專利名稱：用于診斷性dna檢測的方法和裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增，再通過電泳分離所得片段以檢測突變?nèi)睋p等可能的基因變體的DNA診斷檢測方法；本發(fā)明更具體地涉及與在變性梯度凝膠中進行雙向電泳分離相結(jié)合的新的和改良的多重PCR技術(shù)。
本發(fā)明具體地涉及檢測患有遺傳疾病的病人中DNA突變的存在，所述遺傳疾病包括出生時即有的缺陷(如囊性纖維化)和成人慢性病(如癌癥)的遺傳傾向。本發(fā)明更具體地涉及通過新的兩步聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增快速制備基因片段，隨后有效并精確地檢查它們中的突變。
背景技術(shù)：
通過DNA診斷檢測可鑒定出具有突變?nèi)睋p的基因(基因變體或等位基因)。基因變體可由父母遺傳給孩子，一些基因變體的作用很強，它們獨自作用即可導(dǎo)致疾病，例如導(dǎo)致囊性纖維化的囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)性調(diào)節(jié)物(CFTR)基因的多種突變體。其他基因變體與其他基因座的基因變體聯(lián)合作用，例如許多常見(多基因)病，如心臟病和癌癥。可以在早期，即從胚胎細胞中檢測(出生前檢測)基因缺損，也可以在晚期檢測幼兒，成人或老年人細胞中的基因缺損。
通過DNA診斷檢測，可以得到疾病的有關(guān)信息，有時在疾病發(fā)生前即可得到該病的信息，這大大便利了對疾病的處理，如預(yù)防、治療。例如可以檢測癌癥或傳染性病因中特殊基因變體的存在以預(yù)測例如疾病的進程，對治療的反應(yīng)。也可以檢測個體攜帶特殊基因變體的情況，他們不愿意眼睜睜地讓這些基因變體傳遞給他們的后代(攜帶者檢測)。最后，還可以在任何時候(從出生前至晚年)檢測個體患遺傳性基因編碼的疾病的傾向。該適用譜的一端的例子是囊性纖維化，對它而言，出生前檢測和攜帶者篩選已經(jīng)相對常見，該譜的另一端涉及后期爆發(fā)的疾病，如癌癥和神經(jīng)變性病。
DNA診斷檢測包括分析個體基因的序列完整性。目前，該項工作花費大，因為精確的檢測需要進行勞動強度大的對基因的測序或解碼。迄今為止，還沒有經(jīng)濟實惠普遍適用的DNA診斷標(biāo)準化系統(tǒng)可供使用(參見Cotton，1993，突變檢測的現(xiàn)有方法，Mutat.Res.285125-144)。為了經(jīng)濟實惠又能被廣泛接受，DNA診斷系統(tǒng)必須是準確的(超過95％)，具有高的生產(chǎn)率，而且勞動強度要低。
分析技術(shù)的一般背景首先有必要簡單回顧涉及PCR擴增和電泳分離片段的一般技術(shù)，本技術(shù)領(lǐng)域已經(jīng)使用過并正在使用該技術(shù)。
首先用化學(xué)和物理的方法處理如來自血液的細胞樣品以提取僅占細胞基因組總DNA材料百分之二的攜帶基因的DNA鏈，其余的DNA材料將背景占滿。當(dāng)每個細胞具有兩拷貝每種基因時(這一點可通過構(gòu)件或堿基對來鑒定，所述構(gòu)件或堿基對由字母A、C、G和T作為字母密碼的序列來辨認)，它們構(gòu)成了DNA長鏈如此小的一部分以致于必須通過制備多拷貝的基因擴增之以使它們被檢測出。通過熱分離或變性DNA鏈對，與適當(dāng)?shù)囊锘旌弦耘c欲研究的基因片段(如基因外顯子或編碼區(qū))的始端和末端結(jié)合或退火(下文將更詳細地討論)并加入足夠的構(gòu)件以產(chǎn)生基因外顯子的拷貝可完成基因擴增。連續(xù)重復(fù)此循環(huán)步驟產(chǎn)生漸增拷貝的外顯子以得到純化和擴增的數(shù)量，此方法通常指的是前述的聚合酶鏈反應(yīng)或PCR擴增，它更詳細地闡述于例如分子病理學(xué)，Hein and Silvenman，Carolia學(xué)術(shù)出版社，1994，第2章，分子技術(shù)及其在臨床實驗室中的自動化，5-31頁(Winn-Deen)。
在此階段，然后是檢查或分析基因外顯子以測定與正常狀態(tài)相比是否有突變，一般優(yōu)選以大小和堿基對序列為基礎(chǔ)，通過電泳分離DNA純化片段可做到這一點，更詳細的描述見共同申請人Vijg和A.G.Uitterlinden的雙向DNA分型基因組分析的平行方法，EllisHorwood，1994，尤其是p33-40。
