本發(fā)明涉及醫(yī)藥，尤其是涉及一種基于nlrp3炎癥小體的類風濕性關節(jié)炎輔助檢測方法及試劑盒。

背景技術：

1、類風濕關節(jié)炎（rheumatoid?arthritis，ra），是一種高發(fā)病率和高致殘率的系統(tǒng)性自身免疫病。ｒa?病因復雜，病理機制至今未明，發(fā)病率高，5年期致殘率高。ra全球患病率為0.2%-1%，多見于中年女性。在我國的發(fā)病率為0.32%-0.36%。

2、ra主要以劇烈的滑膜炎癥、新生血管形成以及骨與軟骨組織損傷為病理特征；病變早期劇烈的滑膜炎導致滑膜血管翳新生，后期炎癥與增生的血管翳侵襲軟骨與骨組織，破壞骨基質，導致關節(jié)結構損傷，活動障礙，功能喪失。

3、目前，尚無可以治愈該病的特效治療方式，但是在疾病早期進行診斷可以有效地控制臨床癥狀、延緩疾病進展，預防并減少關節(jié)骨破壞，從而改善疾病預后。因此，疾病早期診斷并采取有效治療措施對ra疾病管理極為重要。類風濕因子(rheumatoid?factor,?rf)、抗環(huán)瓜氨酸多肽抗體(anti-cyclic?citrullinated?peptide?antibody,?anti-ccp)、抗ra33抗體(anti-ra33)、抗sa抗體(anti-sa)、和抗角蛋白抗體(antikeratin?antibody,aka)等多種自身抗體在ra患者血清中呈現(xiàn)陽性，且處于高水平；雖然通過臨床表現(xiàn)、影像學檢測以及自身抗體測定可以對ra進行診斷，但是，例如經典的rf和ccp抗體，約有20%-30%的ra患者呈現(xiàn)陰性；加上ra癥狀早期不典型，與強直性脊柱炎（ankylosing?spondylitis,as）、骨關節(jié)炎（osteoarthritis,?oa）及系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic?lupuserythematosus,?sle)關節(jié)受累等難以鑒別。

4、因此，存在部分患者的診斷困難，延誤患者的最佳治療時間，導致嚴重的不可以的骨關節(jié)破壞；另外，抗風濕藥物和生物制劑的應用顯著改善了患者的預后。然而，部分患者對目前的治療無效，生物治療增加了嚴重感染的風險。因此，發(fā)現(xiàn)更為靈敏和特異的診斷指標，明確ra骨損害的具體發(fā)病機制以及探索新的治療靶點具有非常重要的臨床價值。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供了用于類風濕性關節(jié)炎的輔助檢測方法，本發(fā)明采用western?blot方法檢測nlrp3炎癥小體組成成分的蛋白表達情況，用elisa方法檢測nlrp3炎癥小體下游分子il-1β和il-18的血清水平，可以用于鑒定類風濕性關節(jié)炎患者。

2、為實現(xiàn)以上技術目的，本發(fā)明采用以下技術方案：

3、一種基于nlrp3炎癥小體的類風濕性關節(jié)炎輔助檢測方法，包括：

4、1)加樣：將孔板上的孔劃分為標準孔，待測樣品孔，空白孔，其中所述標準孔有3孔，向個標準孔中分別加入3種陽性質控，每種陽性質控各50μl，空白孔加50μl陰性質控，待測樣品孔中加入待測樣品50μl；每孔加工作液r150μl，振動混勻，孔板加覆膜，于37℃溫育1小時；

5、2)棄去孔內液體，每孔用250μl的濃縮清洗洗滌液洗滌，浸泡1分鐘，而后清除孔內所有液體；重復洗板3次，最后一次洗滌后，倒出剩余的濃縮清洗洗滌液，將酶標板倒扣在吸水紙上，將殘留在孔內的液體全部吸干；

