本發(fā)明涉及獸藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種從雞組織中同時(shí)提取二硝托胺及其代謝產(chǎn)物3-anot殘留的方法。

背景技術(shù)：

在對(duì)動(dòng)物源性食品中的獸藥殘留進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，只有將藥物從樣品中提取出來(lái)，才可能建立起高效的檢測(cè)方法。二硝托胺為淡黃色或淡黃褐色粉末狀固體，無(wú)臭，味苦，在丙酮中溶解，在乙醇中微溶，在氯仿或乙醚中極微溶解，在水中不溶。其在雞組織中的代謝產(chǎn)物為3-氨基-5-硝基鄰甲苯酰胺(3-anot)，3-anot易溶于丙酮、乙腈、甲醇和水。國(guó)內(nèi)外關(guān)于從雞組織中同時(shí)提取二硝托胺及其代謝產(chǎn)物3-anot的提取方法主要為液液萃取法，提取劑一般為磷酸鹽緩沖液和乙腈溶液，該方法普遍存在：萃取過(guò)程中易發(fā)生乳化現(xiàn)象，結(jié)果的重現(xiàn)性差；回收率的高低在很大程度上取決于操作人員掌握該技術(shù)的熟練程度等。但到目前為止，采用加速溶劑萃取法從雞組織中同時(shí)提取二硝托胺及其代謝產(chǎn)物3-anot殘留的方法在國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。由于加速溶劑萃取法具有溶劑用量少、萃取速度快、效率高、回收率高、重現(xiàn)性好和自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)，可取代索氏提取、超聲萃取、手工振搖(分液漏斗)、煮沸法和其它傳統(tǒng)萃取方法。所以本研究采用極性較大、沉淀蛋白效果好的有機(jī)溶劑乙腈作為萃取溶劑，在合適的溫度、壓力條件下，采用加速溶劑萃取法從雞組織中同時(shí)提取二硝托胺及其代謝產(chǎn)物3-anot的殘留。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決從雞組織中同時(shí)提取二硝托胺及其代謝產(chǎn)物3-anot的問(wèn)題，本研究提供了一種從雞組織中同時(shí)提取二硝托胺及其代謝產(chǎn)物3-anot的新的提取方法——加速溶劑萃取法。該提取方法節(jié)省萃取溶劑、樣品基質(zhì)影響小、提取效率和回收率高，且整個(gè)過(guò)程快速、方便和自動(dòng)化。

為高效同時(shí)提取雞組織中二硝托胺及其代謝產(chǎn)物3-anot的殘留,本研究對(duì)加速溶劑萃取儀的萃取溫度和靜態(tài)萃取次數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：

一種從雞組織中同時(shí)提取二硝托胺及其代謝產(chǎn)物殘留的方法，包括以下步驟：

(1)取均質(zhì)后的雞組織樣品與硅藻土研磨混勻裝填入萃取池，80℃、1500psi條件下，在線去脂與二硝托胺及其代謝產(chǎn)物3-anot萃取連續(xù)進(jìn)行；所述萃取以乙腈作為萃取劑。

(2)萃取液用干浴氮吹儀氮吹至干，用二氯甲烷-丙酮溶液溶解，作為上樣液，過(guò)中性氧化鋁固相萃取小柱；

(3)固相萃取小柱先依次用丙酮、二氯甲烷-丙酮溶液活化平衡，上樣后待上樣液勻速流干后，再用二氯甲烷-丙酮溶液沖洗上樣后的聚丙烯離心管，并作為淋洗液置入固相萃取小柱的樣品管中，使其勻速全部流出，待小柱干燥后，最終用甲醇-丙酮溶液洗脫。

(4)洗脫液用離線濃縮儀真空負(fù)壓濃縮至干，上機(jī)前用二氯甲烷-丙酮溶液渦旋振蕩溶解殘?jiān)仉x心，上層液體過(guò)0.22μm濾膜，濾液供分析使用。

本發(fā)明方法中，所述在線去脂用正己烷作為除脂劑。

其中，步驟(2)中二氯甲烷-丙酮的體積比8︰2；步驟(3)中二氯甲烷-丙酮的體積比7︰3；甲醇-丙酮的體積比8︰2；步驟(4)中二氯甲烷-丙酮的體積比8︰2。

通過(guò)本發(fā)明方法得到的濾液僅供氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(gc-ms/ms)分析使用。

本發(fā)明比較了不同提取劑(乙腈、丙酮和乙酸乙酯)、不同提取方法(液液萃取法和加速溶劑萃取法)對(duì)提取回收率的影響(詳見(jiàn)表1和表2)，最終選擇乙腈溶液為提取劑，加速溶劑萃取法提取雞組織中二硝托胺及其代謝產(chǎn)物3-anot殘留。二硝托胺及其代謝產(chǎn)物3-anot的提取回收率均達(dá)到81.96％以上。詳見(jiàn)表4和表5。

