本發(fā)明屬于光電傳感分析，具體涉及一種新型的電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器的制備，實現(xiàn)了對25(oh)d3的靈敏檢測。

背景技術(shù)：

1、在人體中，維生素d3主要以骨化三醇(25(oh)d3)的活性形式存在，在代謝平衡過程中發(fā)揮著重要作用。骨化三醇在血液中的濃度與阿爾茨海默病ad、骨質(zhì)疏松、佝僂病、慢性腎功能低下、術(shù)后甲狀腺功能低下等息息相關(guān)。例如，缺乏維生素d3可能加速認(rèn)知損害并影響阿爾茨海默病ad的標(biāo)志物aβ的聚集和清除。維生素d3參與清除這些病理蛋白聚集體，減少與年齡相關(guān)的tau過度磷酸化和aβ寡聚體的形成。因此，骨化三醇可以作為生物標(biāo)志物用于上述疾病的輔助診斷。

2、目前，生物標(biāo)志物常用的檢測方法有酶聯(lián)免疫吸附法、化學(xué)發(fā)光法、電致化學(xué)發(fā)光法(ecl)，色譜法和熒光法等。其中，電致化學(xué)發(fā)光法由于其靈敏度高、響應(yīng)迅速且操作簡單得到了廣泛關(guān)注。檢測復(fù)雜樣品中低濃度目標(biāo)物時，就需求具有高的靈敏度和選擇性的傳感平臺，這就要尋求靈敏度高、活性穩(wěn)定、可重復(fù)性強(qiáng)的ecl發(fā)光材料。因此，新型ecl發(fā)光材料正逐漸被研發(fā)出來，如小分子有機(jī)物、金屬納米團(tuán)簇/絡(luò)合物、熒光有機(jī)納米顆粒和其他納米材料。其中，由于ceo2表面同時存在ce3+和ce4+兩種不同價態(tài)離子，并且之間存在著氧化還原轉(zhuǎn)換，使其具有豐富的催化性能和電學(xué)特性。在這些特性的啟發(fā)下，ceo2可被用作一種新型共反應(yīng)劑反應(yīng)加速劑，以提高共反應(yīng)劑系統(tǒng)的ecl發(fā)光效率，并在信號放大方面具有巨大潛力。本發(fā)明將ceo2原位生長在hofs-c3n4材料中，生成一種新型的納米復(fù)合材料，具有優(yōu)異的電致化學(xué)發(fā)光性能，可用于檢測25(oh)d3。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、因此，本發(fā)明是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，為25(oh)d3的檢測提供一種高選擇性、高靈敏度的ecl生物傳感器及其構(gòu)建方法。在本發(fā)明中，設(shè)計并制備了一種新型的hofs-c3n4-ceo2納米復(fù)合材料，將其作為ecl發(fā)光基底，利用適體間的堿基互補配對及對25(oh)d3的特異性識別，并引入了au?nrs，利用hofs-c3n4-ceo2與au?nrs之間的共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)傳感機(jī)制，開發(fā)了用于25(oh)d3檢測的電致化學(xué)發(fā)光傳感器。

2、術(shù)語“25(oh)d3”是指：骨化三醇。術(shù)語“c3n4”是指：氮化碳。術(shù)語“hofs”是指：氫鍵有機(jī)骨架。術(shù)語“hofs-c3n4-ceo2”是指：氫鍵有機(jī)骨架-氮化碳-二氧化鈰。術(shù)語“ceo2”是指：二氧化鈰。術(shù)語“vdba14”是指：25(oh)d3適體鏈。術(shù)語“ssdna”是指：vdba14互補鏈。術(shù)語“aunrs”是指：金納米棒。

3、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

4、一種檢測25(oh)d3的生物傳感器，包括電極、hofs-c3n4-ceo2、vdba14和au?nrs-ssdna，電極表面覆蓋hofs-c3n4-ceo2涂層，端部氨基修飾的vdba14與hofs-c3n4-ceo2涂層通過酰胺鍵結(jié)合，au?nrs-ssdna通過堿基互補配對與vdba14結(jié)合，得到au?nrs-ssdna/vdba14/hofs-c3n4-ceo2/au生物傳感器，所述vdba14為25(oh)d3適體鏈，ssdna為vdba14互補鏈，au?nrs-ssdna為端部氨基修飾的ssdna通過金氮鍵與金納米棒au?nrs結(jié)合形成的復(fù)合物。

5、優(yōu)選地，所述vdba14序列為：5′-agc?agc?aca?gag?gtc?atg?ggg?ggt?gtg?actttg?gtg?tgc?ctatgc?gtg?cta?cgg?aa-3′。作為一種實現(xiàn)方式，vdba14序列5′端修飾氨基(-nh2)。

6、優(yōu)選地，所述ssdna序列為：5′-ttt?ttt?ttc?cgt?agc?acg?cat?agg?cac?ac-3′。作為一種實現(xiàn)方式，ssdna序列5′端修飾氨基(-nh2)。

