本發(fā)明涉及檢測藥物濃度的方法。具體而言，本發(fā)明涉及通過超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(uplc-ms/ms)測定人血漿和/或腦脊液中奧希替尼(azd9291)的藥物濃度的方法。

背景技術(shù)：

引言

肺癌作為全球范圍發(fā)病率和死亡率最高的腫瘤之一，每年有180萬的新發(fā)病例以及150萬的死亡病例[1]。在肺癌患者疾病進(jìn)展中，有約40％-50％的患者進(jìn)展到腦轉(zhuǎn)移。腦轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移包括了腦實質(zhì)轉(zhuǎn)移和腦膜轉(zhuǎn)移。有腦轉(zhuǎn)移的肺癌患者通常有更差的生存質(zhì)量，影響了患者的總生存時間[2]。

表皮生長因子受體廣泛分布于哺乳動物上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞表面，egfr信號通路對細(xì)胞的生長、增殖和分化等生理過程發(fā)揮重要的作用。大量的臨床試驗證實吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼和?？颂婺岬缺砥どL因子受體酪氨酸激酶抑制劑(egfr-tki)在pfs、生活質(zhì)量以及耐受性方面與傳統(tǒng)化療相比均具有顯著優(yōu)勢，奠定了egfr-tki在egfr基因敏感突變陽性晚期nsclc治療中的地位[3-5]。egfr基因敏感突變的發(fā)生率具有明顯的種族差異，高加索晚期肺腺癌患者只有17％，而我國患者卻高達(dá)50.2％[6]，意味著我國有更多的患者可以接受egfr-tki治療。同時，研究結(jié)果也表明一代和二代的egfr-tki的治療腦轉(zhuǎn)移的患者中取得了很好的療效[7]。然而，egfr-tki治療過程中的耐藥是普遍存在的問題，t790m突變是發(fā)生耐藥最主要的原因。奧希替尼(azd9291)是一種新型的三代的egfr-tki藥物，用于治療egfrt790m突變的非小細(xì)胞肺癌患者[8]。奧希替尼(azd9291)的結(jié)構(gòu)不同于所有其它目前已經(jīng)批準(zhǔn)用于臨床的egfr-tkis。最近的研究也證實了其在腦轉(zhuǎn)移患者中的療效。在aur3的臨床試驗中，144例具有腦轉(zhuǎn)移的患者，接受奧西他濱的患者的無疾病進(jìn)展生存期的中位時間要長于接受鉑類加培美曲塞治療的患者[9]。

檢測血液或其他生物樣本中的藥物濃度是藥動學(xué)、藥效學(xué)研究和臨床治療的基礎(chǔ)。用于檢測血漿藥物濃度的方法應(yīng)當(dāng)具備高靈敏度、能夠快速獲得結(jié)果和能夠使用少量樣品進(jìn)行。然而，由于血液中存在包括磷脂、蛋白等多種組份，檢測易受基質(zhì)效應(yīng)等各種因素的影響。如何最大可能減少基質(zhì)效應(yīng)，盡可能獲得血液中藥物的準(zhǔn)確濃度，是本領(lǐng)域必須進(jìn)行深入研究的課題。

hplc法是目前檢測血藥濃度常用的方法，應(yīng)用范圍廣泛。但是，由于使用色譜柱進(jìn)行分離耗費時間較長、靈敏度較低，并不適用于高通量的生物樣品分析。

超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(ultraperformanceliquidchromatography，uplc-ms/ms)法提高了分析通量，節(jié)省了樣品和溶劑分析時間。然而，uplc-ms/ms對流動相，色譜柱，樣品前處理，質(zhì)譜接口，數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)都提出了特別的要求。盡管對轉(zhuǎn)換方法進(jìn)行了一些研究，傳統(tǒng)的高效液相色譜hplc的條件不能直接應(yīng)用于uplc-ms/ms，需要對包括樣品前處理、內(nèi)標(biāo)、流動相、色譜柱選擇、質(zhì)譜條件設(shè)置等各項條件進(jìn)行大量試驗，才能實現(xiàn)uplc-ms/ms快速檢測分析。例如，周新等人的研究(hplc與uplc色譜條件轉(zhuǎn)換方法研究，分析試驗室，第27卷第4期，2008年4月)表明直接將hplc條件應(yīng)用于uplc，不能達(dá)到對待測物質(zhì)分離分析的目的；而且質(zhì)譜檢測與色譜檢測不同，對于流動相組成、流速等多種方面需要額外的注意，因此對實驗條件包括例如流動相選擇等進(jìn)行具體深入研究才能獲得分離狀況良好的uplc-ms/ms方法。

