本發(fā)明涉及生物，具體涉及酶聯(lián)免疫方法測定單克隆抗體濃度。

背景技術：

1、補體是一個復雜的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡，由超過30種蛋白組成，屬于先天免疫系統(tǒng)的一部分。補體系統(tǒng)成分通常以非活性狀態(tài)存在。在某些激活物的刺激作用下，補體固有成分會按照一定順序，以級聯(lián)反應依次激活，并發(fā)揮一系列生物學效應。補體系統(tǒng)可以通過3條途徑激活，盡管這些激活途徑的前端反應各異，但具有共同的末端通路，即生成c5轉(zhuǎn)化酶，通過裂解c5形成c5b片段，依次與c6、c7、c8、c9反應，最終形成攻膜復合物發(fā)揮溶細胞效應。自補體被發(fā)現(xiàn)以來，對于補體系統(tǒng)及其藥物開發(fā)的研究從未斷過。2007年soliris獲批上市，十數(shù)年后ultomiris上市。這兩款抗體均是針對c5靶點的單克隆抗體，目前也有很多方法用于檢測人血清中抗c5抗體，最常見的是質(zhì)譜法。這類方法專屬性比較高也能夠通量化，但是無法區(qū)分是否與靶點結(jié)合或是和ada結(jié)合。

2、中國專利cn114660292a中公開了一種檢測c5補體的試劑盒及其檢測方法和用途，該發(fā)明涉及檢測c5補體的試劑盒，及其在制備用于檢測病原體感染的診斷劑、用于腫瘤標志物的早期診斷篩查的診斷劑，或制備檢測c5補體的試劑或試劑盒中的用途。該發(fā)明提供的檢測c5補體的試劑盒包括：試劑?。旱谝痪彌_液、第一peg緩沖液；試劑ⅱ：抗c5補體抗體，包含單克隆抗體和/或多克隆抗體、第二peg緩沖液、igg；所述第一緩沖液的ph值為3-10。該發(fā)明提供的試劑盒可用于癌癥的初步篩查以及術后跟蹤，為腫瘤進展的風險程度提供可靠信息；也可用于檢測病毒、細菌、真菌、支原體、衣原體、立克次氏體中的一種或多種病原體，對臨床具有指導意義。

3、目前，現(xiàn)有技術中并未有使用酶聯(lián)免疫吸附法檢測抗人補體c5單克隆抗體的報道，并且現(xiàn)有的檢測c5單克隆抗體的方法較為復雜，靈敏度和準確度較差，無法分辨是否是與游離抗c5單克隆抗體結(jié)合。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供游離抗人補體c5單克隆抗體的酶聯(lián)免疫檢測方法，使用該方法具有較高的靈敏度和準確性，并且檢測方法較為簡單。

2、為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明的技術方案如下：

3、一方面，本發(fā)明提供了一種抗人補體c5單克隆抗體檢測試劑盒，所述的試劑盒包括包被抗原、封閉液和酶標二抗，所述的包被抗原為人補體c5，所述的封閉液為ⅰ-block，所述的ⅰ-block的濃度為0.05-0.5％，所述的酶標二抗為抗人igg-hrp。

