本發(fā)明涉及一種用于檢測深部真菌的方法，具體的說是一種基于對比染色的深部真菌形態(tài)學快速檢測方法。本發(fā)明還涉及一種基于對比染色的深部真菌形態(tài)學快速檢測試劑。
背景技術：
：隨著近些年來環(huán)境污染的不斷惡化，真菌感染人群也在不斷擴大。真菌感染者由以往的繼發(fā)感染人群，發(fā)展為目前的原發(fā)性真菌感染“正?！比巳?由環(huán)境、職業(yè)、過勞等因素誘發(fā))。此外，伴有基礎疾病的患者和老年人，如糖尿病患者均為真菌感染的易感人群，現(xiàn)代介入技術及外科手術治療的廣泛應用也給真菌感染創(chuàng)造了條件。目前，檢測深部真菌有以下四種方法：體液直接涂片形態(tài)學檢測、血清學檢測、病原菌基因檢測以及病理學檢測。體液直接涂片形態(tài)學檢測為目前主要的深部真菌檢測的方法，主要依靠可獲得的體液或分泌物涂片檢測及培養(yǎng)鑒定，但由于所獲得的體液或分泌物來源于與外界相通的內(nèi)體表(即管腔黏膜)，無法與空氣隔離，易于污染，導致其檢測結(jié)果特異性差，不能反映深部感染真實情況，且真菌培養(yǎng)耗時長，一般需要2周以上，培養(yǎng)的陽性率極低，不能快速檢測而便于后續(xù)的臨床搶先治療。血清學檢測包括血清半乳甘露聚糖檢測(簡稱gm試驗)和1，3β-d-葡聚糖檢測(簡稱g試驗)，其目前已應用于臨床深部真菌感染與否的檢測及治療反應的監(jiān)測，為臨床抗真菌的搶先治療提供了快速有效的依據(jù)，但由于其應用受多種因素的影響，容易出現(xiàn)假陽性，且敏感度和檢測菌種的覆蓋面有限，以及受到醫(yī)院條件和患者經(jīng)濟條件的限制，使真菌深部感染的檢測困難。病原菌基因?qū)W檢測亦受多種因素的影響，因其假陽性率高，不能作為確診的金標準。病理學檢測則往往需要創(chuàng)傷性手段取材致使臨床上極少采用。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一目的是為了克服
背景技術：
的不足之處，而提供一種基于對比染色的深部真菌形態(tài)學快速檢測方法。本發(fā)明的第二目的是為了克服
背景技術：
的不足之處，而提供一種基于對比染色的深部真菌形態(tài)學快速檢測試劑。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案為：基于對比染色的深部真菌形態(tài)學快速檢測方法，其特征在于：它包括如下步驟，步驟一：無菌處理檢測深部真菌所需的器具，并無菌保存檢測所需的器具；步驟二：用1-2ml規(guī)格注射器取被檢測者肘靜脈血約1毫升；步驟三：先在無菌環(huán)境中將一滴未凝固的靜脈血滴入盛有0.8ml檢測試劑的安瓿瓶中，然后輕搖安瓿瓶直至靜脈血在安瓿瓶內(nèi)呈均勻分布，最后將安瓿瓶靜置20分鐘，使芝加哥天藍對靜脈血進行染色；其中，0.8ml檢測試劑的制備方法為：先將0.8-1.5克芝加哥天藍粉劑溶入100ml無菌生理鹽水中，然后將芝加哥天藍和生理鹽水的混合液經(jīng)一次性針頭濾器過濾消毒，接著將芝加哥天藍和生理鹽水的混合液放入到經(jīng)過無菌處理的安瓿瓶中，最后將帶有芝加哥天藍的無菌生理鹽水以每安瓿0.8ml分裝于規(guī)格為5ml的安瓿瓶中備用；步驟四：對載玻片和蓋玻片進行無菌處理或消毒處理；其中，對載玻片和蓋玻片進行無菌處理或消毒處理的方式可以為如下兩種中的一種，其中，第一種對載玻片和蓋玻片進行無菌處理或消毒處理的方式為：先在75％酒精溶液中將載玻片和蓋玻片浸泡3個小時以上，然后在制片時用酒精燈對載玻片和蓋玻片進行燃燒消毒，接著將載玻片和蓋玻片放置于直徑大于100mm的無菌密封容器中進