本發(fā)明屬于生物工程，具體涉及檢測asfv感染早、晚期抗體水平的間接elisa試劑盒及檢測方法。

背景技術(shù)：

1、非洲豬瘟(african?swine?fever，asf)是由非洲豬瘟病毒(african?swine?fevervirus，asfv)感染家豬和野豬引起的一種烈性傳染病，臨床上表現(xiàn)為高熱、沉郁、厭食、皮膚發(fā)紺、各臟器出血，發(fā)病率和病死率可高達(dá)100％。該病自2018年首次傳入我國后，迅速大范圍蔓延，對(duì)我國養(yǎng)豬業(yè)構(gòu)成了重大威脅。

2、asfv為有囊膜的雙鏈dna病毒，是非洲豬瘟病毒科(asfarviridae)非洲豬瘟病毒屬(asfivirus)的唯一成員。該病毒基因組全長約170-194kb，編碼150-200種蛋白。由于目前仍缺乏有效的asf疫苗，早期的豬群檢測及生物安全防控仍是預(yù)防asf的主要手段。而elisa抗體水平的檢測方法能夠準(zhǔn)確及時(shí)的檢測豬體內(nèi)病毒抗體水平，判斷豬群感染情況從而有助于更有效的制定非洲豬瘟的防控措施。有研究顯示，p72、p30和p54蛋白為asfv感染過程中能引起體液免疫應(yīng)答的最重要的3種抗原蛋白。針對(duì)p72和p54蛋白的抗體可以阻止病毒吸附，針對(duì)p30的抗體可以阻止病毒內(nèi)吞。因此，這些蛋白常被作為用于asf血清學(xué)診斷及疫苗研制的重要抗原蛋白。

3、p72蛋白又稱vp72蛋白，是asfv的主要結(jié)構(gòu)蛋白，是由基因b646l編碼的關(guān)鍵抗原蛋白，相對(duì)分子量為73.2kda。p72約占病毒顆?？傊亓康?2％，具有高度的抗原性和反應(yīng)原性，是病毒二十面體的主要成分，并且對(duì)病毒衣殼的形成起著十分重要的作用。該基因的表達(dá)發(fā)生在病毒感染的晚期，并受病毒晚期啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)，合成晚期蛋白。新合成的p72均勻分布在可溶性細(xì)胞質(zhì)池和與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(er)結(jié)合的膜相關(guān)池之間，并組裝在er膜上形成大的衣殼或基質(zhì)前體。p72蛋白在非洲豬瘟病毒入侵過程中具有構(gòu)象依賴性，其表達(dá)是病毒復(fù)制的標(biāo)志。p72抗體可以阻止asfv與巨噬細(xì)胞結(jié)合，但該抗體在抗體介導(dǎo)的免疫保護(hù)中不能發(fā)揮決定性作用。而p72蛋白的反應(yīng)原性很穩(wěn)定，且不同區(qū)域所分離出的非洲豬瘟病毒株誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的抗p72蛋白抗體的相應(yīng)抗原表位都十分保守，可以作為血清學(xué)檢測方法及疫苗研制的良好抗原。

4、p30蛋白由cp204l基因編碼，是一種早期的病毒蛋白質(zhì)，與asfv入侵和內(nèi)化作用相關(guān)，其分子量為26kda，在病毒感染后約2至4小時(shí)可觀察到該蛋白的高度表達(dá)，并且能持續(xù)整個(gè)病毒感染周期。p30的表達(dá)表明asfv已經(jīng)進(jìn)入宿主細(xì)胞并脫殼，是病毒早期基因開始表達(dá)的標(biāo)志。研究發(fā)現(xiàn)，重組p30蛋白在elisa抗體檢測中的效果優(yōu)于p54蛋白。因此，在asfv的檢測中經(jīng)常把p30作為elisa(酶聯(lián)免疫吸附)檢測的主要抗原，把p54作為western?blot(免疫印跡)檢測宿主血清中asfv抗體的指定抗原。

5、asfv感染后8-12天可檢測到p30抗體，比其他蛋白抗體檢出時(shí)間早1周左右，可判斷病毒早期感染情況，但其持續(xù)時(shí)間短，抗體水平消減快。而asfv感染后第17天可檢測到p72抗體，其持續(xù)時(shí)間長，抗體水平高，可判斷病毒的持續(xù)感染情況。而如果能同時(shí)檢測p30和p72抗體，從而將早期感染以及持續(xù)感染情況進(jìn)行有效結(jié)合，將明顯提高asfv感染的檢出率。然而，現(xiàn)有技術(shù)中，通常只針對(duì)一種抗體進(jìn)行檢測，仍然缺少能夠同時(shí)實(shí)現(xiàn)p30抗體和p72抗體高靈敏度檢測的配套方法。并且，采用現(xiàn)有檢測方法，無法同時(shí)實(shí)現(xiàn)asfv感染早、晚期抗體水平的有效檢測，也無法精準(zhǔn)判斷豬群的病毒持續(xù)感染情況，限制了其在asf疫病防治方面的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種檢測asfv感染早、晚期抗體水平的間接elisa試劑盒，其采用p72δ-p30融合蛋白作為包被抗原，基于該融合蛋白進(jìn)行elisa間接檢測asfv抗體水平，具有快速、特異、靈敏的特點(diǎn)，能夠有效檢測asfv感染早、晚期抗體水平，從而為asfv診斷試劑的開發(fā)提供參考。