電泳不僅已用于DNA片段的分離，還可用于分離除基因外的其他物質(zhì)，如Electrophoresis 1993，14，1091-1198中描述的蛋白質(zhì)分析。通過帶熒光染料標(biāo)記的電泳進行單向DNA分離的機器已有提供，如Perkin Elmer的ABI Prism 377 DNA測序儀；雙向DNA分型(typing)的機器也有提供，如共同申請人Vijg和E.Mullaart等人在Nature，365，1993年9月30日中所述通過雙向DNA分型平行分析基因組，p469-471，描述了荷蘭的Ingeny B.V.的裝置。將電場的第一維(稱為水平向)施加到其中已引入純化的DNA片段的適當(dāng)凝膠基質(zhì)(下文將討論)中，通過大小的不同(較大顆粒移動得比較小顆粒要慢)可導(dǎo)致片段的分離。通過在具有化學(xué)梯度(如在凝膠中設(shè)置連續(xù)的越來越濃的脲/甲酰胺)或沿膠設(shè)置的溫度梯度的垂直方向(豎向)施加電場，DNA片段將遷移(此次為豎直方向)，直至它們在特定的垂直序列所決定的位置處解鏈并被阻留在凝膠基質(zhì)中的某處。為了防止整個DNA片段的解鏈，需讓它附著(電泳前)大量的G和C，G和C與A、T相比對解鏈的抗性更大。所謂的GC-加強(clamping)在完全由片段外顯子一部分之序列決定的位置處有效地阻留了每個片段。如果此序列僅在一個位置發(fā)生改變，例如AT對代替了GC對，解鏈將會延遲或提前，因此與正常的參照片段相比，被阻留至不同的垂直位置。
這種雙向基因掃描(TDGS)有望成為經(jīng)濟實惠而又能被廣泛接受的DNA診斷系統(tǒng)。在此系統(tǒng)中，如上所述，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增從給定DNA樣品中得到的大量DNA片段基于大小和堿基對序列被電泳分離。此系統(tǒng)高度精確(即99％)，因為第二向分離是以變性的梯度凝膠電泳(DGGE)為基礎(chǔ)的。實際上，DGGE是唯一的具有如此高精確度的系統(tǒng)(Sheffield et al.，1993，用于檢測單堿基取代的單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析的靈敏度，Genomics 16，325-332；Grompe，1993，核酸中未知突變的快速檢測，Nature Genet.5，111-117；Guldberg et al.，1993，在丹麥對苯丙酮尿癥的分子學(xué)分析99％的突變被變性梯度凝膠電泳檢出，Genomics 17，141-146)。用于TDGS的自動化儀器在某種程度上是可以使用的，在某種程度上還有待開發(fā)。TDGS能夠同時檢測得自一個或多個基因的DNA片段中所有可能的突變，其生產(chǎn)率高，人為干擾最低。
在DNA診斷中廣泛使用TDGS的一個主要障礙是在同一反應(yīng)試管中通過PCR(多重PCR)同時擴增許多片段的困難。實際上，經(jīng)常甚至不可能同時滿足PCR和變性梯度凝膠電泳的需求，即最適的PCR反應(yīng)和擴增片段最適的解鏈行為。最新的方法開始于通過PCR擴增靶DNA區(qū)，通常是基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)(外顯子)。這些擴增反應(yīng)是分開進行的，例如，如果需分析基因中27個外顯子，則需進行27個獨立的PCR反應(yīng)。在實際操作中，通常可以在一個試管中進行幾個PCR反應(yīng)(例見Edwards and Gibbs，1994，多重PCR優(yōu)點、發(fā)展及應(yīng)用，PCR Methods and Applications 3，565-575)。
顯然，在大量個體需被檢測的情況下，以及當(dāng)在相同的TDGS試驗中需同時檢測一個以上基因時，移液步驟和需進行的單個反應(yīng)的總數(shù)會很高。這增加了試驗的勞動強度，也使工作更復(fù)雜，人為出錯的機會升高。實際上，鑒于這種復(fù)雜性，甚至在所有移液步驟都可以自動進行的完全自動化的實驗室中也解決不了這一難題。
不能在同一試管中的同一反應(yīng)條件下同時PCR擴增多個片段這一難題是TDGS滿足臨床檢測標(biāo)準(即對實驗者友好)的重大技術(shù)障礙。通過多重PCR，即通過使用多套引物在一個反應(yīng)中進行幾個PCR擴增以減少PCR反應(yīng)的數(shù)目是非同尋常的進步。