行冷卻，直至染色完成；第二種對載玻片和蓋玻片進行無菌處理或消毒處理的方式為：將載玻片和蓋玻片直接放置在超凈臺中進行紫外線消毒并無菌保存，直至染色完成；步驟五：用1ml規(guī)格的一次性無菌注射器或無菌滴管吸取安瓿內(nèi)已染色的混合液，在無菌條件下將一滴經(jīng)過染色的混合液滴于步驟四中的載玻片上，蓋上蓋玻片；步驟六：當蓋上蓋玻片后，工作人員先依次通過4倍物鏡、10倍物鏡、40倍物鏡及100倍油鏡對載玻片上的混合液進行觀察，再由500萬以上像素的目鏡放大，然后用高分辨率顯像軟件將載玻片上的混合液的圖像顯示于電腦屏幕，最后工作人員在電腦上對載玻片上的混合液進行觀察記錄。為了實現(xiàn)上述第二目的，本發(fā)明的技術方案為：基于對比染色的深部真菌形態(tài)學快速檢測試劑，它由芝加哥天藍粉劑和無菌生理鹽水混合而成，所述芝加哥天藍粉劑與無菌生理鹽水的重量比為(0.8～1.5):100。在上述技術方案中，它由芝加哥天藍粉劑和無菌生理鹽水混合而成，所述芝加哥天藍粉劑與無菌生理鹽水的重量比為1:100?，F(xiàn)有的用于檢測深部真菌的方法均有缺陷，而真菌為真核細胞，形態(tài)學檢測是真菌的主要檢測方法，目前缺乏特異性高的針對深部真菌的形態(tài)學檢測的有效方法，其原因為：①傳統(tǒng)的臨床思維缺乏對真菌從外界侵入人體深部的過程中必血液感染這一過程的認識，認為要在血液中找到真菌如同大海撈針，從而忽略了對血液深部真菌形態(tài)學檢測的研究。②血培養(yǎng)真菌陽性率極低，也是長期以來臨床上忽略深部真菌感染菌血癥過程的原因，加深了血液中能找到真菌的可能性極低的固有思維。③現(xiàn)有的血液及體液的細胞形態(tài)學檢測為外周血或體液涂片染色后靜態(tài)的細胞形態(tài)學檢測，其檢測范圍僅限于有限的正?；虿B(tài)血細胞(如白血病細胞等)和少量微生物(如瘧原蟲及組織胞漿菌等)。也由于深部真菌感染的培養(yǎng)陽性率極低，不能與現(xiàn)有的靜態(tài)細胞涂片形態(tài)學方法中所見的細胞與相關結(jié)構互相對應，導致顯微鏡下的形態(tài)學鑒別的困難。④現(xiàn)有的細胞學檢測的涂片方法為非無菌操作，涂片污染不可避免，也使得涂片檢測真菌結(jié)果可信度不高。⑤更重要的是，本發(fā)明者在長期的對深部真菌感染的研究過程中發(fā)現(xiàn)，真菌感染的發(fā)生率比現(xiàn)有臨床所認識的發(fā)生率高得多，觀察血液中活體細胞能非常容易而清晰地發(fā)現(xiàn)和鑒別真菌實體及相關結(jié)構，如菌絲、子孢子及菌團。但由于真菌實體的構成成分與人體的正常細胞(如紅細胞和血小板)的構成成分相似，導致現(xiàn)有的細胞學涂片檢測中所用的染色方法在靜態(tài)細胞檢測中不能區(qū)分真菌實體與人類的正常細胞(紅細胞及血小板)，這也是現(xiàn)有臨床上忽略真菌感染，導致深部真菌感染檢測困難的重要原因之一。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果如下：1、與現(xiàn)有的各類真菌檢測方法相比，本發(fā)明所需的檢測時間短，準確率高，細胞及其相關結(jié)構輪廓清晰，色澤深淺有別，可清晰的顯示菌絲及孢子，紅細胞表面的棘刺等，是一種簡單、快捷、有效的真菌形態(tài)學檢測方法，可推廣至基層醫(yī)院。2、本發(fā)明即針對深部真菌感染，通過對感染血液和體液中真菌菌絲的特異性對比染色，動態(tài)檢測血液及體液中活體真菌實體及其相關結(jié)構(菌絲和孢子)。