本技術(shù)涉及分析檢測(cè)，尤其是涉及一種評(píng)價(jià)醬油存放過程中苦味變化的方法。

背景技術(shù)：

1、醬油的滋味豐富多樣，主要以咸鮮為主、酸甜為輔，適量的苦味能賦予醬油濃厚感和回味，對(duì)醬油的滋味具有一定的促進(jìn)作用。但是在醬油存放過程中，由于氧化、光照、溫度等因素的影響，醬油風(fēng)味會(huì)發(fā)生一定程度的變化，除了原有成分發(fā)生減少以外，還有一些未知的呈味物質(zhì)形成，風(fēng)味物質(zhì)組成的變化不可避免的會(huì)帶來產(chǎn)品品質(zhì)波動(dòng)，研究存放過程中風(fēng)味的變化，有助于深入研究變化的原因，并開發(fā)相應(yīng)的控制措施。

2、醬油儲(chǔ)存過程中，存在鮮味、甜味、苦味等風(fēng)味變化，目前對(duì)于醬油的鮮味變化關(guān)注最多，這主要得益于谷氨酸作為鮮味的物質(zhì)基礎(chǔ)已被廣泛認(rèn)知，在甜味方面，往往通過糖的含量可以較大程度上反映甜味的變化，因此更容易被察覺。相較而言，醬油苦味的物質(zhì)基礎(chǔ)目前仍處于模糊階段，苦味物質(zhì)種類多樣，醬油中天然存在苦味物質(zhì)，如苦味氨基酸、苦味肽等，儲(chǔ)存過程中其它苦味物質(zhì)的形成積累逐漸增強(qiáng)醬油的苦味，需要從復(fù)雜的體系中挖掘與儲(chǔ)存過程相關(guān)的苦味成分的難度也相應(yīng)更高，因此目前仍缺乏針對(duì)性檢測(cè)導(dǎo)致醬油儲(chǔ)存過程中苦味增強(qiáng)的關(guān)鍵成分研究和技術(shù)手段。醬油中成分復(fù)雜，其高鹽分及富含蛋白質(zhì)、糖類等物質(zhì)對(duì)苦味成分的分離及鑒定造成極大的困擾。

3、因此，開發(fā)一種針對(duì)醬油存放過程中苦味關(guān)鍵成分的分離、鑒定及定量檢測(cè)方法，對(duì)于評(píng)估醬油存放過程中苦味變化，制訂醬油產(chǎn)品存放過程中的控制標(biāo)準(zhǔn)、開發(fā)相應(yīng)的解決技術(shù)具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本技術(shù)的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種評(píng)價(jià)醬油存放過程中苦味變化的方法。本技術(shù)通過對(duì)存放過程中苦味物質(zhì)的分離與鑒定，并建立評(píng)價(jià)醬油存放過程中苦味變化的方法，構(gòu)建苦味成分與感官的量化關(guān)系，為醬油存放質(zhì)控和存放控制技術(shù)的開發(fā)提供關(guān)鍵的量化評(píng)估手段。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本技術(shù)采取的技術(shù)方案為：

3、本技術(shù)提供了一種評(píng)價(jià)醬油存放過程中苦味變化的方法，包括以下步驟：

4、(1)采用大孔樹脂分離收集待測(cè)醬油樣品中的目標(biāo)苦味物質(zhì)；

5、(2)采用制備液相色譜法分離檢測(cè)目標(biāo)苦味物質(zhì)水溶液的吸收強(qiáng)度，收集目標(biāo)苦味組分；

6、(3)采用高效液相色譜法對(duì)所述目標(biāo)苦味組分中的目標(biāo)苦味成分進(jìn)行定量，得到目標(biāo)苦味成分的含量；所述目標(biāo)苦味成分包括(s),(s)-1-甲基-1,2,3,4-四氫-β-咔啉-3-羧酸和(r),(s)-1-甲基-1,2,3,4-四氫-β-咔啉-3-羧酸；