目前，一些采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(liquidchromatography-tandemmassspectrometry，lc-ms/ms)技術(shù)測定血漿樣本中奧希替尼的方法有報道。到目前為止，只有兩篇測定了人血漿的濃度，且使用的樣本前處理方法為鹽析液液萃取法[11-12]，并且沒有測定在人腦脊液中奧希替尼濃度的方法學(xué)報道。本研究旨在建立靈敏、快捷的超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(uplc-ms/ms)方法檢測人血漿和/或腦脊液中奧希替尼的藥物濃度，為奧希替尼的臨床藥代動力學(xué)研究提供支持。

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技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明人已經(jīng)建立了快速、靈敏的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(ultrahighperformanceliquidchromatography-tandemmassspectrometry，uplc-ms/ms)技術(shù)檢測人血漿和/或腦脊液中奧希替尼的藥物濃度的方法。本發(fā)明的方法具有的優(yōu)點包括例如樣本處理簡單、快捷、靈敏度高、回收率高、基質(zhì)效應(yīng)小等。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供通過超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(uplc-ms/ms)測定人血漿和/或腦脊液中奧希替尼的濃度的方法，其中所述方法可以采用含甲酸的甲酸銨水-甲酸乙腈作為流動相進(jìn)行。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法也可以采用甲醇作為流動相進(jìn)行。發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用甲醇作為流動相可獲得更好的響應(yīng)，但是基線噪音也相應(yīng)增高，而且目標(biāo)化合物的信號較高，存在較為嚴(yán)重的殘留。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法也可以采用乙腈和異丙醇(例如體積比在30/70～70/30范圍，或體積比在40/60～60/40范圍，或體積比為50/50)作為洗脫液。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)采用乙腈和異丙醇作為強(qiáng)洗脫液改善了殘留問題。在一些實施方案中，本發(fā)明的流動相中可以加入甲酸(例如濃度范圍為0.05％-1％，濃度范圍為0.1％-0.9％，濃度范圍為0.15％-0.8％，濃度范圍為0.2％-0.7％，濃度范圍為0.3％-0.6％，濃度為0.1％、0.15％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％等)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在流動相中加入甲酸，能夠改善殘留，獲得良好的峰形。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法可以采用含甲酸的甲酸銨水-甲酸乙腈作為流動相進(jìn)行分析時。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)采用含甲酸的甲酸銨水-甲酸乙腈作為流動相時，洗脫能夠快速、充分分離待測物質(zhì)，獲得良好的峰形。在一些實施方案中，已經(jīng)顯示在作為流動相的乙腈中加入甲酸，能夠改善殘留，獲得良好的峰形。在一些實施方案中，已經(jīng)顯示采用含甲酸的甲酸乙腈作為流動相獲得了降低的基線噪音，減少了殘留。

在一些實施方案中，本發(fā)明的方法采用的含甲酸的甲酸銨水-甲酸乙腈流動相的體積比選自以下范圍：含甲酸的甲酸銨水∶甲酸乙腈(95/5，v/v)-含甲酸的甲酸銨水∶甲酸乙腈(5/95，v/v)，含甲酸的甲酸銨水∶甲酸乙腈(90/10，v/v)-含甲酸的甲酸銨水∶甲酸乙腈(10/90，v/v)，含甲酸的甲酸銨水∶甲酸乙腈(90/10，v/v)-含甲酸的甲酸銨水∶甲酸乙腈(50/50，v/v)。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法采用洗脫梯度進(jìn)行。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法采用洗脫梯度包括含甲酸的甲酸銨水∶甲酸乙腈(90/10，v/v)-含甲酸的甲酸銨水∶甲酸乙腈(10/90，v/v)作為流動相進(jìn)行。在一些實施方案中，本發(fā)明的流動相中的加入的甲酸的濃度范圍可以為0.05％-1％，濃度范圍可以為0.1％-0.9％，濃度范圍可以為0.15％-0.8％，濃度范圍可以為0.2％-0.7％，濃度范圍可以為0.3％-0.6％，例如加入的甲酸的濃度為0.1％、0.15％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％等。在一些實施方案中，本發(fā)明的流動相中的甲酸銨水濃度范圍可以為0.5-50mm，濃度范圍可以為0.8-40mm，濃度范圍可以為1-30mm，濃度范圍可以為2-20mm，濃度范圍可以為3-25mm，濃度范圍可以為4-50mm，濃度范圍可以為5-10mm，例如加入的甲酸銨水的濃度可以為0.5mm、1mm、1.5mm、2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、11mm、12mm、13mm、14mm、15mm、16mm、17mm、18mm、19mm、20mm等。