3、由于本發(fā)明能夠快速準確的幫助臨床醫(yī)生判斷被檢測者是否感染深部真菌，且由于現(xiàn)有的深部真菌檢測方法中尚缺乏血液形態(tài)學的快速檢測，而深部侵襲性真菌感染具有較高的死亡率(12小時內(nèi)即行抗真菌治療的死亡率為11％，而超過12小時開始抗真菌治療的死亡率為33％)，故本發(fā)明具有良好的社會效益和市場前行。4、本發(fā)明可以使工作人員在計算機輔助設備(高分辨率電子照相設備)的支持下，通過顯微鏡清晰地觀察到肉眼難以觀察到血液中各種有形成分，可為臨床精準快治療提供可靠的判斷依據(jù)。其中，上述血液中各種有形成分不僅包括正常和病理狀態(tài)下的人血細胞及其功能狀態(tài)，異形真核微生物細胞，還包括肉眼不可視的各種形態(tài)和性質(zhì)的導致血液循環(huán)障礙的成分，如血栓、菌栓、漂浮菌絲(團)以及各種附壁結(jié)構(如附壁菌絲、芽生孢子等)。由于是無菌操作，因此能客觀地反映體內(nèi)深部真菌感染的真實情況。5、由于本發(fā)明可在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)肉眼不可見的微小菌栓，可在發(fā)現(xiàn)肉眼可視的附壁栓子之前快速檢測可導致微循環(huán)障礙的微小菌栓或血栓。同時，本發(fā)明還可應用于獻血者的快速篩選以及輸血前血液的檢測，快速發(fā)現(xiàn)所輸血液中真菌孢子及菌絲的情況。附圖說明圖1為本發(fā)明的流程圖。圖2為某正常人的血液(不含真菌)經(jīng)過芝加哥天藍染色后的圖像。圖3為菌絲未被染色時的圖像。圖4為菌絲經(jīng)過芝加哥天藍染色后的圖像。圖5為采用體液培養(yǎng)直接涂片形態(tài)學檢測的方式檢測真菌時，樣本經(jīng)過2周的培養(yǎng)后在顯微鏡下的圖像。圖6為在采用與圖5中同樣的體液樣本后，同一被檢測者經(jīng)過本發(fā)明所述的檢測方法進行檢測后的圖像。圖7為某個被確定為血液中含有真菌的被檢測者，經(jīng)過本發(fā)明對其血液樣本檢測后的圖像。圖8為采用半乳糖甘露醇聚糖抗原檢測(gm試驗)的方式檢測真菌時的圖像。圖9為在采用與圖8同樣的體液樣本后，同一被檢測者經(jīng)過本發(fā)明所述的檢測方法進行檢測后的圖像。圖10為采用本發(fā)明所述的檢測方法檢測胸水中是否有真菌的圖像。圖11為采用本發(fā)明所述的檢測方法檢測腦脊液中是否有真菌的圖像。圖12為激惹白細胞的圖像。圖中1-正常紅細胞，2-正常白細胞，3-正常血小板，4-菌絲，5-異常紅細胞，6-孢子及子孢子，7-激惹白細胞，8-纖維滲出物，9-晶體。具體實施方式下面結(jié)合附圖詳細說明本發(fā)明的實施情況，但它們并不構成對本發(fā)明的限定，僅作舉例而已。同時通過說明使本發(fā)明的優(yōu)點更加清楚和容易理解。參閱附圖可知：基于對比染色的深部真菌形態(tài)學快速檢測方法，其特征在于：它包括如下步驟，步驟一：無菌處理檢測深部真菌所需的器具，并無菌保存檢測所需的器具；步驟二：用1-2ml規(guī)格注射器取被檢測者肘靜脈血約1毫升；步驟三：先在無菌環(huán)境中將一滴未凝固的靜脈血滴入盛有0.8ml檢測試劑的安瓿瓶中(稀釋15倍)，然后輕搖安瓿瓶直至靜脈血在安瓿瓶內(nèi)呈均勻分布，最后將安瓿瓶靜置20分鐘，使芝加哥天藍對靜脈血進行染色；其中，0.8ml檢測試劑的制備方法為：先將0.8-1.5克芝加哥天藍粉劑溶入100ml無菌生理鹽水中，然后將芝加哥天藍和生理鹽水的混合液經(jīng)一次性針頭濾器過濾消毒，接著將芝加哥天藍和生理鹽水的混合液放入到經(jīng)過無菌處理的安瓿瓶中，最后將帶有芝加哥天藍的無菌生理鹽水以每安瓿0.8ml分裝于規(guī)格為5ml的安瓿瓶中備用；步驟四：對載玻片和蓋玻片進行無菌處理或消毒