本發(fā)明屬于生化檢測(cè)體外診斷試劑，具體涉及一種丙戊酸均相酶免疫測(cè)定試劑盒及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、丙戊酸是一種廣譜性抗癲癇藥物，臨床主要用于治療全身性或部分性類型的癲癇發(fā)作，在丙戊酸的臨床給藥治療過(guò)程中，由于患者個(gè)體藥物代謝動(dòng)力學(xué)差異，造成丙戊酸的給藥量與血藥濃度之間的相關(guān)性較差。

2、目前臨床上監(jiān)測(cè)丙戊酸血藥濃度有多種方法，如高效液相色譜分析(hplc)、化學(xué)發(fā)光法、均相酶免疫測(cè)定法、膠乳凝集比濁法等。hplc費(fèi)時(shí)且不易自動(dòng)化；直接化學(xué)發(fā)光法靈敏度高，但是需要昂貴的化學(xué)發(fā)光儀器，操作繁瑣，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，自動(dòng)化程度低，重復(fù)性較差。均相酶免疫法，是競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的分析方法。與藥物檢測(cè)的其它方法相比，均相酶免疫法利用酶標(biāo)記物與相應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合后，標(biāo)記酶的活性發(fā)生改變，在不用分離結(jié)合酶標(biāo)記物和游離酶標(biāo)記物的情況下，通過(guò)測(cè)定標(biāo)記酶活性的改變確定待測(cè)物的含量。且因?yàn)槭蔷嗝复俜磻?yīng)體系，既避免了抗原、抗體分離對(duì)結(jié)果的影響，同時(shí)反應(yīng)可以在較短時(shí)間內(nèi)達(dá)到平衡，利用全自動(dòng)生化分析儀可實(shí)現(xiàn)樣本的快速高通量檢測(cè)。

3、用于均相酶免疫法的標(biāo)記酶有溶解酵素、蘋(píng)果酸脫氫酶、β-d-半乳糖苷酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶等。目前常用的為葡萄糖-6-磷酸脫氫酶。但葡萄糖-6-磷酸脫氫酶存在較多缺點(diǎn)：(1)在人體內(nèi)含量高、存在面廣、酶活力強(qiáng)，在檢測(cè)過(guò)程中，血清中的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶對(duì)結(jié)果存在假陽(yáng)性干擾；(2)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶在偶聯(lián)反應(yīng)過(guò)程中酶活力損失較大，偶聯(lián)效率低；(3)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶偶聯(lián)物的穩(wěn)定性差，導(dǎo)致相應(yīng)檢測(cè)試劑穩(wěn)定性差，影響試劑盒有效期。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明為了克服上述丙戊酸均相酶免疫法測(cè)定試劑盒因使用葡萄糖-6-磷酸脫氫酶偶聯(lián)物導(dǎo)致的穩(wěn)定性、特異性差的缺陷，提供一種丙戊酸均相酶免疫測(cè)定試劑盒，其具有穩(wěn)定性強(qiáng)和特異性好的效果，同時(shí)，本發(fā)明還提供了其制備方法。

2、本發(fā)明提供的丙戊酸均相酶免疫測(cè)定試劑盒的技術(shù)方案如下：

3、一種丙戊酸均相酶免疫測(cè)定試劑盒，包括r1試劑和r2試劑，其特征在于，所述r1試劑中包括緩沖液、小鼠抗丙戊酸單克隆抗體、l-蘋(píng)果酸、穩(wěn)定劑、防腐劑和表面活性劑；所述r2試劑中包括緩沖液、β-nad+、蘋(píng)果酸脫氫酶-丙戊酸偶聯(lián)物、保護(hù)劑和防腐劑。

4、該試劑盒的具體反應(yīng)原理為：試劑r2中含有的蘋(píng)果酸脫氫酶-丙戊酸偶聯(lián)物，通過(guò)丙戊酸與試劑r1中的小鼠抗丙戊酸單克隆抗體結(jié)合后，偶聯(lián)物種的蘋(píng)果酸脫氫酶的活性會(huì)被抑制，無(wú)法催化體系中β-nad+的轉(zhuǎn)化。而在檢測(cè)樣本時(shí)，由于樣本中含有小分子丙戊酸，可競(jìng)爭(zhēng)性地與蘋(píng)果酸脫氫酶-丙戊酸偶聯(lián)物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合體系中的小鼠抗丙戊酸單克隆抗體，小分子往往比相對(duì)更大的偶聯(lián)物更能穩(wěn)定地與小鼠抗丙戊酸單克隆抗體結(jié)合，從而釋放了蘋(píng)果酸脫氫酶-丙戊酸偶聯(lián)物，使蘋(píng)果酸脫氫酶的活性增強(qiáng)，進(jìn)而催化l-蘋(píng)果酸和β-nad+生成丙酮酸和nadh，其中nadh在340nm處有吸收峰，通過(guò)分析儀檢測(cè)nadh的含量變化，并繪制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而可通過(guò)檢測(cè)nadh的含量變化計(jì)算得到樣本中丙戊酸的濃度。