6、3)每孔加tmb底物100μl，酶標板加上覆膜，于37℃避光顯色10～30min；

7、4)每孔加終止液50μl，終止反應。

8、作為優(yōu)選，還包括：

9、用western?blot方法檢測nlrp3炎癥小體組成成分的蛋白表達情況；

10、用elisa方法檢測nlrp3炎癥小體下游分子il-1β和il-18的血清水平；

11、對?nlrp3炎癥小體的表達、下游炎癥因子的水平、ｒａ疾病活動的情況進行相關性分析。

12、作為優(yōu)選，步驟用western?blot方法檢測nlrp3炎癥小體組成成分的蛋白表達情況中，包括：

13、用western?blot分別檢測中性粒細胞和pbmc中caspase-1的蛋白表達情況，并用image?j軟件分析蛋白條帶的灰度值，用內參蛋白β-actin的條帶灰度值將結果標準化。

14、一種基于nlrp3炎癥小體的類風濕性關節(jié)炎輔助檢測試劑盒，應用于如上所述類風濕性關節(jié)炎輔助檢測方法，包括：

15、分別包被有atg5抗原、atg8抗原、beclin1抗原的孔板；

16、陽性質控：atg5陽性血清，atg8陽性血清，beclin1陽性血清；

17、陰性質控：健康人陰性血清；

18、工作液r：標記有hrp的抗人atg5抗體，標記有hrp的抗人atg8抗體，標記有hrp的抗人beclin1抗體；

19、稀釋液：去離子水；

20、tmb底物；

21、終止液：1mol/l的h2so4溶液；

22、濃縮清洗洗滌液：pbs-tween緩沖液。

23、作為優(yōu)選，所述標記有hrp的抗人atg5抗體，標記有hrp的抗人atg8抗體，標記有hrp的抗人beclin1抗體各為150μl。

24、作為優(yōu)選，所述孔板為96孔板。

25、作為優(yōu)選，所述tmb底物有15份，每份為100μl。

26、作為優(yōu)選，所述去離子水的體積為工作液r總體積的100倍。

27、作為優(yōu)選，所述健康人陰性血清為50μl。

28、作為優(yōu)選，所述濃縮清洗洗滌液有20份，每份為250μl。

29、本試劑盒應用競爭抑制酶聯(lián)免疫分析法測定樣本中atg5、atg8、beclin1的含量。將單克隆抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗體的微孔中同時加入生物素標記的抗原和待測抗原(標準品或樣本)，待測抗原與生物素標記抗原對特異性抗體進行競爭結合。溫育后經洗滌去掉未結合物，然后加入hrp標記的親和素，經過溫育和徹底洗滌后加入底物tmb顯色。tmb在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。待測標本濃度越高，標記抗原和抗體的結合就越受到抑制，顯色愈淺。顯色的深淺與酶量呈正相關，而與樣品中待測物質含量呈負相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(od值)，計算樣品濃度。

30、本發(fā)明提供了一種基于nlrp3炎癥小體的類風濕性關節(jié)炎輔助檢測方法及試劑盒，該技術方案以首先探究了ra患者基因表達情況與病理特征之間的關系，研究發(fā)現(xiàn)，不同活動期間ra患者外周血單個核細胞中的atg5、atg8、beclin1基因的mrna相對表達水平呈不同程度的表達差異，表現(xiàn)出外周血單個核細胞beclin1和atg8等相關自噬基因的表達變化對ra的預后及活動具有一定的相關性和指向性?；谝陨戏e極的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明開發(fā)了一種基于自噬性基因檢測的ra輔助診斷試劑盒，該試劑盒以人的血清、血漿或其它體液作為生物檢材，采用競爭抑制elisa法定量測定其中atg5、atg8、beclin1含量，可以此為依據來實現(xiàn)ra的輔助檢查，并評價ra的病理特征和發(fā)展進程。本發(fā)明簡便易行，檢測過程對人體創(chuàng)傷較小，評價依據更為穩(wěn)定可靠。