本發(fā)明屬于醫(yī)療診斷儀器試劑，具體涉及一種線性寬范圍血球儀試劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
1、血液分析是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)診斷中不可或缺的一部分，廣泛應(yīng)用于臨床診斷、疾病監(jiān)測和健康檢查。血球儀作為一種重要的血液分析工具，能夠快速、準(zhǔn)確地檢測血液中的各種細(xì)胞成分，如紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板等。然而，現(xiàn)有的血球儀試劑在檢測范圍和準(zhǔn)確性等方面存在一定的局限性。
2、現(xiàn)有的血球儀試劑制備過程復(fù)雜，不利于大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用，且部分試劑為進(jìn)口試劑，不僅周期長且價(jià)格高。同時(shí)，許多現(xiàn)有的血球儀試劑只能覆蓋有限的檢測范圍，無法滿足臨床對廣泛血液參數(shù)的需求，例如，某些試劑在檢測低濃度或高濃度血液樣本時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)誤差或無法檢測。此外，傳統(tǒng)試劑在儲(chǔ)存和使用過程中容易受到環(huán)境因素的影響，導(dǎo)致檢測結(jié)果不穩(wěn)定。
3、中國專利cn?104698157?b涉及一種血細(xì)胞分析儀用試劑，所述試劑由稀釋液、eoi溶血?jiǎng)h溶血?jiǎng)?、eoii染色液和清洗液組成，此試劑使用范圍廣，適用機(jī)型多，檢測結(jié)果準(zhǔn)確，與原裝血球試劑的線性回歸后相關(guān)系數(shù)r值達(dá)到0.99以上，體現(xiàn)為較好的相關(guān)性，而且試劑原材料無毒無害，有利于該血細(xì)胞分析儀用試劑的推廣和應(yīng)用。然而，此試劑不涉及抗凝性的研究，而抗凝劑不僅涉及到采血后樣本的處理和保存，且其選擇對于血細(xì)胞的計(jì)數(shù)和分類至關(guān)重要。
4、因此，亟需開發(fā)一種線性寬范圍血球儀試劑，使得試劑檢測結(jié)果穩(wěn)定、準(zhǔn)確。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、針對現(xiàn)有的技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供一種線性寬范圍血球儀試劑及其制備方法，所述血球儀試劑由稀釋液、溶血?jiǎng)?、染色劑和清洗液組成。本發(fā)明的血球儀試劑具有優(yōu)異的抗凝血性，能夠在更寬的檢測范圍內(nèi)提供準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，同時(shí)具有更好的穩(wěn)定性和經(jīng)濟(jì)性，應(yīng)用和市場價(jià)值高。
2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
3、本發(fā)明一方面提供了一種線性寬范圍血球儀試劑，所述血球儀試劑由稀釋液、溶血?jiǎng)?、染色劑和清洗液組成；其中，
4、所述稀釋液的組分及含量為：滲透壓調(diào)節(jié)劑5-8g/l，緩沖劑1-2g/l，抗凝劑0.3-0.6g/l，防腐劑0.2-0.4g/l；
5、所述溶血?jiǎng)┑慕M分及含量為：滲透壓調(diào)節(jié)劑1.6-2.4g/l，季銨鹽表面活性劑2.8-4.2g/l，非離子表面活性劑4-6.5g/l，穩(wěn)定劑1.6-2.4g/l，edtak20.1-0.3g/l，triton?x-1001-1.5g/l，4-羥乙基哌嗪乙磺酸3-6g/l，丁二酸0.6-1g/l；
6、所述染色劑的組分及含量為：聚次甲基染料0.015-0.035g/l，甲醇25-35g/l，乙二醇900-1000g/l；
7、所述清洗液的組分及含量為：滲透壓調(diào)節(jié)劑5-10g/l，壬基酚聚氧乙烯醚2-4.5g/l，緩沖劑1-2.5g/l，防腐劑0.1-0.3g/l，復(fù)合酶6-12g/l。
8、本發(fā)明的反應(yīng)機(jī)理和作用如下：
9、1.生物醫(yī)用材料由于其特殊的應(yīng)用，需要具有良好的生物相容性，這是決定材料能否作為血液接觸類醫(yī)用材料的關(guān)鍵。本發(fā)明合成了一種具有超支化結(jié)構(gòu)的抗凝劑，通過分子設(shè)計(jì)與合成，制備具有良好抗凝血性能的超支化材料，可以拓寬其在生物醫(yī)用材料領(lǐng)域的應(yīng)用。
10、本發(fā)明合成的抗凝劑經(jīng)過修飾后其表面與血液組分之間存在靜電排斥作用，具有良好的抗凝血性。本技術(shù)選取2,2-二異戊基-1,3-丙二醇、2-羥基-4-戊烯酸為單體合成支化結(jié)構(gòu)，然而其溶解性較差，可能是由于酯基和羥基形成的分子間氫鍵以及不飽和雙鍵的存在。申請人通過2-氯丙酸引入羧酸基團(tuán)來改善物質(zhì)的血液相容性，這是因?yàn)轸人峄鶊F(tuán)不僅可以使材料表面帶有一定的負(fù)電荷，還破壞了不飽和雙鍵的存在。進(jìn)一步地，引入1,3-丙烷磺內(nèi)酯，其結(jié)構(gòu)中的磺酸基具有較好的水溶性，會(huì)破壞羥基間的氫鍵作用，進(jìn)而提升超支化物質(zhì)的溶解性，充分發(fā)揮其優(yōu)異的抗凝血性，也為超支化物質(zhì)在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供了更多可能。