4、進一步地，所述的酶標二抗選自羊抗人igg-hrp、兔抗人igg-hrp、鼠抗人igg-hrp中的任意一種。

5、更進一步地，所述的酶標二抗為羊抗人igg-hrp。

6、優(yōu)選地，所述的ⅰ-block的濃度為0.2％。

7、優(yōu)選地，所述的人補體c5的c端帶有6*his標簽。

8、優(yōu)選地，所述的試劑盒還包括包被液、洗滌液、稀釋液。

9、進一步優(yōu)選地，所述的包被液為磷酸鹽緩沖液，所述的磷酸鹽緩沖液的ph為7-8；再進一步優(yōu)選地，所述的磷酸鹽緩沖液的ph為7.4。

10、進一步優(yōu)選地，所述的洗滌液為磷酸鹽緩沖液+0.05％吐溫20。

11、進一步優(yōu)選地，所述的稀釋液為ⅰ-block。

12、再進一步優(yōu)選地，所述的ⅰ-block的濃度為0.05-0.5％；更進一步優(yōu)選地，所述的ⅰ-block的濃度為0.2％。

13、具體地，所述的試劑盒中還包括顯色液和終止液，所述的顯色液和終止液為本領域常規(guī)試劑。

14、優(yōu)選地，所述的試劑盒的檢測樣本選自血清、血漿中的一種或多種。

15、進一步優(yōu)選地，所述的檢測樣本為血清。

16、優(yōu)選地，檢測時需要對檢測樣本進行稀釋，稀釋的比例為1:200。

17、又一方面，本發(fā)明提供了抗人補體c5單克隆抗體濃度的檢測方法，所述的檢測方法為使用上述的抗人補體c5單克隆抗體檢測試劑盒進行檢測。

18、根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述的檢測方法包括以下步驟：

19、(1)將人補體c5用包被液稀釋，進行包被；

20、(2)加入封閉液進行封閉；

21、(3)將標準品、質(zhì)控品和待測樣品加入孔內(nèi)，進行反應；

22、(4)用稀釋液將抗人igg-hrp稀釋，進行反應；

23、(5)加入顯色液，室溫顯色，加入終止液，在450nm/630nm波長處測定吸光度。

24、優(yōu)選地，步驟(1)中將人補體c5稀釋至2ug/ml。

25、優(yōu)選地，步驟(1)中包被的溫度為2-8℃，包被的時間為16-18h。

26、進一步地，步驟(1)中包被的溫度為4℃。

27、優(yōu)選地，步驟(1)中包被后還包括洗滌液洗板的步驟，為使用洗滌液洗板3-5次。

28、優(yōu)選地，步驟(2)中封閉的溫度為25-37℃，進一步地，封閉的溫度為25℃。

29、優(yōu)選地，步驟(2)中封閉的時間為100min-140min；進一步優(yōu)選地，步驟(2)中封閉的時間為130min。

30、優(yōu)選地，步驟(2)封閉后還包括洗板步驟，為使用洗滌液洗板3-5次。

31、優(yōu)選地，步驟(3)中反應的溫度為25-37℃，反應的時間為120min-180min；進一步優(yōu)選地，反應的溫度為25℃，步驟(3)中反應的時間為130min。

32、優(yōu)選地，步驟(3)反應結(jié)束后還包括洗板步驟，為使用洗滌液洗板3-5次。

33、優(yōu)選地，步驟(4)中抗人igg-hrp具體為羊抗人igg-hrp。

34、優(yōu)選地，步驟(4)中羊抗人igg-hrp稀釋后的濃度為0.1ug/ml。

35、優(yōu)選地，步驟(4)中反應的溫度為25-37℃，反應的時間為60min-120min。

36、進一步優(yōu)選地，反應的溫度為25℃，步驟(4)中反應的時間為70min。

37、優(yōu)選地，步驟(4)反應結(jié)束后還包括洗板步驟，為使用洗滌液洗板3-5次。

38、優(yōu)選地，步驟(5)中加入顯色液后室溫顯色10-15分鐘；進一步優(yōu)選地為顯色10min。

39、本發(fā)明的有益效果為：

40、本發(fā)明的方法采用酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked?immunosorbent?assay，elisa)法對游離抗人c5單克隆抗體濃度進行分析，具有良好的準確度，靈敏度和特異性等優(yōu)點，所述方法的定量下限是1250ng/ml，并且本發(fā)明的檢測方法簡單，便于操作。

技術特征：

1.一種抗人補體c5單克隆抗體檢測試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包括包被抗原、封閉液和酶標二抗，所述的包被抗原為人補體c5，所述的封閉液為ⅰ-block，所述的ⅰ-block的濃度為0.05-0.5％，所述的酶標二抗為抗人igg-hrp。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗人補體c5單克隆抗體檢測試劑盒，其特征在于，所述的ⅰ-block的濃度為0.2％。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗人補體c5單克隆抗體檢測試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還包括包被液、洗滌液和稀釋液；所述的包被液為磷酸鹽緩沖液；所述的洗滌液為磷酸鹽緩沖液+0.05％吐溫20；所述的稀釋液為ⅰ-block。

4.權(quán)利要求1-3任一項所述的抗人補體c5單克隆抗體檢測試劑盒，其特征在于，所述的抗人補體c5單克隆抗體檢測試劑盒的檢測樣本選自血清、血漿中的一種或多種。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗人補體c5單克隆抗體檢測試劑盒，其特征在于，檢測樣本為血清時，對血清樣本進行稀釋，稀釋的比例為1:200。

6.一種抗人補體c5單克隆抗體濃度的檢測方法，其特征在于，所述的檢測方法為使用權(quán)利要求1-5任一項所述的抗人補體c5單克隆抗體檢測試劑盒進行檢測。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測方法，其特征在于，步驟(1)中包被的溫度為2-8℃，包被的時間為16-18h。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測方法，其特征在于，步驟(2)中封閉的溫度為25-37℃；步驟(2)中封閉的時間為100min-140min。

10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測方法，其特征在于，步驟(3)中反應的溫度為25-37℃，反應的時間為120min-180min；步驟(4)中反應的溫度為25-37℃，

技術總結(jié)
本發(fā)明公開了酶聯(lián)免疫方法測定單克隆抗體濃度，涉及生物技術領域。本發(fā)明提供了一種抗人補體C5單克隆抗體檢測試劑盒，所述的試劑盒包括包被抗原、封閉液和酶標二抗，所述的包被抗原為人補體C5，所述的封閉液為Ⅰ?block，所述的Ⅰ?block的濃度為0.05?0.5％，所述的酶標二抗為抗人IgG?HRP。本發(fā)明還提供了使用上述的檢測試劑盒檢測抗人補體C5單克隆抗體濃度的方法。本發(fā)明的方法采用酶聯(lián)免疫吸附法對抗人C5單克隆抗體濃度進行分析，具有良好的準確度，靈敏度和特異性等優(yōu)點，并且本發(fā)明的檢測方法簡單，便于操作。

技術研發(fā)人員：黃崢,莊超,高煜,李晟昊
受保護的技術使用者：上海覽屹醫(yī)藥科技有限公司
技術研發(fā)日：
技術公布日：2024/9/9