在一些實施方案中，本發(fā)明的方法中采用的流動相為0.1％甲酸10mm甲酸銨水-0.5％甲酸乙腈。在一些實施方案中，所述流動相采用上述體積比進(jìn)行。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法采用洗脫梯度包括含甲酸的甲酸銨水∶甲酸乙腈(90/10，v/v)-含甲酸的甲酸銨水∶甲酸乙腈(10/90，v/v)作為流動相進(jìn)行。為了改善色譜分離選擇性，可以考慮調(diào)節(jié)流動相的極性，向流動相中加入改性劑等。已經(jīng)觀察到采用所述流動相進(jìn)行洗脫能夠充分分離待測物質(zhì)，獲得良好的峰形和較快的分析時間。

在一些實施方案中，本發(fā)明的方法采用acquityuplcbehc18(50mm×2.1mm，1.7μm)作為分析柱進(jìn)行。在色譜法中，色譜柱的選擇十分重要，對色譜柱的要求是柱效高、選擇性好，分析速度快等。在本發(fā)明中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)acquityuplcbehc18(50mm×2.1mm，1.7μm)能夠?qū)崿F(xiàn)奧希替尼良好分離和峰型。因此，已經(jīng)觀察到采用acquityuplcbehc18(50mm×2.1mm，1.7μm)作為分析柱能夠充分分離待測物質(zhì)，獲得良好的峰形和較快的分析時間。

在一些實施方案中，本發(fā)明的方法可以采用帕唑帕尼為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行。在采用內(nèi)標(biāo)法時，內(nèi)標(biāo)物的選擇是一項十分重要的工作。理想的內(nèi)標(biāo)物應(yīng)當(dāng)能以準(zhǔn)確、已知的量加到樣品中去，和被分析的樣品有基本相同或盡可能一致的物理化學(xué)性質(zhì)(如化學(xué)結(jié)構(gòu)、極性、揮發(fā)度及在溶劑中的溶解度等)、色譜行為和響應(yīng)特征；在色譜分析條件下，內(nèi)標(biāo)物必須能與樣品中各組分充分分離。在一些實施方案中，發(fā)明人已經(jīng)顯示帕唑帕尼能夠提供線性關(guān)系良好、精密度、基質(zhì)效應(yīng)、提取回收率以及穩(wěn)定性符合要求的檢測方法。