7、(4)根據(jù)所述目標(biāo)苦味成分的含量和預(yù)先建立的苦味強(qiáng)度與苦味成分含量的關(guān)系，確定待測(cè)醬油樣品的苦味值。

8、醬油中的成分復(fù)雜，要獲得分離純度較好的苦味成分，需將其他呈味物質(zhì)最大限度地剝離?，F(xiàn)有研究認(rèn)為，苦味物質(zhì)大多具有較強(qiáng)的疏水性，除一些大分子苦味肽以外，大部分為小分子物質(zhì)，因此可以利用其極性、分子量、疏水性等差異對(duì)苦味成分進(jìn)行分離純化。

9、本技術(shù)采用以上方法，可以得到相對(duì)較純的目標(biāo)苦味組分，該目標(biāo)苦味組分是通過結(jié)合感官識(shí)別與存放過程差異樣本的苦味對(duì)比后逐步明確造成存放中苦味增強(qiáng)的關(guān)鍵成分。然后采用高效液相色譜法對(duì)目標(biāo)苦味組分中的目標(biāo)苦味成分進(jìn)行定量，得到目標(biāo)苦味成分的含量，并根據(jù)預(yù)先建立的苦味強(qiáng)度與苦味成分含量關(guān)系，確定待測(cè)醬油的苦味值，從而根據(jù)苦味值判斷醬油存放過程中苦味變化。

10、作為本技術(shù)所述評(píng)價(jià)醬油存放過程中苦味變化的方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述苦味強(qiáng)度與苦味成分含量的關(guān)系為：y＝-231.4+1.41x1-0.81x2(r2＝0.999)；

11、其中y表示tda苦味值，x1表示(s),(s)-1-甲基-1,2,3,4-四氫-β-咔啉-3-羧酸的含量，x2表示(r),(s)-1-甲基-1,2,3,4-四氫-β-咔啉-3-羧酸的含量。

12、作為本技術(shù)所述評(píng)價(jià)醬油存放過程中苦味變化的方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟(1)包括以下步驟：

13、s11、活化大孔樹脂后填充進(jìn)層析柱中；

14、s12、將待測(cè)醬油樣品加入到層析柱中進(jìn)行吸附；

15、s13、梯度洗脫并收集洗脫液濃縮凍干，得目標(biāo)苦味物質(zhì)。

16、在一些具體實(shí)施方式中，所述步驟s11中，活化大孔樹脂的方法為：用95％的乙醇浸泡大孔樹脂24h以上。

17、在一些具體實(shí)施方式中，所述大孔樹脂為中等極性的大孔樹脂，具體地，包括da-201、ab-8中的任意一種。所述大孔樹脂也可以采用da-201、ab-8同等類型的極性樹脂。

18、在一些具體實(shí)施方式中，所述步驟s12中，所述層析柱為具砂板存儲(chǔ)球?qū)游鲋?，?guī)格為：外徑(內(nèi)徑)*有效長度＝50(44)*400mm，儲(chǔ)液球500ml。

19、在一些具體實(shí)施方式中，所述步驟s12中，所述吸附的時(shí)間為15min。

20、在一些具體實(shí)施方式中，在將活化完的大孔樹脂填充進(jìn)層析柱中后，還包括用純水進(jìn)行沖洗的步驟，沖洗的終點(diǎn)為沖洗液無醇味。

21、在一些具體實(shí)施方式中，凍干條件包括：冷阱溫度-40～-50℃，壓力0.04～0.4mpa，凍干時(shí)間48h～72h。

22、作為本技術(shù)所述評(píng)價(jià)醬油存放過程中苦味變化的方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟s13中依次采用水、15-25％乙醇、35-45％乙醇和75-85％乙醇進(jìn)行洗脫，洗脫速率控制在10-20ml/min。

23、采用上述梯度洗脫程序進(jìn)行洗脫，使得得到的苦味物質(zhì)的苦味強(qiáng)度可以較好地和苦味成分含量建立聯(lián)系，提升檢測(cè)苦味成分的準(zhǔn)確度和靈敏度。

