本發(fā)明屬于蒙藥制劑及質(zhì)量檢測(cè)，特別涉及一種蒙藥炒蒺藜配方顆粒及其指紋圖譜的構(gòu)建方法和指紋圖譜。

背景技術(shù)：

1、炒蒺藜(tribuli?fructus)，為蒺藜科植物蒺藜(tribulus?terrestris?l.)的干燥成熟果實(shí)。在蒙醫(yī)理論體系中，炒蒺藜性甘、微苦，溫，輕、銳、稀。可祛腎寒，鎮(zhèn)“赫依”，利尿，消腫，強(qiáng)壯。用于尿頻，尿閉，腎寒，腎“赫依”病，腰腿痛，游痛癥，遺精，陽(yáng)痿，水腫?，F(xiàn)代研究表明，炒蒺藜具有降血壓、免疫調(diào)節(jié)、解毒止癢，以及抑制乙酰膽堿作用等。傳統(tǒng)蒙醫(yī)傾向于將藥材研磨成粉后直接入藥，但此方式患者適應(yīng)性較差，吞咽困難，口感不佳；且此種藥材粉末極易吸潮，流動(dòng)性差，無法適配現(xiàn)代自動(dòng)配藥機(jī)。針對(duì)以上問題，蒙藥配方顆粒應(yīng)運(yùn)而生，在保證藥效的同時(shí)，具有口感好、劑量調(diào)解方便、流動(dòng)性好、吸濕性弱、規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一等優(yōu)點(diǎn)。但由于每種藥材的物理性質(zhì)不同，因此不同的藥材所適合的輔料及其比例也不同，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說也非顯而易見的，這也加大了蒙藥配方顆粒的制備難度。指紋圖譜技術(shù)具有整體性和模糊性的特點(diǎn)，能夠較為全面地反應(yīng)出藥物的內(nèi)在成分，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于中藥及民族藥的質(zhì)量評(píng)價(jià)、真?zhèn)舞b別等方面，也在國(guó)際上得到了廣泛的認(rèn)可，成為傳統(tǒng)藥物的新一代質(zhì)量控制手段。

2、但目前暫無炒蒺藜藥材及相關(guān)制劑超高效液相指紋圖譜的專利和文獻(xiàn)報(bào)道，2020版《中國(guó)藥典》中仍采用紫外-可見分光光度法測(cè)定有效部位含量作為蒺藜的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，如何提高炒蒺藜的質(zhì)量控制方法，成為目前亟待解決的問題。指紋圖譜雖然能全面地反應(yīng)出藥物的內(nèi)在成分，但對(duì)于具體化合物的詳細(xì)信息卻難以提供。因此有學(xué)者采用液質(zhì)構(gòu)建指紋圖譜，但采用液質(zhì)構(gòu)建指紋圖譜成本太高，從而難以普及。此外，有學(xué)者嘗試用液相構(gòu)建指紋圖譜，用液質(zhì)來定性指紋圖譜中的化學(xué)成分，但由于液相和液質(zhì)的儀器內(nèi)部構(gòu)造不同，即使是同樣的色譜柱和液相條件下，同一化合物在保留時(shí)間上仍有著較大差別，使得液相與液質(zhì)上的色譜峰無法對(duì)應(yīng)。且中藥中的成分復(fù)雜，可能會(huì)有一些無市售及無法獲得的對(duì)照品化合物，從而無法對(duì)指紋圖譜進(jìn)行峰指認(rèn)。目前尚未有文獻(xiàn)和專利報(bào)道這些問題的解決方案。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種蒙藥炒蒺藜配方顆粒及其制備方法，旨在解決傳統(tǒng)炒蒺藜給藥方式(即炒蒺藜粉)依從性差、攜帶不便、易吸潮、流動(dòng)性差等問題。同時(shí)提供一種炒蒺藜配方顆粒指紋圖譜的構(gòu)建方法，該構(gòu)建方法屬于“雙標(biāo)一質(zhì)”法，“內(nèi)標(biāo)”用來推測(cè)超高效液相色譜圖中未知色譜峰在超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用上的保留時(shí)間，使得超高效液相與超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用上的色譜峰相對(duì)應(yīng)，是連接二者的橋梁；“外標(biāo)”為采用對(duì)照品對(duì)液相色譜圖進(jìn)行峰指認(rèn)，也是對(duì)超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用定性化合物結(jié)果的驗(yàn)證；“一質(zhì)”為采用超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用來定性化合物，三者結(jié)合為“雙標(biāo)一質(zhì)”。一方面旨在彌補(bǔ)單一指紋圖譜只能模糊評(píng)價(jià)藥材相似度而無法提供具體化學(xué)成分信息的缺陷；另一方面旨在提供一種快速、準(zhǔn)確、成本較低的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，確保炒蒺藜配方顆粒的質(zhì)量可控性、安全性和有效性，克服現(xiàn)有質(zhì)量控制方法單一性的缺陷，為提升炒蒺藜的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和完善民族藥質(zhì)量檢測(cè)體系提供了科學(xué)依據(jù)。

