲得的水分百分比含量用imoi表示。
(3)灰分百分比含量測定：
針對待測樣品，運用熱重分析儀測定獲得灰分的濃度值，測定條件是：采用al2o3坩堝，在初溫25℃以10℃/min的速率升溫至650℃；記錄熱分解過程中的質(zhì)量變化，得到熱重曲線，根據(jù)熱重曲線分析輸出灰分的百分比含量(用iash表示)。
3-1.4、根據(jù)步驟3-1.1和3-1.2獲得的純度值，分別經(jīng)步驟3-1.3獲得的雜質(zhì)百分比含量，根據(jù)公式(1)計算獲得修正純度值(分別用i'gc和i'hplc表示)。
步驟3-2、針對對苯二酚的待測樣品，采用dsc法測定對苯二酚純度值。測定條件如下：
采用空的40μl標準鋁坩堝為參比，稱樣量為3.24～6.80mg，升溫過程是
步驟3-3對于每個對苯二酚的待測樣品，重復步驟3-1和步驟3-2進行10次測定，獲得10次測定對應的三組純度值，進行數(shù)據(jù)處理獲得待測樣品的最終純度值。
步驟3-3.1
3-3.1：針對三組純度值(i'gc，i'hplc和idsc)，分別先運用峰態(tài)系數(shù)法和偏態(tài)系數(shù)法進行正態(tài)分布性檢驗，再運用grabbs法和dixon法進行離群值檢驗，結(jié)果表明無可疑值，保留數(shù)據(jù)進行下一步驟；
3-3.2：針對每兩組純度值(i'gc與i'hplc，i'hplc與idsc，i'gc與idsc)進行等精度檢驗，t檢驗結(jié)果顯示三組數(shù)據(jù)的平均值是等精度的，f檢驗結(jié)果顯示三組數(shù)據(jù)的標準偏差是等精度的；
3-3.3：數(shù)據(jù)處理結(jié)果見表7。由于三組數(shù)據(jù)為等精度測定，則取三組純度值的算術(shù)平均值為最終純度值，即為：
表7三種方法測定對苯二酚純度值結(jié)果
步驟4——分裝
在常溫20℃±3℃的潔凈室中準確稱取對苯二酚50mg左右，分裝至棕色玻璃樣品瓶中，獲得分裝樣品，重復上述步驟，獲得分裝樣品約200瓶，編上號碼，于冷藏和避光條件下保存。用于均勻性和穩(wěn)定性檢驗。
步驟5——均勻性檢驗
對苯二酚的均勻性檢驗結(jié)果見表8。采用單因素方差分析方法對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，根據(jù)公式(2)得到
表8對苯二酚的均勻性檢驗結(jié)果
步驟6——穩(wěn)定性檢驗
步驟6-2短期穩(wěn)定性檢驗
表9對苯二酚的短期穩(wěn)定性檢驗結(jié)果
對苯二酚的短期穩(wěn)定性檢驗結(jié)果見表9，以放置在4℃環(huán)境中的分裝樣品測得的純度值為標準。由表3得，純度標準值為x0＝99.74％，其相對標準偏差為s0＝0.01％，平行測定次數(shù)n＝3，自由度ν＝n+n-2＝4。代入公式(3)計算得到t統(tǒng)計值(用ttest表示)。查t分布雙側(cè)分位數(shù)表可知，t(0.05,4)＝2.78。由表9得，在20℃條件下，ttest<t(0.05,4)，50℃條件下，ttest>t(0.05,4)，表明分裝樣品在常溫穩(wěn)定性良好，而在高溫條件下分裝樣品的純度值發(fā)生顯著衰減，因此分裝樣品需在常溫下保存。
步驟6-2長期穩(wěn)定性檢驗
表10對苯二酚的長期穩(wěn)定性考察結(jié)果
對苯二酚的長期穩(wěn)定性考察結(jié)果見表10。設時間對純度值的方程為y＝b0+b1x，斜率的標準偏差為s(b1)，經(jīng)回歸分析得|b1|＝2.3×10-3，s(b1)＝2.8×10-3，經(jīng)查t檢驗臨界值表得t(0.95,n-2)＝2.78，則|b1|<t0.95,n-2·s(b1)，則斜率估計值不顯著，表明當置信水平為0.95時，分裝樣品的純度值沒有發(fā)生顯著變化。
步驟7——不確定度評定
步驟7-1定值引入的不確定度評定
步驟7-1純度測定引起的不確定度評定
步驟7-1.1gc法和hplc法測定引起的不確定度
三種方法進行純度測定引起的不確定度結(jié)果如表所示(表11：gc法和hplc法；表12：dsc法)。
表11gc法和hplc法測定純度引起的不確定度結(jié)果
表12dsc法引起的不確定度
將純度測定引起的不確定度(用ud表示)由三種純度測定方法的不確定度合成，則得到：
步驟7-2均勻性和穩(wěn)定性引入的不確定度評定
根據(jù)均勻性檢驗結(jié)果和公式(9)，得到均勻性引起的不確定度分量為：
步驟8——結(jié)論
根據(jù)步驟3得到，對苯二酚的標準純度值為99.65％，根據(jù)步驟7和公式(11)得到標準不確定度為0.09％，擴展不確定度為0.18％，k＝2。在有效期一年時間內(nèi)、常溫下儲存的均勻性和穩(wěn)定性良好，可作為純度標準物質(zhì)用于化妝品中對苯二酚的準確測定、量值傳遞和量值溯源。
本實施例的對苯二酚純度標準物質(zhì)經(jīng)用戶單位(深圳市通檢測技術(shù)有限公司、深圳中檢聯(lián)檢測有限公司和杭州市環(huán)境監(jiān)測中心站)試用后，出具了用戶試用報告，試用報告表示，該標準物質(zhì)均勻性良好，量值準確可靠，使用方便，滿足了化妝品中對苯二酚百分比含量準確測定的要求，具有很高的實用價值和推廣價值。
由上述實施例可見，本發(fā)明方法的定性準確，運用三種不同原理的方法聯(lián)合測定純度值，減少了因單一定值方法帶來的系統(tǒng)誤差，統(tǒng)計數(shù)據(jù)處理方法嚴謹，不確定度評估方法全面，保證了量值準確性、穩(wěn)定性和可溯源性，獲得了高純度(99％以上)苯酚和對苯二酚純度標準物質(zhì)。
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