5、所述小鼠抗丙戊酸單克隆抗體(克隆名稱：vp10-234.5為igg1型)購(gòu)買(mǎi)自上海博奧派克生物科技有限公司(派克生物)。

6、進(jìn)一步的，所述r1試劑的ph為6.5-7.0，具體包括：(50-250)mm緩沖液，(1-5)g/l小鼠抗丙戊酸單克隆抗體，(1-5)g/l?l-蘋(píng)果酸，(0.1-5)g/l穩(wěn)定劑，(0.5-5)ml/l防腐劑，質(zhì)量濃度(0.1-10)g/l表面活性劑；所述r2試劑的ph為8.0-8.5，具體包括：(50-250)mm緩沖液，(5-10)g/lβ-nad+，(0.1-10)g/l蘋(píng)果酸脫氫酶-丙戊酸偶聯(lián)物，(1-10)g/l穩(wěn)定劑，(0.1-5)g/l防腐劑。

7、進(jìn)一步的，所述的緩沖液為hepes緩沖液、pbs緩沖液、乙酸-乙酸鈉緩沖液、tris緩沖液、mopso緩沖液、tapso緩沖液、mes緩沖液、pipes緩沖液中的一種或多種。

8、進(jìn)一步的，所述的丙戊酸均相酶免疫測(cè)定試劑盒，其特征在于，所述穩(wěn)定劑為為酪蛋白、山梨醇、海藻糖、甘露醇、蔗糖中的一種或多種。

9、進(jìn)一步的，所述的丙戊酸均相酶免疫測(cè)定試劑盒，其特征在于，所述防腐劑為疊氮鈉、proclin?300中的一種或多種。

10、本發(fā)明還提供了一種上述丙戊酸均相酶免疫測(cè)定試劑盒的制備方法，所述方法包括：

11、【s1】r1試劑的制備：向磷酸緩沖液中依次加入l-蘋(píng)果酸、小鼠抗丙戊酸單克隆抗體、穩(wěn)定劑、防腐劑和表面活性劑，定容得到r1試劑；

12、【s2】蘋(píng)果酸脫氫酶-丙戊酸偶聯(lián)物的制備：將丙戊酸衍生物用活化緩沖溶解后，加入活化劑進(jìn)行活化，然后加入蘋(píng)果酸脫氫酶進(jìn)行偶聯(lián)，得到含蘋(píng)果酸脫氫酶-丙戊酸偶聯(lián)物混合物溶液。

13、【s3】r2試劑的制備：向緩沖液中依次加入β-nad+、蘋(píng)果酸脫氫酶-丙戊酸偶聯(lián)物、穩(wěn)定劑和防腐劑，定容得到r2試劑。

14、進(jìn)一步的，步驟【s2】具體為：①先將丙戊酸衍生物置于二甲基亞砜有機(jī)溶劑中充分溶解，然后再將4-嗎啉乙磺酸加入活化劑1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽中充分溶解，上述兩種混合液再混合進(jìn)行活化，使活化劑和丙戊酸衍生物的摩爾比為2：1，在37℃條件下攪拌活化30min；②活化后加入蘋(píng)果酸脫氫酶，其中蘋(píng)果酸脫氫酶和丙戊酸的摩爾比為1：10，在溫度為37℃條件下攪拌偶聯(lián)2h，得到蘋(píng)果酸脫氫酶-丙戊酸偶聯(lián)物粗品；③將上述蘋(píng)果酸脫氫酶-丙戊酸偶聯(lián)物粗品用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行透析提純12h，即得到蘋(píng)果酸脫氫酶-丙戊酸偶聯(lián)物；

15、所述丙戊酸衍生物為市售丙戊酸衍生物，購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，(名稱為abs205,丙戊酸衍生物，貨號(hào)為a275764-50mg)。

16、本發(fā)明具有如下的有益效果：

17、1、本發(fā)明通過(guò)將丙戊酸均相酶免疫法測(cè)定試劑盒中使用的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶偶聯(lián)物替代為蘋(píng)果酸脫氫酶-丙戊酸偶聯(lián)物，蘋(píng)果酸脫氫酶相較于葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，具有耐熱、適應(yīng)ph更廣、在偶聯(lián)過(guò)程中活性損失少(即偶聯(lián)效率高)的優(yōu)點(diǎn)，能有效解決丙戊酸均相酶免疫法測(cè)定試劑盒穩(wěn)定性差的問(wèn)題。

18、2、本發(fā)明通過(guò)更換r1中的葡萄糖-6-磷酸為l-蘋(píng)果酸，使血清中的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶因無(wú)底物而無(wú)法發(fā)揮作用從而提高丙戊酸均相酶免疫法測(cè)定試劑盒的抗干擾能力，減弱臨床樣本測(cè)定中出現(xiàn)的假陽(yáng)性。

19、3、本發(fā)明通過(guò)調(diào)節(jié)r2的緩沖體系，促進(jìn)nadh的產(chǎn)生而提高整體反應(yīng)的反應(yīng)靈敏度。蘋(píng)果酸脫氫酶代謝l-蘋(píng)果酸生成草酰乙酸的方程式如下：

20、

21、l-蘋(píng)果酸是蘋(píng)果酸脫氫酶的底物，穩(wěn)定性好、價(jià)格低廉，代謝后產(chǎn)生的產(chǎn)物為草酰乙酸，而草酰乙酸在弱酸性條件下不穩(wěn)定，容易發(fā)生非酶促脫羧反應(yīng)而降解成為二氧化碳和水，從而造成反而進(jìn)一步向右推進(jìn)，加速反應(yīng)速率，產(chǎn)生nadh的速率快，反應(yīng)靈敏度提高。