目前的多重PCR法有時簡單到混合其反應(yīng)條件已分別被確定的幾套引物。然而，大多情況下，應(yīng)仔細考慮欲擴增的區(qū)域，片段的相對大小，引物的動力學(xué)和PCR實驗條件的最佳化來開發(fā)多重PCR以適應(yīng)多種片段。
主要的難題是引物的定位，為了基因診斷，人們一般的目的是擴增外顯子序列，剪接位點和調(diào)節(jié)區(qū)。外顯子擴增PCR反應(yīng)的引物理想的是被置于與外顯子相鄰的內(nèi)含子序列中。這提供了一些調(diào)節(jié)片段長度或擴增質(zhì)量以及受突變影響的剪接位點的有關(guān)信息的限制，這些是選擇引物的首要限制。
其次，引物的定位必須使除靶序列外的其他位點處非特異性擴增不會發(fā)生。實際上，人類基因組為3×109個堿基對長，這給靶序列和其他非靶序列之間偶然發(fā)生的序列同源性提供了充足的機會。這對多重PCR而言不是一典型的難題，但是當(dāng)人們希望一次僅擴增一個片段時也會出現(xiàn)這一難題。這是選擇引物的第二個限制。
為了進行多重PCR，應(yīng)選擇引物以使其預(yù)測的雜交動力學(xué)與多重反應(yīng)中其他引物的相類似，這是選擇引物的第三個限制。以總基因組DNA作為模板選擇引物的這些限制是為何多重組通常較小(典型地少于5個片段)的原因。
為了在TDGS中最好地分離，選擇引物有第四個難以克服的限制。TDGS需要平均為100-600bp的DNA片段，兩個引物中的一個應(yīng)與富含GC的片段偶聯(lián)以提供GC夾(GC-clamp)作為欲通過PCR產(chǎn)生的片段中最高的解鏈區(qū)，這對于確保在第二(變性梯度)向凝膠中檢測突變的最高敏感性是必需的(Myers et al.，1985，在與GC夾結(jié)合的DNA片段中幾乎所有的單堿基取代均可被變性梯度凝膠電泳檢出，Nucl.Acids Res.13，3131-3145；Myers，et al.，1987，通過變性梯度凝膠電泳檢測和定位單堿基變化，Meth.Enzymol.，155，501-527)。然后，引物應(yīng)按下述方法定位，即靶片段僅含有一個這樣的單一功能區(qū)，它與其上結(jié)合有GC夾時相比，解鏈較早(在較低的脲、甲酰胺濃度或溫度下)，這證明對于PCR(不只是多重的)和最適解鏈曲線都最適合的PCR條件是難以(如果不是不可能的話)實現(xiàn)的(如將Blanquet等人，1993，通過變性梯度凝膠電泳鑒別RBl基因中的種系突變，Hum.Molec.Genet.2，975-979所述的RB DGGE設(shè)計與本發(fā)明的設(shè)計相比較)。
本發(fā)明涉及將所謂長-PCR與短-PCR相聯(lián)合。最近，PCR擴增法的發(fā)展已允許擴增來自基因組DNA的大片段(高至40kb)。我們已經(jīng)利用了這一進展，通過使用長-PCR以盡可能最少數(shù)目的片段起始擴增靶基因的所有編碼區(qū)。然后我們使用這些長的擴增子作為模板以多重形式PCR擴增TDGS所需的小片段。借此，首先從混雜的基因組DNA中擴增出靶序列，它允許在同一條件下從該預(yù)純化的模板得到小的PCR片段。
使用上述方法，僅以PCR擴增子的最適解鏈行為為基礎(chǔ)選擇引物套，也顯示了PCR的最適行為，甚至允許廣泛的多重PCR。此現(xiàn)象可部分歸于經(jīng)長-PCR的預(yù)純化，實際上，相對于其他基因組DNA序列而言，長-PCR大大增加了靶序列的量，從而大大降低了反應(yīng)的復(fù)雜性并增加了它的特異性。
盡管上述現(xiàn)象可以由通過制備純化的模板可降低復(fù)雜性來解釋，但仍未得到精確的解釋。實際上，作用的絕對值是驚人的，迫使我們重新評價PCR最優(yōu)化所涉及的因子。然而有一件事是清楚的，僅通過本發(fā)明就使得能設(shè)計和進行有效的TDGS試驗，因為現(xiàn)在可以僅以解鏈曲線為基礎(chǔ)選擇引物，多重PCR十分的便利。
本發(fā)明也是通用的，實際上，在每一個以PCR為基礎(chǔ)的診斷反應(yīng)中選擇引物是一項重要的問題，很多潛在的引物位點最終的結(jié)果卻很差，而多重PCR又會帶來另外的問題，這就是它不能被廣泛使用的原因。長-PCR/短-PCR兩步擴增系統(tǒng)提供一直接而簡單的解決問題的方法。
發(fā)明目的因此，本發(fā)明的一個目的是提供克服了上述困難的用于診斷性DNA檢測的新的改良的方法和裝置。