7、一種檢測25(oh)d3的生物傳感器的構(gòu)建方法，具體包括以下步驟：

8、(1)將hofs-c3n4-ceo2懸濁液滴涂在電極表面，干燥后在電極表面形成hofs-c3n4-ceo2涂層。

9、(2)接下來用含有0.1m的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和0.025m的n-羥基琥珀酰亞胺的磷酸鹽緩沖液來活化修飾hofs-c3n4-ceo2涂層表面的羧基，接著，將端部氨基修飾的vdba14的溶液滴到電極上進(jìn)行孵育，vdba14通過酰胺鍵與hofs-c3n4-ceo2涂層結(jié)合，沖洗電極表面未結(jié)合的vdba14，得到vdba14/hofs-c3n4-ceo2/au電極。

10、(3)將端部氨基修飾的ssdna與金納米棒au?nrs振蕩孵育，生成au?nrs-ssdna復(fù)合物。

11、(4)接下來將au?nrs-ssdna復(fù)合物懸浮液滴到電極上進(jìn)行孵育，au?nrs-ssdna復(fù)合物通過堿基互補配對與vdba14特異性結(jié)合，沖洗電極表面未結(jié)合的au?nrs-ssdna復(fù)合物，得到au?nrs-ssdna/vdba14/hofs-c3n4-ceo2/au電極。

12、所述hofs-c3n4-ceo2納米復(fù)合材料，具體包括以下步驟：

13、(101)在含有1,3,6,8-四(4-羧基苯基)芘的n,n-二甲基甲酰胺中分散g-c3n4納米片，經(jīng)過超聲處理后，加入超純水快速攪拌，使溶液呈現(xiàn)黃綠色；

14、(102)接著，加入無水乙醇并劇烈攪拌，最后，離心、洗滌，收集洗滌過后的黃色粉末，干燥得到hofs-c3n4；

15、(103)在乙醇中分散合成的hofs-c3n4、六水合硝酸鈰和聚乙烯吡咯烷酮，在攪拌下加入去離子水，并轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中，用水熱法在160℃下加熱8h，反應(yīng)結(jié)束后，高速離心、洗滌、干燥得到hofs-c3n4-ceo2復(fù)合材料。

16、具體地，所述電極可以為金電極，玻碳電極等現(xiàn)有技術(shù)中常用電極材料，優(yōu)選為金電極。金電極經(jīng)預(yù)處理，預(yù)處理方法為：分別用粒度為0.3和0.05μm的氧化鋁粉末對玻碳電極進(jìn)行拋光處理，用乙醇和二次水進(jìn)行超聲處理，最后用氮氣干燥。

17、優(yōu)選地，所述步驟(3)中，端部氨基修飾的ssdna的濃度范圍為0.001μm-10.0μm，例如0.001μm、0.01μm、0.1μm、1.0μm、2.0μm、3.0μm、4..0μm、5.0μm、6.0μm、7.0μm、8.0μm、9.0μm、10.0μm。最優(yōu)選地，濃度為1.0μm。

18、具體地，步驟(2)中孵育條件為：在37℃下孵育2-9小時，更優(yōu)選地，孵育6小時。

19、優(yōu)選地，步驟(4)中，端部氨基修飾的vdba14與au?nrs-ssdna的孵育時間為0.5-9小時，例如，0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9小時；最優(yōu)選地，活化時間為2小時，孵育溫度為37℃。

20、優(yōu)選地，步驟(4)中端部氨基修飾的vdba14的濃度范圍為0.001μm-10.0μm，例如0.001μm、0.01μm、0.1μm、1.0μm、2.0μm、3.0μm、4..0μm、5.0μm、6.0μm、7.0μm、8.0μm、9.0μm、10.0μm。最優(yōu)選地，濃度為1.0μm。

21、所述生物傳感器在檢測25(oh)d3中的應(yīng)用，具體過程為：將au?nrs-ssdna/vdba14/hofs-c3n4-ceo2/au生物傳感器與含有25(oh)d3的待測溶液(如人體血清)共同孵育，孵育后沖洗生物傳感器，檢測其ecl信號，根據(jù)ecl信號測定25(oh)d3的濃度。

22、所述生物傳感器在診斷阿爾茨海默病ad、骨質(zhì)疏松、佝僂病、慢性腎功能低下、術(shù)后甲狀腺功能中的應(yīng)用，通過檢測血液中25(oh)d3的含量，輔助上述疾病的診斷過程。

23、本發(fā)明的有益效果：

24、(1)本發(fā)明制備的生物傳感器可以用于25(oh)d3的高靈敏檢測，在20ng/ml至80ng/ml范圍內(nèi)具有良好線性。

25、(2)由于hofs-c3n4-ceo2的ecl發(fā)射范圍與受體au?nrs的紫外吸收光譜相吻合，才能產(chǎn)生良好的供體與受體之間ecl-ret現(xiàn)象，可以快速靈敏的實現(xiàn)對25(oh)d3的早期檢測。

26、(3)本發(fā)明制備的生物傳感器具有靈敏度高、選擇性好、生物相容性好等優(yōu)點，拓展了對25(oh)d3檢測的新方法。