在一些實施方案中，本發(fā)明的方法采用蛋白沉淀法進(jìn)行前處理。發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過液液萃取包括鹽析液液萃取法進(jìn)行樣品前處理時，操作繁瑣耗時，提取回收率低，并且檢測的靈敏度電較低，不能滿足臨床藥代動力學(xué)中大樣本檢測人血漿和/或腦脊液中奧希替尼的濃度的要求。本發(fā)明的研究結(jié)果顯示在本發(fā)明的條件下能夠采用蛋白沉淀法進(jìn)行樣本前處理，并且獲得令人驚訝的高回收率，從而可以避免繁瑣耗時的液液萃取過程。在本發(fā)明中，可以通過例如甲醇或乙腈進(jìn)行蛋白沉淀處理。優(yōu)選地，在本發(fā)明的條件下可以采用乙腈進(jìn)行蛋白沉淀。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用甲醇作為流動相可獲得更好的響應(yīng)，但是基線噪音也相應(yīng)增高，而且目標(biāo)化合物的信號較高，存在較為嚴(yán)重的殘留。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法能夠獲得提高的回收率。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法獲得高達(dá)80％以上的回收率。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法獲得高達(dá)85％以上的回收率。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法獲得高達(dá)90％以上的回收率。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法獲得高達(dá)95％以上的回收率。在一些實施方案中，本發(fā)明能夠得令人吃驚的高達(dá)99％的提取回收率。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法獲得的提取率能夠高達(dá)99％，并且能夠獲得高的靈敏度和避免基質(zhì)效應(yīng)。在一些實施方案中，待測人血漿和/或腦脊液樣品通過蛋白沉淀法前處理后，通過純化水進(jìn)行稀釋。在一些實施方案中，待測人血漿和/或腦脊液樣品通過蛋白沉淀法前處理后，通過乙腈進(jìn)行稀釋。在一些實施方案中，待測人血漿和/或腦脊液樣品通過蛋白沉淀法前處理后，通過乙腈水進(jìn)行稀釋。在一些實施方案中，待測人血漿和/或腦脊液樣品通過蛋白沉淀法如乙腈蛋白沉淀法前處理后，通過乙腈水進(jìn)行稀釋進(jìn)行稀釋至接近流動相流動相比例的溶劑比例。在一些實施方案中，可以采用50％乙腈水進(jìn)行稀釋。在一些實施方案中，可以稀釋至選自下述的溶劑比例：水∶乙腈(95/5，v/v)-水∶乙腈(5/95，v/v)或水∶乙腈(90/10，v/v)-水∶乙腈(10/90，v/v)。在一些實施方案中，還可以在稀釋中加入甲酸以獲得良好的峰形。在一些實施方案中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)蛋白沉淀后加入乙腈水進(jìn)行稀釋，優(yōu)選接近流動相比例的溶劑比例，可以獲得更好的峰形，并減小殘留，尤其能夠獲得提高的靈敏度。

在一些實施方案中，本發(fā)明的方法具有可接受的基質(zhì)效應(yīng)。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法具有降低的基質(zhì)效應(yīng)。

在一些實施方案中，本發(fā)明的方法具有提高的靈敏度。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法中，血漿樣品中奧希替尼在2～500ng·ml^-1和腦脊液樣品中0.5～20ng·ml^-1范圍內(nèi)線性較好。

在一些實施方案中，本發(fā)明的方法中所述流動相采用0.1-0.8ml/min的流速進(jìn)行，優(yōu)選采用0.2-0.50ml/min的流速進(jìn)行。

在一些實施方案中，本發(fā)明的方法可以采用梯度洗脫或等度洗脫進(jìn)行。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法通過梯度洗脫進(jìn)行。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法通過流動相為a：0.1％甲酸10mm甲酸銨水；b：0.5％甲酸乙腈，洗脫梯度為：0-1.0min，90％a，1.0-3.0min，90％b，3.0min-3.5min。

在一些實施方案中，血漿樣品前處理采用乙腈蛋白沉淀，經(jīng)乙腈水進(jìn)一步稀釋后用acquityuplcbehc18(50mm×2.1mm，1.7μm)色譜柱，通過0.1％甲酸10mm甲酸銨水；b：0.5％甲酸乙腈為流動相進(jìn)行分離。

本發(fā)明的方法的特異性、基質(zhì)效應(yīng)、提取回收率以及穩(wěn)定性均進(jìn)行了驗證，所述方法已經(jīng)成功應(yīng)用于臨床藥代動力學(xué)樣本的檢測。