24、作為本技術(shù)所述評(píng)價(jià)醬油存放過程中苦味變化的方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述洗脫液在230nm下的吸光度數(shù)值＜0.35。

25、作為本技術(shù)所述評(píng)價(jià)醬油存放過程中苦味變化的方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟(2)包括以下步驟：

26、s21、將目標(biāo)苦味物質(zhì)先用超純水溶解，再注入制備液相色譜柱中，然后用流動(dòng)相洗脫；

27、s22、檢測(cè)在波長為190-400nm下目標(biāo)苦味物質(zhì)水溶液的吸收強(qiáng)度，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果收集目標(biāo)苦味組分。

28、作為本技術(shù)所述評(píng)價(jià)醬油存放過程中苦味變化的方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述流動(dòng)相包括0.05-0.5％甲酸水溶液的流動(dòng)相a和100％的甲醇溶液的流動(dòng)相b；

29、所述洗脫的步驟包括：0-7min采用85-95％的流動(dòng)相a，7-10min采用從85-95％的流動(dòng)相a變?yōu)?0-20％的流動(dòng)相a，10-15min采用10-20％的流動(dòng)相a，柱溫為35℃，流速為0.5ml/min。

30、本技術(shù)采用大孔樹脂結(jié)合制備液相分離純化可以得到純度較高的苦味成分。

31、作為本技術(shù)所述評(píng)價(jià)醬油存放過程中苦味變化的方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟(4)中苦味強(qiáng)度與苦味成分含量的關(guān)系的建立包括以下步驟：

32、s41、采用大孔樹脂分離收集醬油樣品中的苦味物質(zhì)；

33、s42、采用制備液相色譜法分離所述苦味物質(zhì)，收集苦味組分；

34、s43、采用高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)步驟s42獲得的苦味組分進(jìn)行成分解析，再采用高效液相色譜法對(duì)解析得到的苦味成分進(jìn)行定量，得到苦味成分含量；

35、s44、檢測(cè)苦味組分的苦味值，根據(jù)苦味值和苦味成分含量建立苦味強(qiáng)度與苦味成分含量的關(guān)系。

36、本技術(shù)采用以上方法，可以得到相對(duì)較純的苦味組分，結(jié)合感官識(shí)別與存放過程差異樣本的苦味對(duì)比，逐步明確造成存放中苦味增強(qiáng)的關(guān)鍵成分(即苦味組分)，通過高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法技術(shù)明確其中苦味成分的結(jié)構(gòu)，并建立苦味強(qiáng)度與苦味成分含量關(guān)系，以用于判斷醬油存放過程中苦味變化。

37、作為本技術(shù)所述評(píng)價(jià)醬油存放過程中苦味變化的方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述苦味成分包括1,2,3,4-四氫-β-咔啉-3-羧酸、(s),(s)-1-甲基-1,2,3,4-四氫-β-咔啉-3-羧酸、(r),(s)-1-甲基-1,2,3,4-四氫-β-咔啉-3-羧酸和1-甲基-β-咔啉；

38、所述苦味強(qiáng)度與苦味成分含量的關(guān)系為：y＝-231.4+1.41x1-0.81x2(r2＝0.999)；

39、其中y表示tda苦味值，x1表示(s),(s)-1-甲基-1,2,3,4-四氫-β-咔啉-3-羧酸的含量，x2表示(r),(s)-1-甲基-1,2,3,4-四氫-β-咔啉-3-羧酸的含量。

40、采用高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)苦味成分定性，得到四個(gè)色譜峰，經(jīng)過二級(jí)質(zhì)譜及標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)，得到4種苦味成分，分別為1,2,3,4-四氫-β-咔啉-3-羧酸、(s),(s)-1-甲基-1,2,3,4-四氫-β-咔啉-3-羧酸、(r),(s)-1-甲基-1,2,3,4-四氫-β-咔啉-3-羧酸和1-甲基-β-咔啉。