2、為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，采用以下技術(shù)方案。

3、本發(fā)明提供一種蒙藥炒蒺藜配方顆粒，組成成分包括炒蒺藜細(xì)粉和藥用輔料。

4、進(jìn)一步地，所述炒蒺藜細(xì)粉為蒙藥炒蒺藜藥材經(jīng)粉碎后能夠通過80～120目的篩下物，所述炒蒺藜藥材為道地藥材。

5、進(jìn)一步地，所述藥用輔料為藥學(xué)上的常用輔料，包括羧甲基纖維素鈉(cmc-naph7)、羥丙基甲基纖維素(hpmc?e5)、聚乙烯吡咯烷酮(pvp?k-25、pvp?k-30)中的一種或者多種組合。

6、進(jìn)一步地，所述藥用輔料中羧甲基纖維素鈉(cmc-na?ph7)的添加量為1wt％～5wt％。

7、進(jìn)一步地，所述藥用輔料中羥丙基甲基纖維素(hpmc?e5)的添加量為3wt％～7wt％。

8、進(jìn)一步地，所述藥用輔料中聚乙烯吡咯烷酮(pvp?k-25、pvp?k-30)的添加量為3wt％～7wt％。

9、本發(fā)明還提供一種蒙藥炒蒺藜配方顆粒的制備方法，具體包括以下步驟：

10、步驟1：將蒙藥炒蒺藜藥材粉碎后過篩，得到炒蒺藜細(xì)粉；

11、步驟2：將步驟1得到的炒蒺藜細(xì)粉與藥用輔料和純凈水混合，進(jìn)行濕法制粒；

12、步驟3：將步驟2所得制粒干燥，干燥后進(jìn)行整粒，得到蒙藥炒蒺藜配方顆粒。

13、優(yōu)選的，步驟1中所述過篩為過80～120目篩，收集所篩下部分為炒蒺藜細(xì)粉。

14、優(yōu)選的，步驟2中所述純凈水為藥用純化水，添加量為60～80ml/(100g炒蒺藜細(xì)粉)。

15、優(yōu)選的，步驟2中所述混合的時(shí)間為20～40min。

16、優(yōu)選的，步驟2中所述濕法制粒所用篩網(wǎng)的目數(shù)為10～20目。

17、優(yōu)選的，步驟3中所述干燥的溫度為40℃～60℃，干燥時(shí)間為3h～6h。

18、優(yōu)選的，步驟3中所述整粒所用篩網(wǎng)的目數(shù)為14～25目。

19、進(jìn)一步地，所述蒙藥炒蒺藜配方顆粒的含水量＜8％；蒙藥炒蒺藜配方顆粒的休止角＜40°，引濕率＜15％，粒度＜10％。

20、本發(fā)明還提供一種蒙藥炒蒺藜配方顆粒指紋圖譜的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

21、步驟1：取炒蒺藜配方顆粒研細(xì)，精密加入提取溶劑，密塞進(jìn)行超聲提取，濾過，取續(xù)濾液即得樣品溶液；

22、步驟2：將步驟1得到的樣品溶液采用超高效液相色譜進(jìn)行檢測(cè)，得到樣品色譜圖；

23、步驟3：將步驟2所得樣品色譜圖導(dǎo)入色譜評(píng)價(jià)軟件中，標(biāo)記共有峰，建立指紋圖譜，生成對(duì)照?qǐng)D譜，并計(jì)算各批樣品指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜相似度，通過相似度對(duì)多個(gè)批次的炒蒺藜配方顆粒的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)；