附圖說明

圖1：奧希替尼(左)和內(nèi)標(biāo)(右)的分子結(jié)構(gòu)和二級質(zhì)譜圖。

圖2：空白血漿、含內(nèi)標(biāo)的空白血漿和lloq樣品的特征性色譜圖。

圖3：空白腦脊液、含內(nèi)標(biāo)的空白腦脊液和lloq樣品的特征性色譜圖。

具體實施方式

在本發(fā)明的方法中，可以考慮以下列優(yōu)選的條件進(jìn)行。所述方法包括以乙腈蛋白沉淀處理血漿和腦脊液的樣品，液相條件選用acquityuplcbehc18(50mm×2.1mm，1.7μm)，流動相為a：0.1％甲酸10mm甲酸銨水；b：0.5％甲酸乙腈，0.3ml·min^-1梯度洗脫。質(zhì)譜方法采用電噴霧電離，正離子多反應(yīng)監(jiān)測模式，監(jiān)測離子對：奧希替尼m/z500.38→71.88和內(nèi)標(biāo)帕唑帕尼m/z438.21→357.18。發(fā)明人按照2015年《中國藥典》中《生物樣品定量分析方法驗證指導(dǎo)原則》進(jìn)行了方法學(xué)的考察，檢測了受試者血漿和腦脊液中奧西替尼的藥物濃度，初步驗證方法的適用性。結(jié)果表面，血漿樣品中奧希替尼在2～500ng·ml^-1和腦脊液樣品中0.5～20ng·ml^-1范圍內(nèi)線性較好，r＞0.99，血漿和腦脊液樣品批間和批內(nèi)精密度范圍分別為3.9％～9.3％和3.0％～9.7％，準(zhǔn)確度范圍分別為-13.4％～2％和-9.7％～3.1％；血漿奧希替尼和內(nèi)標(biāo)的相對提取回收率分別為102％，104％和101％，腦脊液中提取回收率為106％，95％和102％，基質(zhì)效應(yīng)可接受。血漿樣品室溫放置4h，4℃進(jìn)樣器放置12h均穩(wěn)定。檢測了受試者的血漿樣品濃度為105.13±37.7ng/ml，腦脊液濃度為1.60±0.4ng/ml，血腦屏障滲透率為1.47±0.3％。發(fā)明人已經(jīng)證明本研究建立的奧希替尼檢測方法靈敏度高、重復(fù)性好，可以滿足奧希替尼治療非小細(xì)胞肺癌患者血漿和腦脊液中藥物濃度生物樣品定量分析的要求。

材料與方法

1儀器與試劑

i-class超高效液相色譜儀(美國waters公司)；xevotq-smirco三重四級桿質(zhì)譜儀(美國waters公司)，配備電噴霧離子源(esi)；acquityuplcbehc18(50mm×2.1mm，1.7μm)色譜柱；賽多利斯bt25s十萬分之一電子分析天平(德國)；

奧希替尼(純度99％)和內(nèi)標(biāo)帕唑帕尼(純度98％)標(biāo)準(zhǔn)品從北京建強(qiáng)偉業(yè)科技公司購買，乙腈(美國fhisher公司，hplc級)，異丙醇(美國fhisher公司，hplc級)，甲酸(美國fhisher公司，hplc級)，甲酸銨(美國sigmafluka公司，hplc級)；實驗用水為milli-qdirect8超純水處理系統(tǒng)(美國密理博公司)所制純化水?？瞻椎膃dta-k2血漿樣品來源于健康受試者，人工腦脊液(批號：59-7316，美國harvardapparatus公司)。

2液質(zhì)條件

液相條件：acquityuplcbehc18(50mm×2.1mm，1.7μm)色譜柱，柱溫設(shè)為35℃，流動相為a：0.1％甲酸10mm甲酸銨水；b：0.5％甲酸乙腈，洗脫梯度為：0-1.0min，90％a，1.0-3.0min，90％b，3.0min-3.5min，90％a流速設(shè)為0.3ml·min^-1，腦脊液檢測時間為3.5min，血漿同樣的洗脫條件洗脫3次，檢測時間為7.5min，進(jìn)樣量為2μl。

質(zhì)譜條件：選用電噴霧電離，正離子、mrm模式。奧希替尼和內(nèi)標(biāo)主要生成[m+h]⁺準(zhǔn)分子離子峰，mrm監(jiān)測的離子對分別為：500.38＞71.88，438.21＞357.18(二級質(zhì)譜掃描圖見圖1)。奧希替尼的碰撞能(ce)為20v，內(nèi)標(biāo)的ce為30v，兩種化合物的毛細(xì)管電壓為1.03kv，錐孔電壓34v，150℃離子源溫度和350℃脫溶劑氣溫度。