附圖說(shuō)明

圖1是溫度對(duì)雞肌肉中二硝托胺提取效率的影響。

圖2是溫度對(duì)雞肌肉中3-anot提取效率的影響。

具體實(shí)施方式

1.實(shí)驗(yàn)雞的飼養(yǎng)和樣品采集

從江蘇京海禽業(yè)集團(tuán)有限公司選取112d的京海黃雞10只(公、母各半)，單籠飼養(yǎng)，飼喂來(lái)自揚(yáng)州市揚(yáng)大飼料廠的不含任何藥物的全價(jià)飼料，自由飲水，飼養(yǎng)2周后屠宰。屠宰后，分別取供試雞的胸肌肉、肝臟、腎臟、皮膚+脂肪，分別將其攪碎并充分混勻作為空白樣品，分裝，密封，于-35℃冰箱中保存。

從江蘇京海禽業(yè)集團(tuán)有限公司選取196d的京海黃雞產(chǎn)蛋雞20只，單籠飼養(yǎng)，飼喂來(lái)自揚(yáng)州市揚(yáng)大飼料廠的不含任何藥物的全價(jià)飼料，自由飲水。飼養(yǎng)2周后，連續(xù)收集10d雞蛋，并置于4℃冰箱中暫時(shí)保存。樣品采集完畢后，分別去蛋殼并將蛋清、蛋黃和全蛋勻漿后分別作為空白蛋清、蛋黃和全蛋樣品，分裝，密封，于-35℃冰箱中保存。

2.提取溫度和萃取次數(shù)的優(yōu)化

由圖1和圖2可知，溫度為80℃時(shí)，乙腈對(duì)雞肌肉中二硝托胺和3-anot的提取效率最高，雜質(zhì)干擾較少。因此本試驗(yàn)的提取溫度設(shè)為80℃。此外，本研究還比較了靜態(tài)萃取次數(shù)分別為1和2時(shí)雞組織中二硝托胺及其代謝產(chǎn)物3-anot的提取效率。結(jié)果表明：靜態(tài)萃取次數(shù)為2時(shí)，雞組織中二硝托胺及其代謝產(chǎn)物3-anot的回收率較高。

3.不同提取方法和提取溶劑的比較

由表1可知，乙腈對(duì)二硝托胺提取回收率(>86％)顯著高于乙酸乙酯(>60.％)和丙酮(>40％)。加速溶劑萃取法的提取回收率高于液液萃取法。

表1不同提取方法和提取溶劑對(duì)二硝托胺提取回收率的比較(％)

由表2可知，乙腈對(duì)3-anot提取回收率(>83％)顯著高于乙酸乙酯(>70％)和丙酮(>60％)。加速溶劑萃取法的提取回收率高于液液萃取法。

表2不同提取方法和提取溶劑對(duì)3-anot提取回收率的比較(％)

4.本發(fā)明提取與凈化步驟

1)準(zhǔn)確稱取(2.0±0.02)g均質(zhì)好的空白組織樣品，在研缽中與3.0g左右硅藻土研磨至粉狀混勻后，裝填入22ml不銹鋼萃取池；

2)在80℃和1500psi條件下，每個(gè)萃取池萃取首先使用正己烷萃取一次(5min)，去脂用，收集液棄掉，再使用純乙腈萃取2次(10min)，萃取用，萃取液收集于60ml收集瓶，轉(zhuǎn)移至50ml聚丙烯離心管；

3)將裝有萃取液的50ml的聚丙烯離心管置于40℃的干浴氮吹儀上氮吹至干，然后用2ml的二氯甲烷-丙酮(8︰2，v/v)溶液溶解，作為上樣液；

4)依次分別用10.0ml丙酮和10.0ml二氯甲烷-丙酮(7︰3，v/v)溶液將中性氧化鋁固相萃取小柱活化；

5)向活化后的固相萃取小柱中加入上樣液，勻速流干后，用2ml二氯甲烷-丙酮(7︰3，v/v)溶液沖洗上樣后的50ml的聚丙烯離心管，并作為淋洗液置入固相萃取小柱的樣品管中，使其勻速全部流出；