11、2.本發(fā)明在苯并噻唑的分子骨架上，通過加入2-苯乙硫醇來引入巰酯基，合成苯并雜環(huán)的巰酯類穩(wěn)定劑。一方面，新型的穩(wěn)定劑結(jié)構(gòu)利用硫原子的孤對電子降低了苯基苯并噻唑類的剛性結(jié)構(gòu)，使得分子結(jié)構(gòu)更加柔韌，增強(qiáng)了紫外吸收強(qiáng)度，提高了穩(wěn)定性。另一方面，通過穩(wěn)定劑可以使陽離子表面活性劑與血紅蛋白形成的復(fù)合物，在儀器檢測時(shí)間內(nèi)保持特定波長的吸光度值不變，顯著提高血紅蛋白濃度測定的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。
12、在一些實(shí)施方式中，所述滲透壓調(diào)節(jié)劑為氯化鈉、氯化鉀和硫酸鈉中的任意一種或多種。
13、在一些實(shí)施方式中，所述季銨鹽表面活性劑為十二烷基三甲基氯化銨、十二烷基三甲基溴化銨、十二烷基二甲基芐基氯化銨、十四烷基三甲基氯化銨、十四烷基三甲基溴化銨、十六烷基三甲基氯化銨和十六烷基四甲基氯化銨中的任意一種或多種。
14、在一些實(shí)施方式中，所述非離子表面活性劑為聚氧乙烯月桂醚、聚氧乙烯硬脂酸酯和烷基酚聚氧乙烯醚中的任意一種或多種。
15、優(yōu)選地，所述防腐劑為proclin?300。
16、優(yōu)選地，所述緩沖劑為硼砂和/或硼酸。
17、優(yōu)選地，所述復(fù)合酶為堿性蛋白酶和絲氨酸蛋白酶。
18、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述堿性蛋白酶和絲氨酸蛋白酶的含量比為1：(2-3)。
19、在一些實(shí)施方式中，所述抗凝劑的制備方法，包含如下步驟：
20、s1.將2,2-二異戊基-1,3-丙二醇、2-羥基-4-戊烯酸加入至反應(yīng)釜中，通入惰性氣體，加熱至120-140℃，加入催化劑，保溫反應(yīng)3-4h，減壓繼續(xù)反應(yīng)3-4h，降溫至45-55℃，加入丙酮，攪拌，再加入正己烷，過濾，得到沉淀產(chǎn)物；
21、s2.將步驟s1得到的沉淀產(chǎn)物、丙酮混合，攪拌，加入2-氯丙酸，通入惰性氣體，加熱至50-70℃，加入路易斯酸催化劑，保溫反應(yīng)2-4h，冷卻，得到中間產(chǎn)物；
22、s3.將氫化鈉分散于四氫呋喃中，得到氫化鈉溶液，備用；將氫化鈉溶液滴入步驟s2得到的中間產(chǎn)物中，反應(yīng)10-12h，加入1,3-丙烷磺內(nèi)酯，繼續(xù)攪拌反應(yīng)10-12h，過濾，得到的固體溶于二甲基亞砜中，再加入四氫呋喃沉淀，將沉淀得到的粗產(chǎn)物真空干燥，用二次水透析，透析產(chǎn)物再真空干燥，得到抗凝劑。
23、在一些實(shí)施方式中，步驟s1中所述2,2-二異戊基-1,3-丙二醇和2-羥基-4-戊烯酸的摩爾比為1：(8.2-8.6)。
24、在一些實(shí)施方式中，步驟s3中所述中間產(chǎn)物和1,3-丙烷磺內(nèi)酯的摩爾比為1：(2-2.4)。
25、優(yōu)選地，步驟s2中所述沉淀產(chǎn)物和2-氯丙酸的摩爾比為1：(8.1-8.4)。
26、在一些實(shí)施方式中，所述穩(wěn)定劑的制備方法，包含如下步驟：
27、將1,3-苯并噻唑-2-羰酰氯、四氫呋喃加入至反應(yīng)釜中，攪拌溶解，加入三乙胺，通入惰性氣體，攪拌10-20min，-4-2℃的冰水浴下滴加2-苯乙硫醇，加熱至50-60℃，反應(yīng)5-6h，用乙酸乙酯萃取分層，取有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，并用色譜柱分離提純，得到穩(wěn)定劑。
28、在一些實(shí)施方式中，所述1,3-苯并噻唑-2-羰酰氯和2-苯乙硫醇的摩爾比為1：(1.6-1.9)。
29、本發(fā)明另一方面提供了一種線性寬范圍血球儀試劑的制備方法，包含如下步驟：
30、將稀釋液、溶血?jiǎng)⑷旧珓┖颓逑匆褐械母鹘M分按比例混合配料后進(jìn)行粗濾，再用濾膜進(jìn)行超濾，包裝，得到血球儀試劑。
31、優(yōu)選地，所述超濾的濾膜粒徑為0.22μm。
32、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下：
33、1.本發(fā)明的血球儀試劑具有優(yōu)異的抗凝血性，能夠在更寬的檢測范圍內(nèi)提供準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，同時(shí)具有更好的穩(wěn)定性和經(jīng)濟(jì)性，應(yīng)用和市場價(jià)值高。
34、2.本發(fā)明合成的抗凝劑經(jīng)過修飾后其表面與血液組分之間存在靜電排斥作用，具有良好的抗凝血性。申請人通過引入2-氯丙酸、1,3-丙烷磺內(nèi)酯來改善抗凝劑的血液相容性與溶解性，使其充分發(fā)揮其優(yōu)異的抗凝血性，也為超支化物質(zhì)在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供了更多可能。
35、3.本發(fā)明合成苯并雜環(huán)的巰酯類穩(wěn)定劑不僅能夠增強(qiáng)紫外吸收強(qiáng)度，提高穩(wěn)定性，還能顯著提高血紅蛋白濃度測定的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性。