本發(fā)明涉及中藥，尤其涉及一種中藥口服液中有效成分的鑒定與含量測(cè)定方法。

背景技術(shù)：

1、中藥制劑是以中藥材為原料，依據(jù)中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，經(jīng)過(guò)一定工藝加工和配制而成的藥品。中藥制劑的劑型多樣，包括口服液、顆粒劑、片劑、丸劑、膏劑等，其在臨床疾病治療、預(yù)防、康復(fù)調(diào)理等多個(gè)領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用。其中，中藥口服液是將中藥組方中的藥材用水、乙醇等溶劑，采用適宜方法提取，經(jīng)濃縮制成的內(nèi)服液體制劑。然而，中藥口服液中化學(xué)成分復(fù)雜、物質(zhì)基礎(chǔ)不清，從而極大地影響了中藥制劑實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定、可靠的質(zhì)量控制。因此，中藥口服液中有效成分的深入研究對(duì)于其質(zhì)量控制具有重要意義。

2、本專(zhuān)利所述中藥口服液的處方組成包括：君藥為香附與柴胡；臣藥為川芎、白芍、當(dāng)歸與丹參；佐藥為延胡索、王不留行、瓜蔞子、瓜蔞仁、夏枯草與橘核；使藥為麥芽與甘草，具有解郁散結(jié)、活血理氣止痛的功效，臨床上主要用于治療乳腺增生癥，目前，針對(duì)該中藥口服液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升研究中僅涉及以芍藥苷為指標(biāo)性成分的鑒定和測(cè)定，對(duì)于該中藥口服液中有效成分的鑒定和含量測(cè)定研究存在不足，無(wú)法全面地對(duì)該中藥口服液進(jìn)行質(zhì)量控制。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種中藥口服液中有效成分的鑒定與含量測(cè)定方法，其利用超高效液相串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法，鑒定該中藥口服液中多個(gè)有效成分；并通過(guò)建立有效成分的線性回歸方程，從而測(cè)定各有效成分的含量，為該中藥口服液的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

3、一種中藥口服液中有效成分的鑒定方法，包括以下步驟：

4、(1)上樣樣品預(yù)處理：

5、取中藥口服液，離心，獲得上清液即為供試品儲(chǔ)備溶液，取供試品儲(chǔ)備溶液加入甲醇ⅰ稀釋?zhuān)@得供試品溶液；

6、取待測(cè)成分的標(biāo)準(zhǔn)品加入甲醇ⅱ進(jìn)行溶解，獲得對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，取對(duì)照品儲(chǔ)備溶液加入甲醇ⅲ稀釋?zhuān)@得對(duì)照品溶液；

7、(2)分別取步驟(1)中的對(duì)供試品溶液和對(duì)照品溶液，按照色譜條件和質(zhì)譜條件，采用超高效液相串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法進(jìn)行檢測(cè)；

8、(3)根據(jù)步驟(2)中出現(xiàn)的質(zhì)荷比與保留時(shí)間對(duì)供試品溶液進(jìn)行定性分析，以鑒定中藥口服液的有效成分；

9、其中，所述中藥口服液的有效成分包括柴胡皂苷a、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、甘草苷、甘草素、原兒茶醛、王不留行黃酮苷、阿魏酸和檸檬苦素。

10、根據(jù)上述技術(shù)手段，本發(fā)明公開(kāi)的鑒定方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，能夠迅速準(zhǔn)確地檢測(cè)中藥口服液的有效成分，為進(jìn)一步完善該中藥口服液的質(zhì)量控制提供有利證據(jù)。

11、優(yōu)選的，所述中藥口服液包括以下中藥材：柴胡、川芎、白芍、當(dāng)歸、丹參、王不留行、橘核與甘草。

12、根據(jù)上述技術(shù)手段，本發(fā)明針對(duì)提及的中藥口服液，取上述中藥材分別作為君藥、臣藥、佐藥和使藥的代表，采用超高效液相串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法對(duì)其多個(gè)有效成分進(jìn)行鑒定，為該中藥口服液的質(zhì)量控制研究提供有利證據(jù)。

13、優(yōu)選的，步驟(1)中所述待測(cè)成分的標(biāo)準(zhǔn)品包括柴胡皂苷a、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、甘草苷、甘草素、原兒茶醛、王不留行黃酮苷、阿魏酸和檸檬苦素。