處理；其中，對載玻片和蓋玻片進行無菌處理或消毒處理的方式可以為如下兩種中的一種，其中，第一種對載玻片和蓋玻片進行無菌處理或消毒處理的方式為：先在75％酒精溶液中將載玻片和蓋玻片浸泡3個小時以上，然后在制片時用酒精燈對載玻片和蓋玻片進行燃燒消毒，接著將載玻片和蓋玻片放置于直徑大于100mm的無菌密封容器中進行冷卻，直至染色完成；第二種對載玻片和蓋玻片進行無菌處理或消毒處理的方式為：將載玻片和蓋玻片直接放置在超凈臺中進行紫外線消毒并無菌保存，直至染色完成；步驟五：用1ml規(guī)格的一次性無菌注射器或無菌滴管吸取安瓿內(nèi)已染色的混合液，在無菌條件下將一滴經(jīng)過染色的混合液滴于步驟四中的載玻片上，蓋上蓋玻片；步驟六：當蓋上蓋玻片后，工作人員先依次通過4倍物鏡、10倍物鏡、40倍物鏡及100倍油鏡對載玻片上的混合液進行觀察，再由500萬以上像素的目鏡放大，然后用高分辨率顯像軟件將載玻片上的混合液的圖像顯示于電腦屏幕，最后工作人員在電腦上對載玻片上的混合液進行觀察記錄。優(yōu)選的，它由芝加哥天藍和無菌生理鹽水混合而成，所述芝加哥天藍與無菌生理鹽水的重量比為(0.8～1.5):100。優(yōu)選的，芝加哥天藍與無菌生理鹽水的重量比為1:100。根據(jù)圖2、圖6和圖7的對比可知，血液中的正常血紅細胞和異常紅細胞在經(jīng)過芝加哥天藍染色后，其形態(tài)特征差異明顯，工作人員可以根據(jù)細胞的形態(tài)很方便快速的分辨判斷出血液中是否含有真菌或孢子。根據(jù)圖3與圖4的對比可知，經(jīng)過染色后的菌絲與沒有經(jīng)過染色的菌絲在顯微鏡下的差別很明顯，工作人員可以根據(jù)顯微鏡下看到的結(jié)果，不僅可以很快的判斷出被檢測者的血液中是否含有真菌，也可以初步的判斷被檢測者的血液中細菌的大致數(shù)量。根據(jù)圖5、圖6、圖8和圖9的對比可知，本發(fā)明所述的用于檢測真菌的方法是有效的，能夠用于檢測血液中是否含有真菌。同時，由于本發(fā)明所述的方法只需要約20分鐘的的染色時間就可準確的判斷出被檢測的體液是否含有真菌，因此，本發(fā)明所述的真菌檢測方法與現(xiàn)有的各類檢測方法相比，本發(fā)明能夠明顯的縮短檢測時間和檢測成本，并提高檢測精度，具有良好的社會價值和市場價值。根據(jù)圖7的描述可知，本發(fā)明所述的真菌檢測方法是能夠在真菌感染者體內(nèi)清晰的檢測到真菌的，因此，本發(fā)明所述的真菌檢測方法是有效的，值得推廣的。根據(jù)圖9、圖10、圖11和圖12的描述可知，本發(fā)明所述的方法可以被廣泛的用于檢測真菌，不僅可以用于檢測血液中是否含有真菌，而且還可以用于檢測其它液體(如胸水、腦脊液)中是否含有真菌，同時，本發(fā)明所述的方法還可以用于做其它的實驗(如圖12中所示的白細胞激惹實驗)。為了能夠更加清楚的說明本發(fā)明的特點，并進一步的說明經(jīng)過芝加哥天藍染色后的樣本與沒有經(jīng)過芝加哥天藍染色后的樣本之間的區(qū)別，發(fā)明人對同一樣本進行了是否染色的對比實現(xiàn)，其對比結(jié)果如下：表1.芝加哥天藍對比染色與非對比染色血片的區(qū)別：非對比染色芝加哥天藍對比染色細胞顏色均勻一致，與紅細胞色澤一致細胞輪廓清晰，色澤深淺有別菌絲無顯示可現(xiàn)實清晰的菌絲及孢子孢子不能顯示散在玻片底部的子孢子能清晰顯示散在玻片底部的子孢子受染細胞不可現(xiàn)示受染白細胞可現(xiàn)示受染白細胞紅細胞不顯示紅細胞表面的棘刺清晰顯示紅細胞表面的棘刺其他不能顯示玻片底部可染色的結(jié)構可對比顯示玻片底部可染色的結(jié)構其它未說明的部分均屬于現(xiàn)有技術。當前第1頁12