圖1顯示了奧希替尼(左)和內(nèi)標(biāo)(右)的分子結(jié)構(gòu)和二級質(zhì)譜圖。

3.標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

分別稱量奧希替尼兩份，內(nèi)標(biāo)1份，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品純度和分子式計算出稱得的標(biāo)準(zhǔn)品中奧希替尼和內(nèi)標(biāo)的含量，加入相應(yīng)體積的dmso，配置成濃度為500ug·ml^-1的標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)的儲備液。

以乙腈將奧希替尼儲備液，稀釋為20，50，100，500，1000，2000and5000ng/ml的血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液，及40，400和4000ng/ml的質(zhì)控工作溶液。5，15，20，50，100和200ng/ml的腦脊液標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液，及10，40和160ng/ml的質(zhì)控工作溶液。同時，使用乙腈將內(nèi)標(biāo)儲備液稀釋為100ng/ml(腦脊液)和500ng/ml(血漿)兩種濃度的工作溶液。

以上溶液均置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4樣品的前處理

2.0mlep管中加入20μl內(nèi)標(biāo)工作液和10μl工作液，常溫吹干，加入100μl空白血漿后渦旋混勻30s，12000rpm離心5min，再加入400μl乙腈渦旋混勻30s，12000rpm離心15min，吸取20μl上清液加入180μl50％乙腈水稀釋(腦脊液)，吸取20μl上清液加入380μl50％乙腈水稀釋(血漿)渦旋30s，12000rpm離心5min，取90μl上清進(jìn)樣檢測。

5方法學(xué)考察內(nèi)容

根據(jù)2015年新版《中國藥典》中《生物樣品定量分析方法驗證指導(dǎo)原則》對檢測方法進(jìn)行方法學(xué)驗證，以確保檢測的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性和穩(wěn)定性。驗證包括以下內(nèi)容：特異性、標(biāo)準(zhǔn)曲線、精密度和準(zhǔn)確度、基質(zhì)效應(yīng)、提取回收率、穩(wěn)定性。

6.臨床試驗樣本適用性實驗

入選了1例非小細(xì)胞肺癌的女性患者，53歲，伴有腦膜轉(zhuǎn)移，具有顯示egfr19號外顯子突變?？诜W希替尼每天80mg一次。采集腦脊液和相應(yīng)的配對的全血樣本。靜脈血和腦脊液采集后立即3000rpm，4℃離心10min，上層血漿和腦脊液分裝后凍存于-80℃冰箱中。通過檢測1例20mg·m^2-1劑量組受試者血藥濃度，初步驗證檢測方法的適用性。

結(jié)果與討論

1特異性

以6個個體的空白血漿分別配制空白樣品、含內(nèi)標(biāo)的空白樣品以及低定量下限(lowerlimitofquantitation，lloq)濃度的樣品。三種樣品經(jīng)前處理后進(jìn)樣檢測獲得譜圖(特征性譜圖如圖2、圖3)。如圖所示，奧希替尼和內(nèi)標(biāo)的保留時間分別為：1.08和1.03min。在保留時間附近均未見有干擾峰，lloq濃度時信噪比均大于10。

圖2顯示了空白血漿、含內(nèi)標(biāo)的空白血漿和lloq樣品的特征性色譜圖。

圖3顯示了空白腦脊液、含內(nèi)標(biāo)的空白腦脊液和lloq樣品的特征性色譜圖。

2標(biāo)準(zhǔn)曲線

10μl標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液加20μl內(nèi)標(biāo)工作液在2.0mlep管中，常溫吹干，再加入100μl空白血漿，配置2，5，10，50，100，200and500ng/ml的血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線，及4，40和400ng/ml的質(zhì)控溶液。0.5，1.5，2，5，10和20ng/ml的腦脊液標(biāo)準(zhǔn)曲線，及1，4和16ng/ml的質(zhì)控溶液?？疾烊齻€批次的標(biāo)準(zhǔn)曲線，用1/x²加權(quán)線性回歸計算標(biāo)準(zhǔn)曲線。奧希替尼2～500ng·ml^-1和0.5～20g·ml^-1范圍線性良好，相關(guān)系數(shù)r均大于0.99。