14、其中，依據(jù)2020版《中國(guó)藥典》(一部)相關(guān)中藥材項(xiàng)下質(zhì)量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，柴胡皂苷a、芍藥苷、甘草苷以及王不留行黃酮苷分別屬于柴胡、白芍、甘草與王不留行藥材含量測(cè)定的指標(biāo)性成分；阿魏酸屬于川芎和當(dāng)歸藥材含量測(cè)定中共同的指標(biāo)性成分；且據(jù)多項(xiàng)文獻(xiàn)研究表明，原兒茶醛可作為丹參藥材的含量考察指標(biāo)之一；檸檬苦素可作為橘核藥材的含量檢測(cè)指標(biāo)；甘草素是甘草的主要有效成分之一，且含量較高，可作為甘草藥材的含量檢測(cè)指標(biāo)；芍藥內(nèi)酯苷可作為白芍藥材的含量檢測(cè)指標(biāo)之一；

15、根據(jù)上述技術(shù)手段，對(duì)本發(fā)明的中藥口服藥中的“君、臣、佐、使”藥材分別進(jìn)行拆分研究，以柴胡皂苷a作為柴胡的含量檢測(cè)指標(biāo)性成分、芍藥苷及芍藥內(nèi)酯苷作為白芍的含量檢測(cè)指標(biāo)性成分、甘草苷及甘草素作為甘草的含量檢測(cè)指標(biāo)性成分、阿魏酸作為川芎及當(dāng)歸的含量檢測(cè)指標(biāo)性成分、王不留行黃酮苷作為王不留行的含量檢測(cè)指標(biāo)性成分、原兒茶醛作為丹參的含量檢測(cè)指標(biāo)性成分、檸檬苦素作為橘核的含量檢測(cè)指標(biāo)性成分，利用超高效液相串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法測(cè)定以上指標(biāo)，根據(jù)出峰時(shí)間、同位素豐度比、一級(jí)質(zhì)量偏差、二級(jí)離子碎片等特征以鑒定該中藥口服液中有效成分，且鑒定結(jié)果證明該中藥口服液的有效成分包括柴胡皂苷a、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、甘草苷、甘草素、原兒茶醛、王不留行黃酮苷、阿魏酸和檸檬苦素。

16、優(yōu)選的，步驟(2)中所述色譜條件為：采用waters?acquity?uplc?hss?pfp液相色譜柱，規(guī)格為2.1×100mm，1.8μm，流動(dòng)相a為0.1％-0.5％甲酸-水，流動(dòng)相b為0.1％-0.5％甲酸-乙腈，梯度洗脫，流速0.1-1ml/min，進(jìn)樣量為2-20μl，柱溫30-40℃；

17、其中，所述梯度洗脫的條件如下：

18、

19、所述質(zhì)譜條件為：采用電噴霧離子化源與信息依賴(lài)型采集模式掃描，碰撞氣為氮?dú)猓F化氣壓力為20-99psi，掃描質(zhì)量范圍為m/z?50-2000，毛細(xì)管電壓正離子模式為1000-5500v，負(fù)離子模式為-4500v-0v，正離子模式去簇電壓為10-150v，碰撞能量20-100v，負(fù)離子模式去簇電壓為-150-0v，碰撞能量-100-0v，離子源溫度400-600℃。

20、根據(jù)上述技術(shù)手段，本發(fā)明采用上述色譜條件和質(zhì)譜條件得到的結(jié)果分離效果好、響應(yīng)效果明顯、重現(xiàn)性好、靈敏度高，能夠迅速且準(zhǔn)確地檢測(cè)中藥口服液中的有效成分。

21、一種如上述的中藥口服液中有效成分的含量測(cè)定方法，包括以下步驟：

22、(1)上樣樣品預(yù)處理：

23、取中藥口服液，離心，獲得上清液即為供試品儲(chǔ)備溶液，取供試品儲(chǔ)備溶液加入甲醇ⅰ稀釋?zhuān)@得供試品溶液；

24、取待測(cè)有效成分的標(biāo)準(zhǔn)品加入甲醇ⅱ進(jìn)行溶解，獲得對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，取對(duì)照品儲(chǔ)備溶液加入甲醇ⅲ稀釋?zhuān)@得對(duì)照品溶液，然后將對(duì)照品溶液利用甲醇ⅲ按照濃度梯度進(jìn)行的定容配置，獲得不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；

25、(2)依次取步驟(1)中不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照色譜條件和質(zhì)譜條件，采用超高效液相串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)測(cè)得的各濃度峰面積建立標(biāo)準(zhǔn)曲線、確定線性范圍，以得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)；

26、(3)取步驟(1)中的供試品溶液，按照步驟(2)中所述色譜條件和所述質(zhì)譜條件，采用超高效液相串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法進(jìn)行檢測(cè)，將測(cè)得的有效成分峰面積利用步驟(2)中得到的回歸方程進(jìn)行計(jì)算，即獲得中藥口服液中有效成分的具體含量。

27、根據(jù)上述技術(shù)手段，本發(fā)明公開(kāi)的含量測(cè)定方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好、分析迅速，能夠同時(shí)檢測(cè)分析中藥口服液中多個(gè)有效成分的含量，為進(jìn)一步完善中藥口服液的質(zhì)量控制提供有利證據(jù)。