另一個目的是提供通過兩步多重聚合酶鏈反應(yīng)擴增檢測基因突變的新方法，所述擴增使用長和短的多重PCR，接著以大小和堿基對序列為基礎(chǔ)進行片段的雙向電泳分離。
其他目的將在下文解釋，并聯(lián)系所附權(quán)利要求被指出。
附圖簡述以下將參照附圖描述本發(fā)明，其中

圖1闡明了進行本發(fā)明方法步驟的順序。
圖2表示帶和不帶GC夾的RB外顯子12(即成視網(wǎng)膜細胞瘤基因)的解鏈曲線。
圖3顯示了腫瘤抑制基因RB的圖譜，示出長和短-PCR反應(yīng)的PCR引物位置。
圖4是2-D凝膠電泳模式中短-PCR片段預(yù)測位置的計算機圖。
圖5顯示出與理論預(yù)測模式一致的實際凝膠分離模式。
圖6表示以外顯子18-23的長-PCR產(chǎn)物為模板，得到所有6個短的PCR片段(泳道7-12)，而以總基因組DNA為模板，大多數(shù)產(chǎn)物丟失了(泳道1-6)，還顯示出僅5ng總基因組DNA就足以作為長-PCR的起始物質(zhì)(泳道13)，并且用長-PCR產(chǎn)物作為模板得到所有短的PCR產(chǎn)物(泳道20-24)。
圖7表示野生型(純合正常)片段和幾個雜合突變體的詳細情況。
發(fā)明概述簡單地說，在重要的一方面，本發(fā)明包含分析來自DNA的預(yù)定基因外顯子的方法，該方法包括，作為第一步和相對較長的多重聚合酶鏈反應(yīng)，加入針對連續(xù)的基因外顯子組的引物對，接著在一共用試管中完成聚合酶鏈反應(yīng)擴增；作為第二步和短的多重聚合酶鏈反應(yīng)，進一步加入針對每種基因外顯子的引物對，在所述共用試管中完成聚合酶鏈反應(yīng)擴增；電泳分離基因片段。
下面將描述優(yōu)選的和最好的技術(shù)模式。
優(yōu)選實施方案的描述如上文所提及，本發(fā)明涉及以最低數(shù)目的兩步多重PCR反應(yīng)與片段的自動雙向分離的聯(lián)合為基礎(chǔ)，設(shè)計精確而有效的突變檢測試驗以同時檢測基因中所有可能的突變。
表1列出了以RB(成視網(wǎng)膜細胞瘤)腫瘤抑制基因作為模型設(shè)計的TDGS試驗的不同步驟。首先，從數(shù)據(jù)庫(如Genbank)中獲取基因序列，靶區(qū)域(即外顯子、剪接位點，調(diào)節(jié)區(qū))是確定的。然后定位引物以得到作為盡可能最少數(shù)目的仍可以通過長-PCR(即高至至少20kb)(TakaRa LA PCR試劑盒，Product Insert)擴增之片段的所用靶區(qū)域。選擇長-PCR引物序列的一些一般性指南已有描述(Foord and Rose，1994，長距離PCR，PCR方法和應(yīng)用3，S149-S161)，但憑經(jīng)驗確定最理想的引物仍有必要。
表1 TDGS試驗的設(shè)計1、從數(shù)據(jù)庫中獲取序列。
2、定位長-PCR的引物以用最少數(shù)目的擴增子覆蓋所有想要的區(qū)域(如編碼序列，剪接位點，調(diào)節(jié)區(qū)，突變熱點)。
3、根據(jù)下列標(biāo)準定位短-PCR的引物；a、所希望的靶序列應(yīng)該被100-600bp的擴增子覆蓋b、擴增子應(yīng)該具有最理想的解鏈行為，即由一個最低解鏈區(qū)加上與引物之一結(jié)合的GC夾組成c、擴增子在2-D凝膠中最理想地分布d、類似的反應(yīng)動力學(xué)
4、以長-PCR產(chǎn)物作為模板，為每套引物單獨建立PCR條件5、通過將引物套分組并調(diào)節(jié)反應(yīng)成分來開發(fā)多重共擴增條件如表1第3項所列，然后使用長-PCR片段作為模板，選擇短-PCR的引物以產(chǎn)生100-600bp的片段。此處主要選擇標(biāo)準必需是片段的解鏈行為，在理想狀態(tài)下，每個擴增子應(yīng)僅含有一個解鏈區(qū)，它應(yīng)該比與之結(jié)合的GC夾低(較不穩(wěn)定)。通過使GC夾成為引物之一的一部分可完成30-40bp的GC-夾的引入(Sheffield etal.，1989，用于檢測單堿基取代的單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析的靈敏度，Genomics 16，325-332)。通過使用計算機程序可確定每個候選靶序列的最理想的解鏈行為(例如MELT 87；Lerman and Silverstein，1987，DNA解鏈的計算機模擬及其在變性梯度凝膠電泳中的應(yīng)用，Meth.Enzymol.155，482-501)。通過GC-加強具有最優(yōu)化解鏈行為的擴增子例子示于圖2，它是有關(guān)RB的外顯子12的。