2、本發(fā)明的目的還在于提供一種檢測asfv感染早、晚期抗體水平的間接elisa方法，其具有快速、特異、靈敏的特點(diǎn)，能夠有效檢測asfv感染早、晚期抗體水平，從而為asfv診斷試劑的開發(fā)提供參考。

3、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

4、一種檢測asfv感染早、晚期抗體水平的間接elisa試劑盒，所述間接elisa試劑盒包括：包被酶標(biāo)板、酶標(biāo)二抗；

5、所述包被酶標(biāo)板以p72δ-p30融合蛋白作為包被抗原；所述p72δ-p30融合蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

6、其中，p72δ-p30融合蛋白的氨基酸序列，全長389aa。其中，第1～190aa段為p72δ的氨基酸段；第191～195aa段為連接蛋白linker的氨基酸序列；第196～389aa段為p30的氨基酸段。

7、作為優(yōu)選的方案，所述p72δ-p30融合蛋白由如seq?id?no.2所示的核苷酸序列編碼。seq?id?no.2所示的核苷酸序列全長1191bp。其中，第1～3bp、1171～1191bp位點(diǎn)處的核苷酸是擴(kuò)增時(shí)質(zhì)粒中含有的、為了方便擴(kuò)增并起到保護(hù)作用的核苷酸，并不會(huì)在表達(dá)的時(shí)候編碼蛋白質(zhì)。第4～573bp位點(diǎn)處核苷酸編碼p72δ蛋白；第589～1170bp位點(diǎn)處核苷酸編碼p30蛋白。第574～588bp位點(diǎn)處的核苷酸為flexible?linker(ggggs)的編碼核苷酸(ggcggcggcggttct)。

8、作為優(yōu)選的方案，所述酶標(biāo)二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗豬igg抗體。

9、作為優(yōu)選的方案，所述間接elisa試劑盒還包括：陰性對(duì)照血清、陽性對(duì)照血清、包被液、洗滌液、顯色液、封閉液、稀釋液、終止液。

10、作為進(jìn)一步優(yōu)選的方案，所述陰性對(duì)照血清為asfv陰性血清；所述陽性對(duì)照血清為asfv陽性血清；所述包被液為含20mm?na2co3、35mm?nahco3的水溶液，ph值為9.6；所述洗滌液為pbst緩沖液；所述顯色液為tmb顯色液；所述封閉液為3％bsa封閉液；所述稀釋液為pbst緩沖液；所述終止液為2mol/l硫酸溶液。

11、作為優(yōu)選的方案，所述p72δ-p30融合蛋白通過包括如下步驟的方法制備：

12、(a)以重組質(zhì)粒pet-28a-p72、pet-28a-p30為模板，分析p72和p30的優(yōu)勢抗原表位，根據(jù)genbank數(shù)據(jù)庫收錄的登錄號(hào)為mk128995.1的非洲豬瘟病毒anhui株全基因組中的p72、p30序列，設(shè)計(jì)融合pcr的特異性引物；

13、利用特異性引物對(duì)p72δ、p30目的基因進(jìn)行pcr擴(kuò)增，pcr產(chǎn)物經(jīng)過純化，得到目的基因p72δ和p30；將目的基因p72δ和p30進(jìn)行同源重組pcr擴(kuò)增，pcr產(chǎn)物經(jīng)過純化，得到目的基因p72δ-p30；

14、(b)將純化好的p72δ-p30目的基因插入pet-28a載體，經(jīng)陽性克隆篩選和測序鑒定，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pet-28a-p72δ-p30；

15、(c)將重組表達(dá)質(zhì)粒pet-28a-p72δ-p30轉(zhuǎn)化至原核表達(dá)感受態(tài)rosetta細(xì)胞中，誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，純化后分析目的蛋白的純度，即得p72δ-p30融合蛋白。