3精密度和準(zhǔn)確度

lloq、低、中、高質(zhì)控濃度樣品各5個，經(jīng)處理后進(jìn)樣檢測。通過測得濃度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(rsd％)和準(zhǔn)確度偏倚(bias％)考察1個檢測批內(nèi)以及多個檢測批間的精密度和準(zhǔn)確度。奧希替尼3個濃度的批內(nèi)和批間rsd％和bias％均在15％以內(nèi)，lloq濃度均在20％以內(nèi)，方法定量的精密度和準(zhǔn)確度較好，符合指導(dǎo)原則的要求(見表1)。

表1奧希替尼血漿和腦脊液批內(nèi)和批間精密度和準(zhǔn)確度

4基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率

對照組(set1)樣品的制備：于2.0ml離心管中加入100ul純水，再加入奧希替尼濃度分別為4ng/ml，400ng/ml(血漿)和1ng/ml，16ng/ml(腦脊液)的質(zhì)控混合工作液10ul，以及內(nèi)標(biāo)溶液20ul，精密加入400ul乙腈，渦旋混勻，于12000rpm離心15min，吸取20μl上清液180μl50％乙腈水稀釋(腦脊液)，加入380μl50％乙腈水稀釋(血漿)渦旋30s，12000rpm離心，5min，吸取90ul上清液加入到進(jìn)樣瓶中，取2ul進(jìn)行l(wèi)c-ms/ms分析。每濃度制備3份樣品，記錄色譜圖，記錄奧希替尼峰面積(a)，計算其平均值as，記錄各組內(nèi)標(biāo)峰面積(b)，求其平均值(bs)。

對照組(set2)樣品的制備：2.0ml的ep管中精密加入100ul6個不同個體空白血漿和6個不同瓶裝的人工腦脊液，加入400ul乙腈，渦旋振蕩30s，于12000rpm離心15min，取全部上清于新的ep管中，再加入10ul濃度為4ng/ml，400ng/ml(血漿)和1ng/ml，16ng/ml(腦脊液)質(zhì)控樣品，再精密加入內(nèi)標(biāo)溶液20ul，渦旋混勻后，吸取20μl上清液180μl50％乙腈水稀釋(腦脊液)，加入380μl50％乙腈水稀釋(血漿)渦旋30s，12000rpm離心，5min，吸取90ul上清液加入到進(jìn)樣瓶中，取2ul進(jìn)行l(wèi)c-ms/ms分析。記錄色譜圖，記錄各濃度奧希替尼的峰面積am，求其平均值am′，記錄所有濃度中的內(nèi)標(biāo)峰面積bm，求其平均值bm′。

實驗組(set3)樣品的制備：按“血漿樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線”測定方法配制成血漿和腦脊液濃度分別為4ng/ml，400ng/ml和1ng/ml，16ng/ml的低、高兩種不同濃度的血漿樣本各6份，按“2.4血漿樣品的處理”項下操作，進(jìn)行l(wèi)c-ms/ms分析，記錄色譜圖。記錄各濃度樣品的奧希替尼的峰面積ai，記錄所有內(nèi)標(biāo)峰面積bi，

將ai、bi和am′、bm′代入下式即可求得奧希替尼和內(nèi)標(biāo)的相對提取回收率(rr％)：

奧希替尼：rr％＝ai/am′×100％；

內(nèi)標(biāo)：rr％＝bi/bm′×100％；

將am、bm和as、bs代入下式即可求得奧希替尼和內(nèi)標(biāo)基質(zhì)因子(mf％)：

奧希替尼：mf％＝am/as×100％；

m1：mf％＝bm/bs×100％；

待測物與內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)因子之比為內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)因子(mf’％)，6個個體內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)因子cv應(yīng)小于15％。

表2奧希替尼和內(nèi)標(biāo)基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率

5穩(wěn)定性

5.1室溫穩(wěn)定性

低、高質(zhì)控樣品5份，避光置于室溫4h，處理后進(jìn)樣檢測，以新鮮配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，考察血漿樣品的室溫穩(wěn)定性。

5.24℃穩(wěn)定性

低、高質(zhì)控各5份處理后置于4℃冰箱中12h，12h后以新鮮制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。奧希替尼在處理后溶液中進(jìn)樣器4℃放置12h穩(wěn)定。

表3奧希替尼穩(wěn)定性數(shù)據(jù)