一般而言，引物集合的選擇是允許針對大小和DGGE方面在2-D凝膠中都有最理想的分布。由于2-D凝膠的高分辨率(5-10bp大小的差異很容易辨認)，一般做到這一點不太難。實際上，50個或更少片段的點分布幾乎不是問題，根據(jù)它們的解鏈行為可簡單地選擇引物。
圖3示出為RB基因選擇的擴增子集合，以及用作模板的長-PCR片段。所有短-PCR片段加在一起代表90％以上的RB編碼區(qū)。
圖4和5示出被圖3所示擴增子覆蓋的RB基因的24個外顯子在理論上和經(jīng)驗上的點分布。盡管有差異，最明顯的是表示外顯子11的點，我們的結(jié)論是整個解鏈程序精確地預(yù)示出點的位置。
沒有第一個長-PCR步驟，最理想的解鏈標(biāo)準通常會與以總基因組DNA作為模板的PCR所用的其他引物設(shè)計標(biāo)準相沖突，認識到這一點很重要。實際上，對于RB基因而言，發(fā)現(xiàn)不可能選擇到對于在DGGE中最理想的分離和在PCR中最適宜的引發(fā)都適合的條件。由長-PCR代表的預(yù)純化步驟對于TDGS最優(yōu)化PCR引物套的設(shè)計顯然是絕對重要的。
當(dāng)確立了試驗形式后，以多重形式進行兩步PCR擴增，設(shè)計和進行多重PCR反應(yīng)的可能性代表了本發(fā)明的核心。圖6所示結(jié)果闡明了第一步，即長-PCR步驟對于成功的多重PCR的必要性。圖6中左邊6個泳道含有使用不同量的總基因組DNA作模板，對RB基因的外顯子18-23(6個片段)進行多重PCR之后得到的PCR產(chǎn)物。顯然，基本上沒有得到所需長度的產(chǎn)物，后者與使用相同多重PCR反應(yīng)產(chǎn)物，但此次是以長-PCR產(chǎn)物作為模板的泳道7-12形成對照。以不同的循環(huán)進行長-PCR，顯然僅需要5-10個循環(huán)即可為成功的多重PCR產(chǎn)生足夠的模板。
泳道13至19含有以長-PCR產(chǎn)物作為模板，將不同量的起始物質(zhì)，即不同量的總基因組DNA用于長-PCR反應(yīng)得到的多重短-PCR產(chǎn)物。令人感興趣的是5ng總基因組DNA即足以得到所有產(chǎn)物。由于臨床材料有時不能獲得足夠的量(如乳腺癌針活檢)，這一結(jié)果就很重要，表示很少量的DNA也可以進行成功的試驗。
最后，圖6的泳道20-24含有與6套長-PCR相對應(yīng)的5個多重PCR的產(chǎn)物(長-PCR組1和6合并；也見圖3和下文將討論的表2)。進一步調(diào)整PCR條件和/或引物會得到此基因更小數(shù)目的多重套。實際上，沒有理由在僅單個PCR反應(yīng)中不能擴增完整的RB基因編碼區(qū)。在第二個PCR之后，將片段進行一輪完全的變性/復(fù)性循環(huán)以促進異源雙鏈的形成。表2列出了對RB而言的TDGS引物對；外顯子數(shù)目列于表格最左邊，長PCR引物密碼是針對6個外顯子組(0至24-27)，短PCR引物是針對單個27個外顯子的。
PCR過后，使片段混合物在變性梯度凝膠中進行2-D電泳(圖1)，使用自動化儀器會大大簡化這一步驟。這里所用的儀器可允許10塊凝膠同時跑，而不需人工于預(yù)(即切下泳道并將之上樣于第二塊凝膠)，使用手工操作的儀器進行涉及實驗條件最優(yōu)化的所有實驗。2-D電泳后，將凝膠從玻璃板之間取下，用溴化乙錠或任何其他染料染色。
表2用于RB TDGS的引物對RB長-PCR外顯子引物5’-3’ 大小0-2 TGTCAGGCCTGCCTGACAGACTTCTATTCAGCA 4.5kbATGTTAGCAGAGGTAAATTTCCTCTGGGTAATGG3-6 GCAGTCATTTCCCAACACCTCCCCTCTGT 9kbAAGCCAAGCAGAGAATGAGGGAGGAGTACATTAC7-11 TCAGCAGTTTCTCCCTCCAAGTCAGAGAGGC10kbGAGACCAGAAGGAGCAAGATCAGGTAGTAG12-17ACCATTCCCCCTACTCTCCATGGTCCATG 