28、優(yōu)選的，步驟(1)中所述待測(cè)有效成分的標(biāo)準(zhǔn)品包括柴胡皂苷a、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、甘草苷、甘草素、原兒茶醛、王不留行黃酮苷、阿魏酸和檸檬苦素中的至少一種。

29、根據(jù)上述技術(shù)手段，針對(duì)本發(fā)明鑒定的多個(gè)有效成分，進(jìn)一步檢測(cè)各有效成分的具體含量，為該中藥口服液的質(zhì)量控制研究提供有利證據(jù)。

30、優(yōu)選的，步驟(1)中所述待測(cè)有效成分的標(biāo)準(zhǔn)品包括芍藥苷、甘草苷、柴胡皂苷a、阿魏酸、檸檬苦素和王不留行黃酮苷。

31、根據(jù)上述技術(shù)手段，基于對(duì)中藥口服液中多個(gè)有效成分鑒定的結(jié)果，以芍藥苷、甘草苷、柴胡皂苷a、阿魏酸、檸檬苦素和王不留行黃酮苷作為有效成分的含量檢測(cè)指標(biāo)代表，利用超高效液相串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法對(duì)上述指標(biāo)進(jìn)行含量測(cè)定，以確定各有效成分的含量。

32、優(yōu)選的，步驟(2)和步驟(3)中所述色譜條件為：采用waters?acquity?uplc?hsspfp液相色譜柱，規(guī)格為2.1×100mm，1.8μm，流動(dòng)相a為0.1％-0.5％甲酸-水，流動(dòng)相b為0.1％-0.5％甲酸-乙腈，梯度洗脫，流速0.1-0.8ml/min，進(jìn)樣量為2-20μl，柱溫30-40℃；

33、其中，所述梯度洗脫的條件如下：

34、

35、所述質(zhì)譜條件為：采用電噴霧離子化源與多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式掃描，碰撞氣為氮?dú)?，霧化氣壓力為20-99psi，掃描質(zhì)量范圍為m/z?50-2000，毛細(xì)管電壓正離子模式為1000-5500v，負(fù)離子模式為-4500v-0v，離子源溫度400-600℃，正離子模式：去簇電壓與碰撞能量分別為0-150v與0-100v，負(fù)離子模式：去簇電壓與碰撞能量分別為-150-0v與-100-0v。

36、根據(jù)上述技術(shù)手段，本發(fā)明采用上述色譜條件和質(zhì)譜條件得到的結(jié)果分離效果好、響應(yīng)效果明顯、重現(xiàn)性好、靈敏度高，能夠迅速且準(zhǔn)確地檢測(cè)中藥口服液中多個(gè)有效成分的含量。

37、優(yōu)選的，所述離心的速度為8000-16000rpm，時(shí)間為5-15min。

38、根據(jù)上述技術(shù)手段，采用上述離心參數(shù)，離心效率高、效果好。

39、優(yōu)選的，所述濃度梯度為對(duì)照品溶液濃度分別為50％、40％、20％、10％、5％、4％、2.5％與2％。

40、根據(jù)上述技術(shù)手段，采用上述濃度梯度配置各標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的濃度，使得繪制出的標(biāo)準(zhǔn)曲線更準(zhǔn)確，得到的相關(guān)系數(shù)和回歸方程更可靠。

41、本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的有益效果：

42、1、本發(fā)明采用超高效液相串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(uplc-q-tof-ms)法結(jié)合了三重四極桿和飛行時(shí)間質(zhì)譜的優(yōu)點(diǎn)，使其具有高分辨率、高質(zhì)量精度和高靈敏度的分析特點(diǎn)，且在此基礎(chǔ)上建立的針對(duì)用于中藥口服液中多個(gè)有效成分的鑒定方法和含量測(cè)定方法，在對(duì)各有效成分進(jìn)行鑒定的同時(shí)能夠?qū)Ω饔行С煞謱?shí)現(xiàn)高準(zhǔn)確性、高穩(wěn)定性、高靈敏度、高重現(xiàn)性的含量測(cè)定。

43、2、本發(fā)明鑒定的九種有效成分分別來(lái)自所述中藥口服液中的“君、臣、佐、使”藥材，為發(fā)現(xiàn)該中藥口服液的物質(zhì)基礎(chǔ)奠定數(shù)據(jù)支撐。

44、3、本發(fā)明采用含量測(cè)定方法對(duì)所述中藥口服液中的六個(gè)有效成分進(jìn)行定量分析，專(zhuān)屬性高、重復(fù)性好、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可以全面、準(zhǔn)確、深入地對(duì)該中藥口服液進(jìn)行質(zhì)量控制，并提供技術(shù)參考。