24、步驟4：選擇合適的內(nèi)標(biāo)成分，加甲醇混合，配成內(nèi)標(biāo)溶液，將內(nèi)標(biāo)溶液與待測(cè)樣品溶液混合，配成供試品溶液；

25、步驟5：將供試品溶液采用超高效液相色譜進(jìn)行檢測(cè)，得到供試品超高效液相色譜圖；

26、步驟6：將供試品溶液采用超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用進(jìn)行檢測(cè)，得到供試品超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用離子色譜圖、一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜相關(guān)信息；

27、步驟7：在步驟5所得超高效液相色譜圖上選擇一個(gè)與內(nèi)標(biāo)成分色譜峰保留時(shí)間相近的未知色譜峰，通過計(jì)算未知色譜峰與內(nèi)標(biāo)成分色譜峰在超高效液相色譜圖上的相對(duì)保留時(shí)間，推測(cè)其在超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用上的保留時(shí)間，具體計(jì)算公式為tx2＝tr2(tx1/tr1)；(tx1為未知色譜峰在超高效液相色譜圖上的保留時(shí)間，tr1為內(nèi)標(biāo)成分色譜峰在超高效液相色譜圖上的保留時(shí)間，tx2為未知色譜峰在超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用上的保留時(shí)間，tr2為內(nèi)標(biāo)成分色譜峰在超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用上的保留時(shí)間)；

28、步驟8：根據(jù)步驟7所推測(cè)的未知色譜峰保留時(shí)間下的質(zhì)譜圖，進(jìn)一步解析，定性該未知色譜峰所對(duì)應(yīng)的化學(xué)成分；

29、步驟9：重復(fù)步驟7、步驟8可實(shí)現(xiàn)對(duì)超高效液相色譜圖中所有未知色譜峰的定性鑒別；

30、步驟10：根據(jù)定性結(jié)果，選擇相對(duì)應(yīng)的化合物標(biāo)準(zhǔn)品按照步驟2的液相條件進(jìn)樣分析，對(duì)超高效液相色譜圖進(jìn)行對(duì)照品確認(rèn)。

31、優(yōu)選的，在步驟1中，所述提取溶劑為100％的甲醇；炒蒺藜配方顆粒質(zhì)量與所述提取溶劑的料液體積比為1:100，如1g:100ml。

32、優(yōu)選的，在步驟1中，所述超聲提取的功率為160～200w；所述超聲的頻率為59khz；所述提取時(shí)間為30min。

33、優(yōu)選的，在步驟2中，所述超高效液相色譜的檢測(cè)波長(zhǎng)為250nm～340nm，優(yōu)選為340nm；所述超高效液相色譜采用的色譜柱為c18色譜柱(100×2.1mm，1.8μm)，所述超高效液相色譜的流速為0.2ml/min；所述超高效液相色譜的柱溫為25～35℃，優(yōu)選為30℃；所述超高效液相色譜的的進(jìn)樣量為1μl～5μl，優(yōu)選為2μl；所述超高效液相色譜的流動(dòng)相是以乙腈為流動(dòng)相a，0.1％甲酸水為流動(dòng)相b，進(jìn)行梯度洗脫。

34、進(jìn)一步地，所述梯度洗脫程序包括：

35、0～10min，流動(dòng)相a的體積分?jǐn)?shù)由13％～17％變至16％～20％；

36、10～11min，流動(dòng)相a的體積分?jǐn)?shù)由16％～20％變至23％～27％；

37、11～30min，流動(dòng)相a的體積分?jǐn)?shù)由23％～27％變至33％～37％；

38、30～35min，流動(dòng)相a的體積分?jǐn)?shù)由33％～37％變至58％～62％；

39、35～40min，流動(dòng)相a的體積分?jǐn)?shù)由58％～62％變至73％～77％。

40、所述洗脫程序優(yōu)選為：

41、0～10min，流動(dòng)相a的體積分?jǐn)?shù)由15％變至18％；

42、10～11min，流動(dòng)相a的體積分?jǐn)?shù)由18％變至25％；

43、11～30min，流動(dòng)相a的體積分?jǐn)?shù)由25％變至35％；

44、30～35min，流動(dòng)相a的體積分?jǐn)?shù)由35％變至60％；

45、35～40min，流動(dòng)相a的體積分?jǐn)?shù)由60％變至75％。

46、優(yōu)選的，步驟3中，所述色譜評(píng)價(jià)軟件采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012年版)》。