16、作為進(jìn)一步優(yōu)選的方案，所述特異性引物的核苷酸序列如下所示：

17、p72δ-f：5'-ccgggatccaaaatgactggatataagcactt-3'(如seq?id?no.3所示)；

18、p72δ-r：5'-agagccgccaccgcc?attattcgtgagcgagattt-3'(如seq?id?no.4所示)；

19、p30-f：5'-ggcggtggcggctct?atggattttattttaaatat-3'(如seq?id?no.5所示)；

20、p30-r：5'-ccgctcgagtgtaggtgagataaaagc-3'(如seq?id?no.6所示)。

21、一種檢測asfv感染早、晚期抗體水平的間接elisa方法，包括以下步驟：

22、(1)抗原包被：采用包被液稀釋如權(quán)利要求1所述的p72δ-p30融合蛋白，然后將融合蛋白的稀釋液加入到酶標(biāo)板中，4～6℃過夜進(jìn)行抗原包被，結(jié)束后采用洗滌液清洗；

23、(2)封閉：在酶標(biāo)板中加入封閉液，35～40℃封閉0.8～1.2h，然后棄去封閉液，采用洗滌液清洗；

24、(3)加樣：將待測樣品、陰性對(duì)照血清和陽性對(duì)照血清采用稀釋液按比例稀釋后，分別加入酶標(biāo)板的孔內(nèi)，35～40℃孵育20～40min，然后棄去孔內(nèi)血清，采用洗滌液清洗；

25、(4)加酶標(biāo)二抗：將酶標(biāo)二抗采用稀釋液稀釋，然后以80～120μl/孔加入酶標(biāo)板，35～40℃孵育0.5～2h，棄去酶標(biāo)二抗，采用洗滌液清洗；

26、(5)顯色、終止、判定：在酶標(biāo)板中加入tmb顯色液，加入量為80～120μl/孔，35～40℃避光顯色8～15min，然后立即向酶標(biāo)板中加入終止液，采用酶標(biāo)儀讀取od450nm值；根據(jù)測定的od450nm值，判定待測血清樣品中是否含有asfv的抗體。

27、本發(fā)明的檢測asfv感染早、晚期抗體水平的間接elisa方法，僅用于檢測待測樣品中是否含有asfv的抗體，并不用于該動(dòng)物疾病的直接診斷。該方法中，待測樣品一般可以是豬血清、唾液或分泌物。

28、作為優(yōu)選的方案，所述間接elisa方法的最佳工藝條件為：步驟(1)中，抗原包被的濃度為1μg/ml，融合蛋白的稀釋液在每孔的加入量為100μl/孔；包被液為含20mm?na2co3、35mm?nahco3的水溶液，ph值為9.6；包被條件為4℃過夜；步驟(2)中，封閉液為3％bsa封閉液，封閉時(shí)間為37℃、1h；步驟(3)中，所述稀釋的倍數(shù)為1：1000，所述孵育的條件為37℃、30min；步驟(4)中，所述稀釋的倍數(shù)為1：5000，所述孵育的條件為37℃、60min；步驟(5)中，所述顯色的條件為37℃、10min。

29、作為進(jìn)一步優(yōu)選的方案，步驟(5)中，判定待測血清樣品中是否含有asfv的抗體，具體是：當(dāng)od450nm值≥0.457時(shí)，判定待測血清樣品為陽性，即待測血清樣品中含有asfv的抗體，說明該動(dòng)物已感染asfv；當(dāng)od450nm值<0.457時(shí)，判定待測血清樣品為陰性，即待測血清樣品中不含asfv的抗體，說明該動(dòng)物沒有被asfv感染。

30、本發(fā)明的有益效果在于：

31、本發(fā)明提供的檢測asfv感染早、晚期抗體水平的間接elisa試劑盒及檢測方法，將afsv兩個(gè)重要的病毒蛋白p72和p30進(jìn)行融合表達(dá)，同時(shí)通過控制融合蛋白的融合順序，成功純化出p72δ-p30融合蛋白，利用該融合蛋白作為包被抗原，建立了一種間接elisa檢測方法，該方法能夠?qū)崿F(xiàn)同時(shí)對(duì)p72和p30抗體水平的檢測，能夠?yàn)楦腥驹缙诤屯砥诳贵w水平的評(píng)估提供全面的數(shù)據(jù)支持，而且該方法具有良好的特異性和穩(wěn)定性，可運(yùn)用于非洲豬瘟臨床血清檢測的運(yùn)用，為建立血清學(xué)間接elisa方法檢測非洲豬瘟奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

32、試驗(yàn)證實(shí)，相較于現(xiàn)有的asfv抗體檢測方法，本發(fā)明通過將p72保守抗原和p30蛋白融合表達(dá)，具有更高的檢出率，用于臨床診斷后可精準(zhǔn)判斷豬群的病毒持續(xù)感染情況，能夠?yàn)閍sf疫病防治措施制定提供科學(xué)依據(jù)。