12.4kbCTCACAGGAAAAATACACAGTATCCTGTTTGTGTGGC18-23CCAGCCTTGCATTCTGGGGATGAAGC14kbAGTCGTAAATAGATTTTCTTCACCCCGCCCCRB短-PCR外顯子引物5’-3’ 大小 Tm(％UF) 多重套2[GC1]TTGATTTATAAGTATATGCCA229bp30 ECAAAACGTTTTAAGAAAATCC3[GC1]CCAGTGTGTGAATTATTTAA 239bp27 ACCTTTTATGGCAGAGGCTTATA4[GC1]GAATTGAAATATCTATGATT 270bp 24 AATCAGAGTGTAACCCTAATA5[GC1]TACTATGACTTCTAAATTACG157bp 27 AGTGAAAAATAACATTCTGTG6TGGAAAACTTTCTTTCAGTG 237bp 17 A[GC1]GAATTTAGTCCAAAGGAATGC7[GC1]CCTGCGATTTTCTCTCATAC 257bp 26 BGCAACTGCTGAATGAGAAAG8GTTCTTATCTAATTTACCACT 229bp 27 B[GC1]TTTTAAAGAAATCATGAAGTT9[GC1]AGTCAAGAGATTAGATTTTG 227bp 20 BATCCTCCCTCCACAGTC10 [GC1]GACATGTAAAGGATAATTGT 222bp 21 BGCAAATCAATCAAATATACC11 AGTATGTGAATGACTTCACT 174bp 21 B[GC1]TATAATATAATTAAAAGTAGG12 CTCCCTTCATTGCTTAACAC 211bp 24 C[GC1]TTTCTTTGCCAAGATATTAC13 [GC1]GATTACACAGTATCCTCGAC 224bp 34 CGCAGTACCACGAATTACAATG14 [GC1]GTGATTTTCTAAAATAGCAGG179bp 35 CACCGCGCCCGGCTGAAAT17 [GC1]TTCTTTGTCTGATAATAAC 380bp 26 CCTCTCACTAACAATAATTTGTT18 [GC1]GACTTTTAAATTGCCACTGT 393bp 33 DATTCCCTACAGTTTCTTTAT19 [GC1]CAACTTGAAATGAAGAC248bp 34 DCGTCCCGCTGCTCTTGAAAATAATCATC20 [GC1]AAAATGACTAATTTTTCTTATTCCC227bp 44 DAGGAGAGAAGGTGAAGTGC21 [GC2]CATTCTGACTACTTTTACATC201bp 28 DCGGGCTTACTATGGAAAATTAC22 [GC3]CTTTTTACTGTTCTTCC 194bp 33DCCAATCAAAGGATACTTTTG23 [GC1]TCTAATGTAATGGGTCCACC 281bp 38DCCCTACTTCCCTAAAGAGAAAAC24 CGGAATGATGTATTTATGCTCA 195bp 22E[GC1]TTCTTTTATACTTACAATGC25 [GC1]ATGATTTAAAGTAAAGAATTCT 245bp 38ECATCTCAGCTACTGGAAAAC26 [GC1]TCCATTTATAAATACACATG 161bp 32EATTTCGTTTACACAAGGTG27 [GC1]TACCCAGTACCATCAATGC191bp 43ETCCAGAGGTGTACACAGTGGC夾GC1CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCC(30聚體)GC2CGCCCCGCGCCGCCGCCCCGCCCCCGCCCGTCCCGCCC(38聚體)GC3CGCCCCGCCGCGCCCCGCGCGCCCGGTCCCCGCGC(35聚體)記錄并評價(通過肉眼和圖象分析)所得模式中突變的存在。在所用條件下，即GC-加強和異源雙鏈化，雜合突變形成4個點2個同源雙鏈變體和2個異源雙鏈變體(圖7中闡明的)，后者并不總能被分離。由于突變也可在純合狀態(tài)下發(fā)生，因而在PCR之前有必要將每種樣品與對照樣品混合以確信異源雙鏈分子會存在。
下文提供了詳細的方法，其中本發(fā)明的實施方案得以實施和使用以在DNA診斷檢測中精確而有效地制備和檢查基因片段。針對舉例性或模型基因(即前文討論過的腫瘤抑制基因RB)的這一描述不構(gòu)成對本發(fā)明的特殊限制。將相同的方法用于其他基因和/或在同一個試管中混合更多的PCR片段屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的范圍，它被認為屬于本發(fā)明的保護范圍。