47、優(yōu)選的，在步驟3中，所述共有峰共標(biāo)記了16個(gè)，以9號(hào)峰為參照峰，16個(gè)峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積如下：

48、1號(hào)峰：相對(duì)保留時(shí)間為0.231～0.234，相對(duì)峰面積為0.057～0.066；

49、2號(hào)峰：相對(duì)保留時(shí)間為0.338～0.344，相對(duì)峰面積為0.090～0.104；

50、3號(hào)峰：相對(duì)保留時(shí)間為0.369～0.376，相對(duì)峰面積為0.067～0.077；

51、4號(hào)峰：相對(duì)保留時(shí)間為0.484～0.489，相對(duì)峰面積為0.123～0.146；

52、5號(hào)峰：相對(duì)保留時(shí)間為0.510～0.517，相對(duì)峰面積為0.037～0.049；

53、6號(hào)峰：相對(duì)保留時(shí)間為0.535～0.542，相對(duì)峰面積為0.052～0.062；

54、7號(hào)峰：相對(duì)保留時(shí)間為0.787～0.795，相對(duì)峰面積為0.066～0.080；

55、8號(hào)峰：相對(duì)保留時(shí)間為0.813～0.818，相對(duì)峰面積為0.107～0.124；

56、9號(hào)峰：相對(duì)保留時(shí)間為1.000，相對(duì)峰面積為1.000；

57、10號(hào)峰：相對(duì)保留時(shí)間為1.049～1.052，相對(duì)峰面積為0.067～0.087；

58、11號(hào)峰：相對(duì)保留時(shí)間為1.347～1.350，相對(duì)峰面積為0.063～0.076；

59、12號(hào)峰：相對(duì)保留時(shí)間為1.670～1.674，相對(duì)峰面積為0.063～0.067；

60、13號(hào)峰：相對(duì)保留時(shí)間為1.803～1.808，相對(duì)峰面積為0.095～0.118；

61、14號(hào)峰：相對(duì)保留時(shí)間為1.825～1.832，相對(duì)峰面積為0.057～0.079；

62、15號(hào)峰：相對(duì)保留時(shí)間為2.045～2.053，相對(duì)峰面積為0.014～0.016；

63、16號(hào)峰：相對(duì)保留時(shí)間為2.208～2.215，相對(duì)峰面積為1.427～1.195。

64、優(yōu)選的，16個(gè)共有峰分別為1號(hào)峰為咖啡酸、2號(hào)峰為槲皮素-3-龍膽二糖苷、3號(hào)峰為香蘭素、4號(hào)峰為阿魏酸、5號(hào)峰為蘆丁、6號(hào)峰為金絲桃苷、7號(hào)峰為阿文蒽酰胺e、8號(hào)峰為n-咖啡酰酪胺、9號(hào)峰為蒺藜酰胺、10號(hào)峰為二阿魏酰腐胺、11號(hào)峰為n-[4,5-二羥基-2-[[4-[羥基(苯基)甲基]-5-氧代-3-苯基-2h-呋喃-2-基]氧基]-6-(甲氧基甲基)氧雜-3-基]乙酰胺、12號(hào)峰為芹菜素-7-木糖苷、13號(hào)峰為克羅酰胺、14號(hào)峰為大麻素f、15號(hào)峰為白楊素-5-木糖苷、16號(hào)峰為對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯。

65、優(yōu)選的，在步驟3中，所述相似度比較結(jié)果為各批次供試品指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度均>0.90。

66、進(jìn)一步地，在步驟4中內(nèi)標(biāo)成分為常見的已知中藥化學(xué)成分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，選擇原則為：與待測(cè)樣品中其他成分在超高效液相色譜圖上分離度良好，且在同一色譜條件下有較好的紫外吸收。

67、進(jìn)一步地，步驟5中超高效液相色譜條件和步驟6中超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用中的超高效液相色譜條件應(yīng)與步驟2中色譜條件一致。