41、再采用高效液相色譜法對(duì)苦味成分進(jìn)行定量，通過標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間和準(zhǔn)分子離子峰進(jìn)行定性，峰面積進(jìn)行定量，四種苦味成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線都具有良好的線性關(guān)系，r2均大于0.99。其中，(s),(s)-1-甲基-1,2,3,4-四氫-β-咔啉-3-羧酸、(r),(s)-1-甲基-1,2,3,4-四氫-β-咔啉-3-羧酸的含量具有顯著性，由此建立苦味強(qiáng)度和苦味成分含量關(guān)系，用于判斷不同存放方法樣品間的苦味差異。

42、在一些具體實(shí)施方式中，在步驟s41之前，還包括：先采用大孔樹脂分離收集醬油原油中的苦味物質(zhì)，再采用制備液相色譜法分離所述醬油原油中的苦味物質(zhì)，收集苦味組分。

43、由于醬油原油的成分相比于醬油更為簡(jiǎn)單，采用醬油原油收集苦味組分，并確定關(guān)鍵苦味成分，更容易且更準(zhǔn)確。

44、作為本技術(shù)所述評(píng)價(jià)醬油存放過程中苦味變化的方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述步驟s43中，高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法中質(zhì)譜條件為：采用esi+電離模式，脫溶劑氣化溫度250-350℃，毛細(xì)管電壓3-4kv，錐孔氣體流速10-12l/min，碰撞能量10、20和40v，掃描范圍100-3000m/z。

45、作為本技術(shù)所述評(píng)價(jià)醬油存放過程中苦味變化的方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法采用advancebio?peptide?map的色譜柱，2.1mm×100mm，2.7-micron。

46、本技術(shù)還提供了上述方法在評(píng)價(jià)醬油存放過程中苦味變化上的應(yīng)用。

47、本技術(shù)從物質(zhì)層面解析出醬油存放過程中苦味變化的原因，并建立了苦味成分的定量檢測(cè)方法；并通過建立苦味成分含量與苦味強(qiáng)度的關(guān)系，實(shí)現(xiàn)了對(duì)苦味感官的量化分析。

48、此外，本技術(shù)還驗(yàn)證了苦味強(qiáng)度與苦味成分含量關(guān)系(y＝-231.4+1.41x1-0.81x2(r2＝0.999)，其中y表示tda苦味值，x1表示(s),(s)-1-甲基-1,2,3,4-四氫-β-咔啉-3-羧酸的含量，x2表示(r),(s)-1-甲基-1,2,3,4-四氫-β-咔啉-3-羧酸的含量)對(duì)于評(píng)價(jià)同類型醬油不同生產(chǎn)日期苦味的準(zhǔn)確性，結(jié)果可知，采用本發(fā)明的評(píng)價(jià)方法不僅能夠準(zhǔn)確的檢測(cè)出不同生產(chǎn)日期的醬油的苦味值，還能同樣適用于同一種原油不同的存放條件或者適用不同原油的苦味變化。

49、本技術(shù)的評(píng)價(jià)方法是從物質(zhì)層面上比較不同生產(chǎn)日期的樣品的苦味強(qiáng)度，較傳統(tǒng)的感官評(píng)價(jià)更高效和科學(xué)。

50、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本技術(shù)具有以下有益效果：

51、本技術(shù)提供了一種評(píng)價(jià)醬油存放過程中苦味變化的方法，本技術(shù)采用大孔樹脂結(jié)合液相分離純化得到較純的苦味物質(zhì)，結(jié)合感官識(shí)別與存放過程差異樣本的苦味組分，逐步明確造成存放中苦味增強(qiáng)的關(guān)鍵成分(即苦味成分)，通過高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法技術(shù)及標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證得到苦味成分中的4種成分，并建立苦味強(qiáng)度與苦味成分含量關(guān)系，以用于確定待測(cè)醬油樣品的苦味值，從而判斷醬油存放過程中苦味變化。相對(duì)于目前感官評(píng)價(jià)的方式，本技術(shù)可以排除主觀因素的影響，實(shí)現(xiàn)了對(duì)苦味的量化分析，有助于實(shí)現(xiàn)醬油產(chǎn)品存放過程中的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)化及醬油存放過程中控制技術(shù)的開發(fā)。