6)待固相萃取小柱干燥后，用15ml甲醇-丙酮(8︰2，v/v)溶液分5次洗脫，洗脫液收集于50ml聚丙烯離心管；

7)將離心管置于離心濃縮儀中，40℃真空負(fù)壓濃縮至干；

8)用2ml的二氯甲烷-丙酮(8︰2，v/v)溶解殘?jiān)?肝臟樣品用16ml的二氯甲烷-丙酮(8︰2，v/v)溶解殘?jiān)u蛋清和雞蛋黃樣品用18ml的二氯甲烷-丙酮(8︰2，v/v)溶解殘?jiān)?，旋渦震蕩使基質(zhì)混勻，12000×g，常溫離心10min，上層液體過(guò)0.22μm濾膜，濾液供gc-ms/ms分析。

5.回收率和精密度的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取2.0±0.02g勻質(zhì)后的空白組織樣品于研缽中，分別加入二硝托胺和3-anot混合對(duì)照品工作液適量(對(duì)應(yīng)在雞肌肉、蛋清和蛋黃中添加濃度為loq、1500.0、3000.0、6000.0μg/kg；對(duì)應(yīng)在雞肝臟和腎臟中添加濃度為loq、3000.0、6000.0、12000.0μg/kg；對(duì)應(yīng)在雞皮膚+脂肪中添加濃度為loq、1000.0、2000.0、4000.0μg/kg；)，與硅藻土研磨混勻裝填入22ml萃取池，每個(gè)添加水平設(shè)置6個(gè)平行，經(jīng)提取和凈化處理后(除loq水平外，雞肌肉、腎臟和皮膚+脂肪上機(jī)液分別用空白基質(zhì)液稀釋50、100、40倍，肝臟用空白基質(zhì)液稀釋10倍，蛋清、蛋黃和全蛋分別用空白基質(zhì)液稀釋50、10、10倍)，在合適的氣相色譜和質(zhì)譜分析條件下(以高純氦氣為載氣，流速為0.8ml/min，程序升溫模式，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣體積：1.0μl；采用電子轟擊離子源，全掃描方式定性，選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式定量)，進(jìn)行g(shù)c-ms/ms分析，計(jì)算添加回收率。

日內(nèi)精密度測(cè)定：在同日內(nèi)不同時(shí)間用同一條標(biāo)準(zhǔn)曲線及同一臺(tái)儀器6次重復(fù)測(cè)定上述添加濃度的樣品，求得日內(nèi)(批內(nèi))精密度。

日間精密度測(cè)定：在一周內(nèi)不同日以不同的標(biāo)準(zhǔn)曲線及同一臺(tái)儀器6次重復(fù)測(cè)定上述添加濃度的樣品，求得日間(批間)精密度。

色譜柱：vf-5ht(30m×0.25mmi.d.×0.1μm)；載氣：高純氦氣(>99.999％，60psi)，載氣柱流速：0.8ml/min；程序升溫參數(shù)：120℃保持1min，20℃/min升至240℃，保持1min，10℃/min升至320℃，保持1min。進(jìn)樣口溫度：340℃；分流模式：不分流進(jìn)樣，分流流量：50.0ml/min；2min后開(kāi)閥(載氣節(jié)省時(shí)間2min，載氣節(jié)省流量20ml/min)；不分流時(shí)間：1.0min；進(jìn)樣體積：1.0μl。

電離模式：電子轟擊(ei)；電子束能量(電離能)：70ev；碰撞氣：高純氬氣(>99.999％，40psi)；離子源溫度：320℃；傳輸線溫度：320℃；溶劑延遲：4.0min；采集數(shù)據(jù)方式：全掃描(fullscan)方式定性，選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(autosrm)方式定量。二硝托胺及其代謝產(chǎn)物3-anot的分子質(zhì)量和質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表3。

表3二硝托胺及其代謝產(chǎn)物3-anot的分子量和質(zhì)譜參數(shù)

注：^*定量離子對(duì)

將添加樣品所得二硝托胺定量離子對(duì)m/z118.0＞64.0、3-anot定量離子對(duì)m/z178.0＞104.0的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中求得濃度，與實(shí)際添加的分析物的濃度相比求得添加回收率。

在此條件下，本發(fā)明方法提取雞組織中二硝托胺及其代謝產(chǎn)物3-anot的添加回收率及精密度見(jiàn)表4和表5。

由表4和表5可知，當(dāng)二硝托胺及其代謝產(chǎn)物3-anot添加水平分別為定量限(loq)、0.5mrl(最高殘留限量)、1mrl、2mrl時(shí)，雞組織樣品中二硝托胺及其代謝產(chǎn)物3-anot的平均回收率均在81.96％-94.31％之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在1.72％-5.37％之間，日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在1.87％-5.74％之間，日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在3.34％-7.36％之間。

表4雞組織中二硝托胺的添加回收率和精密度(n＝6)

注：a.最高殘留限量

表5雞組織中3-anot的添加回收率和精密度(n＝6)

注：a.最高殘留限量。