6臨床應(yīng)用

入選了1例非小細(xì)胞肺癌的女性患者，53歲，伴有腦膜轉(zhuǎn)移，具有顯示egfr19號外顯子突變?？诜W希替尼每天80mg一次。于開始服藥后第一周、第五周、第七周和第15周采集一次腦脊液和相應(yīng)的配對的全血樣本。共采集了4次腦脊液和全血樣本。檢測了患者的血漿和腦脊液的藥物濃度，并計算了血腦屏障透過率，結(jié)果見表4，血漿中藥物濃度為105.13±37.7ng/ml，腦脊液藥物濃度為1.47±0.4ng/ml，腦脊液濃度比血漿濃度滲透率為1.47±0.3％.結(jié)果顯示，腦脊液中的濃度低于血漿中的藥物濃度。同時，顯示血漿藥物濃度和腦脊液中的藥物濃度呈正相關(guān)。比較了一代的tki藥物厄洛替尼的血腦屏障透過率為2.0±0.5％[14]，吉非替尼的血腦屏障透過率為1.3±0.7％[15]，該例患者的滲透率居于兩者之間，但是由于我們實驗?zāi)壳爸患{入了1例患者，對于奧希替尼的血腦屏障透過率的研究，還需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗證。

表4血漿和腦脊液中的藥物濃度

討論

egfr-tki對于具有egfr敏感突變的患者具有很好的療效。但是一代和二代egfr-tki藥物治療過程中的耐藥是普遍存在的問題，t790m突變是發(fā)生耐藥最主要的原因。奧希替尼是一種新型的三代的egfr-tki藥物，用于治療egfrt790m突變的非小細(xì)胞肺癌患者的治療[8]。最近的研究也證實了其在腦轉(zhuǎn)移患者中的療效。在aur3的臨床試驗中，144例具有腦轉(zhuǎn)移的患者，接受奧西他濱的患者的無疾病進(jìn)展生存期的中位時間要長于接受鉑類加培美曲塞治療的患者[9]。故建立奧希替尼血藥濃度和腦脊液濃度的檢測方法對于奧希替尼的臨床研究具有重要意義。

在方法建立的過程中，標(biāo)準(zhǔn)品存在嚴(yán)重的殘留，開始使用甲醇作為流動相可獲得更好的響應(yīng)，但是基線噪音也相應(yīng)增高，而且目標(biāo)化合物的信號較高，存在較為嚴(yán)重的殘留。為了結(jié)果殘留問題，研究者將強(qiáng)洗脫液改為了50％乙腈和異丙醇，并在其加入0.2％甲酸，殘留有改善，標(biāo)準(zhǔn)曲線最高點后的空白樣品殘留峰面積高達(dá)lloq的1/3。同時由于色譜峰存在拖尾。替換為乙腈蛋白沉淀，并最終使用乙腈蛋白沉淀后加入50％乙腈水進(jìn)行稀釋，處理后樣品的溶劑組成可以影響目標(biāo)化合物的峰形和殘留情況。接近流動相比例的溶劑比例，可以獲得更好的峰形，并減小殘留。

目前并未有關(guān)于人血漿和/或腦脊液中奧希替尼檢測的方法報道，已有研究者使用了液相聯(lián)用檢測人血漿和/或腦脊液中奧希替尼的檢測，其使用的是鹽析液液萃取的前處理方法，相較于本發(fā)明人開發(fā)的使用的蛋白沉淀的前處理方法，該方法樣本處理簡單、快捷，且具有良好的重復(fù)性，適合大通量的臨床樣品檢測。并且目前沒有人腦脊液中奧希替尼的檢測方法的報道。

根據(jù)1例臨床樣本的實驗結(jié)果，初步分析了奧希替尼的血腦屏障透過率，但是由于該方法只用于了1例患者的研究。對于奧希替尼的真正的血腦屏障透過率還需要再下一步的研究中，入組更多的患者進(jìn)行驗證。本研究首次建立的用uplc-ms/ms檢測人血漿和/或腦脊液和人腦脊液中奧希替尼方法，靈敏、穩(wěn)定且重復(fù)性好，可較好的應(yīng)用于奧希替尼的臨床藥代動力學(xué)研究生物樣品的檢測。