A.RB兩步PCRTDGS試驗的設(shè)計序列的獲得從數(shù)據(jù)庫(即Genbank)中獲取RB基因的序列，靶區(qū)域(即外顯子，剪接位點，調(diào)節(jié)區(qū))是確定的。
用于多重長-PCR的引物的選擇以用最可能少數(shù)目的仍可通過長-PCR擴增的片段覆蓋整個靶區(qū)域的方式定位長-PCR的引物對。選擇長-PCR引物還應(yīng)使多重長-PCR有最高的特異性，最適的退火溫度和最低限度的自身互補作用，例如通過使用引物設(shè)計軟件而選擇?？紤]到引物充足的定位空間，設(shè)計多重長-PCR相對容易。
用于多重短-PCR的引物的選擇 以下述標(biāo)準為基礎(chǔ)選擇短-PCR的引物對。
a.所需的靶序列應(yīng)被100至600bp的擴增子覆蓋b.擴增子應(yīng)具有最理想的解鏈行為，即由一個最低解鏈區(qū)外加與引物之一結(jié)合的GC-夾組成c.在2-D凝膠中擴增子最理想的分布d.類似的反應(yīng)動力學(xué)如果用于總基因組DNA，上述標(biāo)準b經(jīng)常與標(biāo)準的引物設(shè)計標(biāo)準相沖突。實際上，經(jīng)證實本發(fā)明對于設(shè)計和完成作為檢測RB基因中突變的快速、精確和實用的工具的TDGS而言是必需的，也是足夠的。
以不同多重反應(yīng)中引物的行為為基礎(chǔ)，憑經(jīng)驗選擇多重組，根據(jù)長-PCR制定RB的多重組，即以一個長-PCR片段為模板的所有短-PCR作為一個多重組一起擴增。實際上將兩個長-PCR組聯(lián)合作為一個多重組，所有短-PCR片段也可一起擴增。如上文所解釋，表2列出了長和短PCR所用的引物對，片段大小，退火溫度，解鏈溫度和5個不同的多重組。
B.PCR反應(yīng)和異源雙鏈化可從多種來源得到引物(去保護并去鹽的)。我們的引物得自Gibco BRL。為了長期貯存，例如應(yīng)在-20℃下將引物以在超純水中的100μM貯存溶液保存，短期使用的話，在-20℃下將引物作為超純化水中的12.5μM溶液保存。
在帶有加熱蓋的Gene E熱循環(huán)儀(Techne，Cambridge，UK)的熱孔(thermowell)試管(Costar，Cambridge，MA.)中進行PCR反應(yīng)，不必在樣品上覆蓋油。使用LAPCR試劑盒(TaKaRa)，在100μl體積中以5-500ng基因組DNA作為模板，每種引物為0.2μM進行多重長PCR反應(yīng)(6個片段)，根據(jù)廠商的說明進行PCR反應(yīng)，條件如下所示。首先，94℃，1分鐘一個循環(huán)，接著98℃，20秒/68℃，12分鐘30個循環(huán)(每次循環(huán)漸增10秒)，最后72℃，12分鐘一個循環(huán)。PCR產(chǎn)物貯存于-20℃下供進一步使用。
使用相同的Gene E熱循環(huán)儀，于50μl體積中，以2μl長-PCR產(chǎn)物，0.2-0.5μM每種引物，0.25mM dNTP，2.5-4.5mMMgCl2，3單位Taq聚合酶(Gibco BRL或Promega)進行短PCR反應(yīng)。PCR條件如下述。94℃，2分鐘一個循環(huán)，然后94℃，40秒/41℃，40秒/69℃，2分鐘(每次循環(huán)漸增2秒)30個循環(huán)，最后72℃，10分鐘一個循環(huán)。
短PCR之后，通過一個完全的變性/復(fù)性循環(huán)使片段異源雙鏈化。即98℃，100分鐘/55℃，30分鐘/41℃，30分鐘。
PCR和異源雙鏈化之后，混合試管中的內(nèi)含物，加入1/10體積的加樣緩沖液。根據(jù)溴化乙錠染色，通常有足夠跑幾次電泳的樣品，當(dāng)總體積對狹線而言太大時，需用乙醇沉淀樣品(加入加樣緩沖液之前)并重新溶解到小體積中。
C.雙向電泳手工操作的和自動化的2-D電泳儀器均來自前述的Ingeny B.V.(Leiden，荷蘭)。對于手工操作的電泳而言，首先使用0.75mm厚的9％ PAA凝膠在45℃電泳5-6小時以按大小分離DNA片段的混合物，通過溴化乙錠染色10分鐘并用紫外線透照凝膠(凝膠置于玻璃板上以防止DNA片段被紫外光損壞)可用肉眼看到分離的模式?？焖偾邢掠镜乐胁?不包括邊緣)100-600bp的區(qū)域，加到1mm厚的含0-60％(RB)或30-90％(p53)脲/甲酰胺(UF)梯度的9％ PAA凝膠中。使用簡單的梯度形成儀(Gibco BRL)傾倒梯度，在60℃，200V下電泳7.5-11小時。電泳后用0.5μg/ml溴化乙錠染凝膠15-20分鐘并在水中脫色15分鐘，使用寶麗來照相機在紫外光照射下記錄電泳模式。