68、進(jìn)一步地，在步驟7中所述與內(nèi)標(biāo)成分色譜峰保留時(shí)間相近的未知色譜峰，該保留時(shí)間相近的范圍建議為±5min以內(nèi)；若未知色譜峰的保留時(shí)間在±5min以外，可從步驟8中所解析出的、定性后的色譜峰中選擇與其保留時(shí)間相近的作為內(nèi)標(biāo)成分色譜峰。

69、進(jìn)一步地，在步驟7中，所述內(nèi)標(biāo)成分色譜峰為步驟4中加入供試品溶液中的內(nèi)標(biāo)成分或者步驟8中所解析出的、定性后的化學(xué)成分。

70、優(yōu)選的，在步驟10中，所述化合物標(biāo)準(zhǔn)品為香蘭素、阿魏酸、蘆丁、金絲桃苷、對(duì)甲氧基肉桂酸乙酯，進(jìn)樣分析的濃度分別為6.92μg/ml、2.389μg/ml、1.780μg/ml、2.552μg/ml、117.719μg/ml。

71、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下。

72、1、本發(fā)明優(yōu)化了藥用輔料的種類及其用量，從藥學(xué)上的常用輔料中優(yōu)選出羧甲基纖維素鈉(cmc-na?ph7)、羥丙基甲基纖維素(hpmc?e5)、聚乙烯吡咯烷酮(pvp?k-25、pvp?k-30)這三種，并進(jìn)一步優(yōu)化了各個(gè)藥用輔料的添加量。采用優(yōu)化后的藥用輔料，能避免堵塞制粒機(jī)器，使得制粒過程順暢，顆粒出成率高。

73、2、本發(fā)明提出并制備了蒙藥炒蒺藜配方顆粒，只采用了單一藥用輔料和純凈水，配方簡(jiǎn)單，成本降低，簡(jiǎn)化生產(chǎn)流程的同時(shí)最大程度降低了輔料對(duì)藥材藥效的影響。與傳統(tǒng)炒蒺藜粉相比，休止角下降17.8°～21.3°，流動(dòng)性增加，利于臨床藥品調(diào)劑，可適配現(xiàn)代自動(dòng)配藥機(jī)；引濕率下降4.1％～7.8％，吸濕性下降，穩(wěn)定性增加；適口性得到改善，患者順應(yīng)性提高。實(shí)現(xiàn)了對(duì)蒙藥劑型的改良，解決了蒙藥傳統(tǒng)給藥方式流動(dòng)性差、易吸潮、儲(chǔ)藏條件苛刻、不便服用、不易攜帶等問題，也進(jìn)一步為蒙藥等民族藥開發(fā)做出了貢獻(xiàn)。

74、3、本發(fā)明建立蒙藥炒蒺藜配方顆粒的uplc指紋圖譜測(cè)定方法，優(yōu)化了uplc的檢測(cè)條件，包括流動(dòng)相的組成、檢測(cè)波長(zhǎng)、梯度洗脫程序、柱溫、流速、進(jìn)樣量等參數(shù)。采用優(yōu)化后的方法和參數(shù)，所構(gòu)建的uplc指紋圖譜基線平穩(wěn)、分離度好、精密度高、重復(fù)性好，能夠全面地反應(yīng)蒙藥炒蒺藜的內(nèi)在質(zhì)量，填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)缺少炒蒺藜相關(guān)指紋圖譜構(gòu)建方法的空白，提高了現(xiàn)有的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。此外基于“雙標(biāo)一質(zhì)”技術(shù)，提供了共有峰所對(duì)應(yīng)的完整化合物信息，對(duì)于一些價(jià)格及其昂貴的或市面上無市售及無法獲得的對(duì)照品化合物，也能夠進(jìn)行峰指認(rèn)。相較于傳統(tǒng)的hplc指紋圖譜分析速度更快，所消耗流動(dòng)相溶液更少；相較于完全采用液質(zhì)構(gòu)建指紋圖譜，此方法只需少量幾針液質(zhì)即可，運(yùn)行成本較低，為炒蒺藜的質(zhì)量控制提供更為科學(xué)、合理的依據(jù)。