對于自動化的2-D電泳而言，根據(jù)廠商說明(Ingeny B.V.，Leiden，荷蘭)用自動化2-D電泳儀所附帶的凝膠澆鑄裝置一次傾倒10塊凝膠。凝聚之后，從凝膠澆鑄箱中取出凝膠(在玻璃板之間)并用濕吸水紙清潔，然后根據(jù)廠商說明置于儀器中，即置于兩個用硅氧烷封住邊緣的支持凝膠的盒中。含有加熱后45℃的緩沖液的儀器被置于電源開關(guān)關(guān)閉的l-D模式下。加入加樣緩沖液之后，將樣品(至多40μl)上樣于自動化2-D電泳儀中的凝膠的V-形孔中。使用帶有0-60％脲/甲酰胺梯度的9％丙烯酰胺，0.25％ TAE凝膠。第一向在45℃，180V下電泳4小時，第二向在60℃，200V下電泳7.5-11小時。電泳后用溴化乙錠將凝膠染色，與手工操作的儀器所描述的一樣，在紫外光照射下記錄電泳模式。
總之，盡管本發(fā)明描述的是后接雙向電泳分離的兩步(長和短)多重聚合酶鏈反應(yīng)擴增，但它可與單向電泳或需要PCR-擴增之靶序列的檢測突變的其他方法聯(lián)合應(yīng)用。
本領(lǐng)域技術(shù)人員會對本發(fā)明進行進一步修改，這種修改也被認為在本發(fā)明附加權(quán)利要求所限定的精神和范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種分析來自DNA的預(yù)定基因外顯子的方法，包括，作為第一步和相對較長的多重聚合酶鏈反應(yīng)，加入針對連續(xù)的基因外顯子組的引物對，接著在一共用試管中完成聚合酶鏈反應(yīng)擴增；作為第二步和短的多重聚合酶鏈反應(yīng)，進一步加入針對每種基因外顯子的引物對，在所述共用試管中完成聚合酶鏈反應(yīng)擴增；電泳分離基因片段。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中沿一個方向以大小為基礎(chǔ)電泳分離基因片段。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其中基因片段沿垂直方向和沿溫度或化學(xué)變性梯度進行進一步的堿基對序列電泳分離以沿垂直方向?qū)⒒蚱畏植荚诟魈囟ǖ男蛄形恢锰?；將這些位置與正?；蚱蔚奈恢孟啾容^以檢測基因突變。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其中引物是用熒光染料標(biāo)記的寡核苷酸引物。
5.權(quán)利要求3所述的方法，其中聚合酶鏈反應(yīng)中所用的核苷酸構(gòu)件是經(jīng)熒光標(biāo)記過的。
6.權(quán)利要求3所述的方法，其中電泳分離在變性梯度凝膠中完成。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其中在凝膠中使用脲和甲酰胺梯度以分離片段。
8.權(quán)利要求6所述的方法，其中在凝膠中使用溫度梯度以分離片段。
9.權(quán)利要求3所述的方法，其中對于成視網(wǎng)膜細胞瘤基因而言，長-PCR基因外顯子組是外顯子1-2，3-6，7-11，12-17，18-23和24-27。
10.一種分析來自DNA的預(yù)定基因外顯子的方法，包括，作為第一步和相對較長的多重聚合酶鏈反應(yīng)，加入針對連續(xù)的基因外顯子組的引物對，接著在一共用試管中完成聚合酶鏈反應(yīng)擴增；作為第二步和短的多重聚合酶鏈反應(yīng)，進一步加入針對每種基因外顯子的引物對，在所述共用試管中完成聚合酶鏈反應(yīng)擴增。
全文摘要
檢測基因中突變的測定法,包括兩步多重聚合酶鏈反應(yīng)擴增,然后以大小和堿基對序列這兩者為基礎(chǔ),優(yōu)選進行片段的雙向電泳分離。
文檔編號G01N27/447GK1198188SQ96194610
公開日1998年11月4日 申請日期1996年6月3日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月6日
發(fā)明者揚·維吉, 李代宗 申請人:揚·維吉, 李代宗